金雀異黃素緩解免疫抑制大鼠運(yùn)動(dòng)性疲勞的作用研究

董佳萍， 楊 琪， 謝琳琳， 王鶴霖， 劉殊凡， 遲曉星

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶 163319)

運(yùn)動(dòng)性疲勞是人體腦力和體力持續(xù)活動(dòng)到一定階段時(shí)出現(xiàn)的一種生理現(xiàn)象，表現(xiàn)為機(jī)體生理過程不能維續(xù)其機(jī)能在特定水平上和(或)不能維持預(yù)定的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度[1]。機(jī)體的疲勞與免疫能力互相影響。免疫力低下時(shí)常伴隨會(huì)疲勞感，而長時(shí)間的疲勞也同樣容易引起機(jī)體的免疫力降低。因此，研究如何降低身體的疲勞感，確保人們能正常工作和健康生活變得至關(guān)重要。

金雀異黃素(Genistein)，又稱為染料木素或染料木黃酮，是大豆異黃酮的主要成分，約占大豆中總異黃酮的60%[2]。金雀異黃素是植物雌激素中活性較強(qiáng)的一種，研究表明其具有抗氧化性、抗炎活性、抗腫瘤、保護(hù)骨骼肌等功效[3-7]。

目前對于金雀異黃素的抗疲勞與提高免疫力分別有所研究。麻海娟等[8]研究發(fā)現(xiàn)，金雀異黃素可顯著上調(diào)大鼠脾、胸腺、腎和腦的臟器指數(shù)，同時(shí)明顯提高血清中的NO和NOS含量。蒙蘭蘭等[9]研究發(fā)現(xiàn)，金雀異黃素可升高運(yùn)動(dòng)性疲勞大鼠全血中紅細(xì)胞、白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù),升高血紅蛋白濃度。均說明金雀異黃素具有緩解大鼠運(yùn)動(dòng)性疲勞的作用。陳曉蛟[10]研究發(fā)現(xiàn)，金雀異黃素可以提高小鼠血清中總IgE、TSLP含量及BALF中IL-4、IL-13細(xì)胞因子水平，達(dá)到提高免疫力作用。但以上研究都是基于單獨(dú)模型的研究，本實(shí)驗(yàn)以金雀異黃素為受試物，建立免疫抑制模型，通過游泳訓(xùn)練后測定大鼠血清、肝組織及骨骼肌中的疲勞相關(guān)指標(biāo)，探討金雀異黃素對免疫抑制大鼠運(yùn)動(dòng)疲勞的影響，為進(jìn)一步闡明緩解疲勞作用機(jī)制。為金雀異黃素的進(jìn)一步研究利用提供數(shù)據(jù)支持，為開發(fā)緩解疲勞類型的保健品提供新的思路和方向。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

金雀異黃素(純度98%)，環(huán)磷酰胺，貞芪扶正顆粒，肝/肌糖原試劑盒、尿氮素(BUN)試劑盒、乳酸(LD)試劑盒、蛋白定量試劑盒。

DK-8D型水浴鍋，TGL-16B臺(tái)式離心機(jī)，TG-16M低溫冷凍離心機(jī)，5424高速離心機(jī)，Multiskan Sky全波長酶標(biāo)儀，T6型紫外可見分光光度計(jì)；SH-250電熱恒溫培養(yǎng)箱。

1.2 動(dòng)物與分組

選取72只雄性Sprague Dawley(SD)大鼠，體重(200±20)g，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(遼)2020-0001。大鼠自由飲食，在溫度(20±2) ℃，相對濕度(40～60)%的環(huán)境下飼養(yǎng)。大鼠按體重隨機(jī)分為6組，每組12只，分別為空白對照組、免疫抑制模型組、金雀異黃素低、中、高劑量組以及陽性對照組。

所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按照黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，按照當(dāng)?shù)貦C(jī)構(gòu)要求進(jìn)行。

每天9:00進(jìn)行灌胃處理。其中，空白對照組和免疫抑制模型組給予花生油灌胃，低、中、高組灌胃劑量為10、20、40 mg/kg，陽性對照組劑量為貞芪扶正顆粒3.13 g/kg，連續(xù)灌胃21 d。此外，大鼠每天14:00進(jìn)行游泳訓(xùn)練1次，訓(xùn)練時(shí)用玻璃棒攪動(dòng)水面，以避免大鼠漂浮偷懶。

1.3 方法

1.3.1 免疫抑制模型建立

適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，空白對照組大鼠腹腔注射生理鹽水，其余組大鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺40 mg/kg，每日1次，連續(xù)3 d[11]。

1.3.2 大鼠游泳訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)

適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，在直徑為50 cm、水深為50 cm的塑料圓桶中進(jìn)行大鼠游泳訓(xùn)練，水溫保持在(24±1)℃。第1天起開始訓(xùn)練時(shí)間為30 min，以后逐日遞增10 min，加至80 min維持此訓(xùn)練量至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。剔除不會(huì)游泳的大鼠后隨機(jī)分組。游泳時(shí)用塑料棒驅(qū)趕使之不停的游泳，各實(shí)驗(yàn)組大鼠置于水中不互相接觸且每只鼠尾部不與箱底碰觸，用吹風(fēng)機(jī)將游泳后的大鼠皮毛迅速干燥。

1.3.3 力竭游泳時(shí)間測定

每組大鼠采用急性力竭負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)。于末次給藥后1 h，每組隨機(jī)抽取6只大鼠，在大鼠尾部縛大約為體重5%的鉛皮，然后放入水深50 cm、直徑50 cm的塑料圓桶，水溫維持在(24±1)℃。力竭的時(shí)間根據(jù)從游泳實(shí)驗(yàn)開始直至沉入桶底后10 s不浮出水面進(jìn)行計(jì)算，比較各組大鼠負(fù)重游泳至力竭的時(shí)間。

1.3.4 指標(biāo)檢測及方法

大鼠末次灌胃后，各組大鼠禁食12 h，不禁水，稱量體重后將剩余36只大鼠進(jìn)行游泳訓(xùn)練，大鼠進(jìn)行50 min游泳訓(xùn)練，休息30 min后乙醚麻醉處死，腹主動(dòng)脈取血3 500 r/min下離心15 min后取上清。大鼠處死后取肝臟、骨骼肌等組織備用。分別按照試劑盒說明書測定指標(biāo)。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 21進(jìn)行單因素方差分析，采用LSD法進(jìn)行多重比較，數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，以組間方差分析P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 金雀異黃素對大鼠臟器指數(shù)影響

由表1可知，與空白對照組相比，模型組的胸腺指數(shù)顯著下降(P<0.01)，提示成功建立免疫抑制模型。與模型組比較，金雀異黃素高劑量組和陽性對照組的大鼠胸腺指數(shù)顯著升高(P<0.01)，金雀異黃素各劑量組大鼠的脾臟指數(shù)有所提高，但差異不顯著(P>0.05)。金雀異黃素劑量組大鼠脾臟、腎臟和肝臟指數(shù)較模型組和空白對照組無顯著差異(P>0.05)。結(jié)果表明，金雀異黃素對免疫抑制大鼠胸腺損傷有一定的改善作用。

表1 金雀異黃素對大鼠臟器指數(shù)影響

2.2 金雀異黃素對大鼠力竭游泳時(shí)間的影響

由表2可知，與模型組相比，金雀異黃素劑量組和陽性對照組可顯著提高力竭游泳時(shí)間(P<0.01)。與空白對照組相比，金雀異黃素中、高劑量組和陽性組大鼠平均力竭游泳時(shí)間差異極其顯著，其中高劑量組力竭游泳時(shí)間延長了50.4%(P<0.01)。結(jié)果表明，金雀異黃素可延長免疫抑制大鼠的力竭游泳時(shí)間，且力竭游泳時(shí)間與金雀異黃素劑量呈正相關(guān)。

表2 金雀異黃素對大鼠負(fù)重力竭游泳時(shí)間的影響

2.3 金雀異黃素對大鼠肝糖原和肌糖原含量的影響

由表3可知，補(bǔ)充金雀異黃素各劑量組的免疫抑制大鼠運(yùn)動(dòng)后肝糖原與肌糖原含量明顯提高。其中，與空白對照組相比，金雀異黃素低劑量組大鼠運(yùn)動(dòng)后的肝糖原水平有顯著差異(P<0.05)。與模型組相比，肝糖原含量有所增加但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。金雀異黃素中、高劑量組和陽性對照組的肝糖原含量與模型組相比顯著提高，且差異極其顯著(P<0.01)。金雀異黃素各劑量組大鼠肌糖原水平均極其顯著的高于模型組(P<0.01)。結(jié)果表明，金雀異黃素在20～40 mg/kg時(shí)，可以有效提高免疫抑制大鼠運(yùn)動(dòng)后的糖原水平，進(jìn)而達(dá)到提高大鼠的運(yùn)動(dòng)耐力。

表3 金雀異黃素對大鼠肝糖原和肌糖原含量的影響

2.4 金雀異黃素對大鼠血清中尿素氮和乳酸含量的影響

由表4可知，金雀異黃素對實(shí)驗(yàn)大鼠血清中的尿素氮含量和乳酸含量有明顯的影響，且與金雀異黃素的濃度呈負(fù)相關(guān)。其中，模型組大鼠血清中尿素氮含量和乳酸含量顯著高于空白對照組(P<0.01，P<0.05)，提示成功建立大鼠免疫抑制模型。與模型組相比，金雀異黃素低劑量組尿素氮含量及乳酸含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。中劑量組尿素氮含量則顯著地低于模型組(P<0.05)，乳酸含量極顯著低于模型組(P<0.01)；高劑量組和陽性對照組極顯著地低于模型組(P<0.01)。結(jié)果表明，金雀異黃素可以抑制尿素氮含量的增加，同時(shí)減少乳酸的產(chǎn)生。

表4 金雀異黃素對大鼠血清中尿素氮和乳酸含量的影響

3 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對疲勞的治療有限，已有學(xué)者研究具有抗疲勞作用的潛在替代品，包括傳統(tǒng)中草藥及預(yù)防疾病和促進(jìn)健康的藥用或功能性食品[12]。目前針對緩解疲勞其體內(nèi)分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)十分有限，人們逐漸關(guān)注功能性食品或傳統(tǒng)藥材潛在替代品，進(jìn)行研究以期解決這些復(fù)雜機(jī)體問題并用于改善健康狀況。

胸腺和脾臟是機(jī)體的主要免疫器官，其質(zhì)量的改變可以反映受試藥物對免疫系統(tǒng)的刺激作用[13]。有學(xué)者研究指出，黃酮類化合物可以通過免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)作用提高機(jī)體耐受能力，減緩肌肉的損傷、能量的過度損耗，達(dá)到抗疲勞作用[14]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組大鼠胸腺指數(shù)顯著低于正常對照組，表明環(huán)磷酰胺抑制了大鼠的胸腺生長發(fā)育，造成臟器損傷，而補(bǔ)充金雀異黃素高劑量組和陽性組可不同程度提高大鼠胸腺指數(shù)(P<0.05)。結(jié)果與麻海娟等[8]在金雀異黃素對運(yùn)動(dòng)疲勞大鼠臟器指數(shù)及NO/NOS的影響研究中得到的結(jié)論相同，運(yùn)動(dòng)疲勞大鼠經(jīng)金雀異黃素干預(yù)后，胸腺指數(shù)均明顯上調(diào)。提示金雀異黃素能減輕環(huán)磷酰胺對胸腺的生長抑制作用，可以促進(jìn)免疫器官分化和成熟進(jìn)而提高免疫能力，從而達(dá)到緩解疲勞的效果。

運(yùn)動(dòng)耐力實(shí)驗(yàn)是檢測抗疲勞能力最直接的方式，通過力竭游泳時(shí)間的長短可以反映出運(yùn)動(dòng)耐力的大小[15-17]。本實(shí)驗(yàn)采用力竭游泳試驗(yàn)測試大鼠抗疲勞能力，結(jié)果表明，給予大鼠不同劑量金雀異黃素可延長大鼠的力竭游泳時(shí)間，增強(qiáng)耐力。與王玲玲[18]研究結(jié)果具有一致性，分析原因可能是金雀異黃素吸收后，提高大鼠有氧代謝能力，從而增強(qiáng)耐力起到延緩疲勞的效果。

機(jī)體活動(dòng)需要能量，糖原是機(jī)體主要的能源儲(chǔ)備，糖原含量的多少直接影響運(yùn)動(dòng)能力的強(qiáng)弱[19]。在劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)，肝糖原直接轉(zhuǎn)化為糖對機(jī)體進(jìn)行供能，肌糖原則可以通過無氧酵解為肌肉供能，從而延長運(yùn)動(dòng)時(shí)間，推遲疲勞反應(yīng)[20]。因此，肝糖原和肌糖原通常作為評(píng)價(jià)機(jī)體抗疲勞的指標(biāo)[21]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組大鼠肝糖原含量較空白對照組顯著降低，說明免疫抑制大鼠較正常運(yùn)動(dòng)大鼠肝糖原消耗更迅速。在給予金雀異黃素后，肝糖原和肌糖原含量較模型組顯著增加。夏春榮等[22]和孔凡秀等[23]學(xué)者研究結(jié)論均表明通過延遲肝糖原和肌糖原的消耗可以達(dá)到抗疲勞作用，與本研究結(jié)論一致。分析原因?yàn)榻鹑府慄S素可能通過減少運(yùn)動(dòng)時(shí)機(jī)體糖原消耗或者提升糖原儲(chǔ)備，持續(xù)為機(jī)體提供能量，進(jìn)而延緩疲勞的產(chǎn)生達(dá)到抗疲勞效果。

常規(guī)情況下，血清中尿素氮含量相對穩(wěn)定，當(dāng)機(jī)體進(jìn)行高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)時(shí)，由于體內(nèi)糖類和脂肪供能不足，蛋白質(zhì)和氨基酸會(huì)進(jìn)行分解代謝以提供能量，此時(shí)會(huì)產(chǎn)生代謝物導(dǎo)致血清中尿素氮水平升高。尿素氮累計(jì)越多表示機(jī)體疲勞越嚴(yán)重[24]。研究表明，乳酸的蓄積是導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)性疲勞的重要原因，大量乳酸堆積使得肌肉內(nèi)pH值下降，從而抑制酶活性致使能量供應(yīng)不足[25]。Zhang等[26]研究發(fā)現(xiàn)，玉米須總黃酮可通過降低血乳酸含量發(fā)揮抗疲勞功效。陳戰(zhàn)永等[27]研究結(jié)果也表明通過減小乳酸與尿素氮生成量進(jìn)而提高小鼠抗運(yùn)動(dòng)疲勞能力。鄧炳楠[28]在大豆異黃酮抗疲勞作用的研究中表明通過降低尿素氮與乳酸含量，達(dá)到抗疲勞效果，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)論具有一致性。表明金雀異黃素可以通過減少尿素氮含量，提高大鼠運(yùn)動(dòng)能力并緩解疲勞。同時(shí)可以減少乳酸的產(chǎn)生，降低運(yùn)動(dòng)后導(dǎo)致的肌肉損傷，從而延緩疲勞的產(chǎn)生，且成劑量依賴性。由于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之間存在個(gè)體差異，分組數(shù)量也會(huì)導(dǎo)致結(jié)論具有一定的局限性。但本實(shí)驗(yàn)得到結(jié)論與前人研究結(jié)果相似，從而說明金雀異黃素對免疫抑制大鼠有緩解疲勞的效果。

4 結(jié)論

金雀異黃素能提高免疫抑制大鼠的胸腺指數(shù)，明顯延長實(shí)驗(yàn)大鼠力竭游泳時(shí)間，維持肝臟和肌肉中糖原含量，降低大鼠血清中尿素氮含量和乳酸含量。說明，金雀異黃素可以通過提高大鼠臟器指數(shù)，從而提高免疫力。通過提高免疫抑制大鼠的運(yùn)動(dòng)耐力，促進(jìn)糖原產(chǎn)生，減少乳酸堆積，達(dá)到緩解疲勞的作用效果。金雀異黃素在較高劑量(40 mg/kg)可顯著提高實(shí)驗(yàn)大鼠耐力及調(diào)節(jié)血清和骨骼肌中疲勞相關(guān)生化指標(biāo)的水平，具有較好的緩解疲勞的功效。