酸性硅膠凈化-氣相色譜-三重四極桿質譜法測定玉米中持久性有機污染物

張 煒， 楊永壇， 王松雪， 李 森， 蔡 娣， 李 麗

(國家糧食和物資儲備局科學研究院，北京 100037)

玉米是我國的三大主糧之一，每年產量超過2億噸[1]。玉米中存在真菌毒素，重金屬等有害物質，這些物質不僅會直接危害到人體健康，同時也會通過飼料在各種畜禽體內積累，并通過食物鏈進入人體，造成危害。有機氯農藥、多氯聯苯和多溴聯苯醚屬于持久性有機污染物，是另一類有害物質，具有“致畸，致癌，致突變”三致作用，并可能導致人和動物等生物體內分泌失調，免疫障礙，并具有神經毒性，細胞毒性[2]。玉米在生長過程中，可以通過吸附和沉降等方式攝入等這三類物質[3,4]，并可能在玉米籽粒中蓄積，成為危害人們健康的安全隱患。目前，對玉米中有機氯農藥[5-8]、多氯聯苯[4,9,10]的研究較多，而對其中多溴聯苯醚[4]的研究較少。

對玉米中持久性有機污染物的分析，主要采用氣相色譜-電子捕獲檢測器[5,8,11-13]、氣相色譜-質譜[6,14,15]等方法進行檢測。但是，由于玉米中含有的有機雜質多樣而且含量較高，一般需要對樣品進行較為復雜的提取和凈化。樣品提取主要采用加速溶劑萃取[8,11]、索氏提取[10,14]、微波輔助提取[16]等方法進行樣品提取。這些提取方法一般耗時較長，操作比較復雜，不易進行大量樣品的分析。而對提取物的凈化一般采用磺化法[14,17]、凝膠色譜法[11,18]。磺化法是使用濃硫酸進行洗滌，可以有效去除共提取的脂類物質，但是其操作較為復雜，并存在一定的危險。凝膠色譜法的凈化效果好，但是需要貴重的儀器，并且耗時較長，消耗溶劑量大，樣品通量小。固相萃取法是通過采用填料對提取物中的雜質和目標物吸附能力不同而進行凈化，其操作簡單，選擇靈活，是理想的凈化方法。

本研究采用直接提取法對玉米樣品中多氯聯苯、有機氯農藥、多溴聯苯醚27種典型持久性有機物污染物進行提取，簡化操作，使用酸性硅膠對提取物進行凈化，并采用氣相色譜-三重四極桿質譜對其進行檢測分析，從而建立玉米中典型持久性有機污染物的高靈敏分析方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與標準品

正己烷、乙酸乙酯、異辛烷、二氯甲烷(農殘級)；乙腈、丙酮(HPLC級)；氯化鈉，無水硫酸鎂(分析純)。硅膠填料(60～200 mesh)，44%硫酸酸化硅膠，堿性氧化鋁，石墨化碳黑，N-丙基乙二胺(PSA)，C18填料，中性氧化鋁，酸性氧化鋁，氨基填料，弗羅里硅土。

標準品：7種有機氯農藥單體單標：α-六六六(α-HCH)，β-六六六(β-HCH)，γ-六六六(γ-HCH)，δ-六六六(δ-HCH)，ε-六六六(ε-HCH)，2,4’-滴滴涕(2,4’-DDT)，4,4’-滴滴涕(4,4’-DDT)(質量濃度為100 μg/mL)；7種多氯聯苯混標和每種單體單標：2,4,4′-三氯聯苯(PCB28)，2,2′,5,5′-四氯聯苯(PCB52)，2,2′,4,5,5′-五氯聯苯(PCB101)，2,3′,4,4′,5-五氯聯苯(PCB118)，2,2′,3,4,4′,5′-六氯聯苯(PCB138)，2,2′,4,4′,5,5′-六氯聯苯(PCB153)，2,2′,3,4,4′,5,5′-七氯聯苯(PCB180) (質量濃度均為100 μg/L)；13種多溴聯苯醚混標和每種單體單標：4-溴聯苯醚(BDE3)，4,4′-二溴聯苯醚(BDE15)，2,3’,4-三溴聯苯醚(BDE25)，2,4,4′-三溴聯苯醚(BDE28)，2,2′,4,4′-四溴聯苯醚(BDE47)，2,2′,4,4′,5-五溴聯苯醚(BDE99)，2,2′,4,4′,6-五溴聯苯醚(BDE100)，2,2′,4,4′,5,5′-六溴聯苯醚(BDE153)，2,2′,4,4′,5,6′-六溴聯苯醚 (BDE154)，2,2′,3,4,4′,5′,6-七溴聯苯醚(BDE183)，2,2′,3,4,4′,5,5′,6-八溴聯苯醚(BDE203)，2,2′,3,3′,4,4′,5,5′,6-九溴聯苯醚(BDE206)，十溴聯苯醚(BDE209) (質量濃度均為50 μg/mL)；氘代2,3,3′,4,4′,5-六氯聯苯-d3(PCB156-d3)(質量濃度為10 μg/mL)；氘代2,4,4′-三氯聯苯-d4(PCB28-d4) (質量濃度為10 μg/mL)。

1.2 樣品

玉米樣品采集自我國東北玉米產區，樣品經脫粒除雜后，玉米籽粒進行粉碎，常溫下密封保存。

1.3 儀器與設備

8890B氣相色譜-7000D三重四極桿質譜儀，配有MMI多功能進樣口及7693A自動進樣器，5810R低溫高速離心機，N-EVAP112氮吹儀，Rotavapor R-300旋轉蒸發儀，ML3002T天平(精度0.01 g)，Fotector Plus自動固相萃取儀。

1.4 實驗方法

1.4.1 標準溶液配制

以異辛烷配制27種持久性有機物的混合標準儲備液(7種有機氯農藥，7種多氯聯苯，9種多溴聯苯醚(BDE3、15、25、28、47、99、100、153、154)的質量濃度為2 g/mL，BDE183質量濃度為4 g/mL，BDE203質量濃度為6 g/mL，BDE206質量濃度為8 g/mL，BDE209質量濃度為10 g/mL)，定量內標(PCB156-d3)(質量濃度為100 g/L)工作液，進樣內標(PCB28-d4)的工作液(質量濃度為100 g/L)。

將27種持久性有機物的混合標準儲備液用異辛烷進行逐級稀釋，并加入定量內標工作液，配制為質量濃度為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 g/L(其中BDE183為2倍，BDE203為3倍，BDE206為4倍，BDE209為5倍)的標準曲線工作液，其中定量內標質量濃度為10.0 g/L。所有溶液均置于-18 ℃避光保存。

1.4.2 樣品前處理提取

準確稱取10.0 g玉米粉于50 mL離心管之中，加入100 L定量內標，混合均勻。加入10 mL水，充分振蕩使均勻；加入15 mL乙酸乙酯，充分振搖3 min；向混合物中依次加入3 g氯化鈉和3 g無水硫酸鎂，充分搖勻后，以10 000 r/min高速離心5 min(10 ℃ )使固液分離，將上層有機層盡量移取備用。向剩余物中再次加入15 mL乙酸乙酯，充分振搖1 min后，高速離心5 min(10 ℃ ，10 000 r/min)，取上層有機層。合并有機提取液后待凈化。

室溫下，在旋轉蒸發儀上將提取液中的乙酸乙酯蒸發至近干，向剩余油狀物中加入1 mL正己烷復溶，過固相柱凈化。固相柱由5 g酸性硅膠(44%)裝填并先用10 mL正己烷/二氯甲烷混合液(3/1)和10 mL正己烷淋洗。將樣品加載于固相柱上，依次用6 mL正己烷和20 mL正己烷/二氯甲烷混合液(3/1)淋洗，收集加載樣品后的所有淋洗液。在旋轉蒸發儀上將收集液中溶劑蒸發至剩余約0.5 mL，轉移至進樣小瓶中，用約1 mL二氯甲烷洗滌所用容器后，轉移至進樣小瓶中。采用氮氣將溶劑吹干后，加入900 L異辛烷和100 L進樣內標并混勻，待GC-MS/MS分析。

1.4.3 氣相色譜-三重四極桿質譜(GC-MS/MS)分析條件

色譜條件：色譜柱為DB-5MS 毛細管色譜柱(15 m×0.25 mm×0.1 m)；進樣采用程序升溫(PTV)加壓不分流進樣模式：進樣口初始溫度為150 ℃，保持0.1 min后以600 ℃/min的升溫速率升溫至310 ℃，并保持至分析結束，進樣口壓力為25 psi，保持1.2 min；進樣量為2 L。載氣為氦氣，流速為1.2 mL/min；柱溫箱初始溫度為90 ℃，保持0.5 min，以5 ℃/min升至190 ℃，再以20 ℃/min升至320 ℃，保持5 min。傳輸線溫度為290 ℃。

質譜條件：離子源為電子轟擊源(EI)，離子源溫度為300 ℃；Q1，Q3四極桿溫度均為200 ℃；碰撞氣為氮氣，流速設為1.5 mL/min；淬滅氣為氦氣，流速設為2.25 mL/min；質譜采用動態多反應檢測模式(dMRM)；每個目標分析物分別選擇一對定量離子、一對定性離子。每個目標分析物的保留時間，定量離子對、定性離子對和碰撞電壓見表1。電子倍增器(CEM)增益因子為15。

表1 27種目標持久性有機污染物，定量內標和 進樣內標的氣相色譜-三重四極桿質譜參數

1.5 數據處理方法

采集到的數據使用MassHunter WorkStation進行定性定量分析；樣品分析時，每個化合物以保留時間，2對離子對及相對比例進行定性；以定量離子對，根據標準曲線進行定量。

2 結果與討論

2.1 氣相色譜-三重四極桿質譜分析條件

采用氣相色譜-三重四極桿質譜對多氯聯苯、有機氯農藥和多溴聯苯醚進行同時分析。本研究以多溴聯苯醚為主要關注對象，結合文獻[19,20]，為減少高取代多溴聯苯醚在氣相進樣口和色譜柱上的分解，采用較短的DB-5色譜柱進行氣相色譜分離；并采用程序升溫方式(PTV)進樣[20]，避免了進樣口對不同沸點物質的“歧視”。質譜檢測器采用多反應監測(MRM)模式，通過對每個化合物進行全掃描，子離子掃描以及碰撞能優化，對每個化合物確定了兩對特征離子對，分別作為定量離子對和定性離子對(表1)。在優化的分析條件下，27種持久性有機污染物的氣相色譜-三重四極桿質譜總離子流色譜圖見圖1。

2.2 樣品前處理條件優化

樣品前處理技術是玉米中持久性有機污染物測定的關鍵。對玉米中的有機污染物的提取過程中，玉米中的有機雜質也會被共提取，尤其是脂質物質和色素，這些物質會對后續分析產生嚴重的影響[21,22]，導致目標物的保留時間偏移，分離度變差，以及多溴聯苯醚的分解。因此，需對提取物進行凈化，去除共提取雜質。對樣品提取和凈化的條件進行優化。

2.2.1 提取溶劑比較

多氯聯苯、有機氯農藥和多溴聯苯醚均為弱極性化合物，當對固體基質樣品中這些物質進行提取時，一般采用極性較小的有機溶劑，如乙酸乙酯、正己烷、丙酮、二氯甲烷等。乙腈是常用于QuEChERS法的提取劑，也可以用于持久性有機污染物的提取。采用直接提取法，比較了乙酸乙酯、乙腈、正己烷/丙酮(1/1)和正己烷/二氯甲烷(1/1)對玉米中持久性有機物污染物的提取效果。在10 g/L水平，將標準品的色譜峰面積與添加樣品前處理后各目標分析物的色譜峰面積進行比較。根據結果(圖2)，乙酸乙酯的提取效果最好；正己烷/丙酮(1/1)的提取效果也較好，但相比于乙酸乙酯，其經濟性略差，而且操作略復雜；正己烷/二氯甲烷(1/1)的提取效率相對較差；而采用乙腈進行提取，盡管有助于去除部分脂質物質，但是其提取效率過低，不能充分提取目標分析物。考慮到玉米中持久性有機污染物含量一般較低，為了提高提取效率，選取乙酸乙酯作為提取溶劑，2次提取。

2.2.2 凈化條件優化

玉米中的脂肪和色素的含量較高，在提取過程中，這些弱極性的有機物被一同提取出來，需要進行凈化。本研究采用固相凈化柱法對提取物進行凈化，比較了硅膠、44%酸性硅膠、氧化鋁、氨基填料、PSA、C18、弗羅里硅土等不同凈化填料的凈化效果。根據結果，硅膠、氧化鋁、弗羅里硅土、氨基填料等僅能去除部分雜質，尤其不能有效去除脂類物質。而C18、PSA基本無法去除玉米樣品中的共提取干擾物質。而采用44%的酸性硅膠填料可以有效去除提取物中的脂質物質和色素等雜質。酸性硅膠結合了磺化法和硅膠柱層析法2種方法的特點，屬于破壞性凈化方式，通過濃硫酸氧化和水解達到去除油脂等雜質的目的，同時避免使用硫酸洗滌樣品時的繁瑣操作和潛在危險；硅膠載體上未被功能團化的位點可以與樣品中的各種極性化合物結合，從而與弱極性的持久性有機污染物進行分離，實現凈化目的。而硅膠、氧化鋁等凈化劑主要是通過吸附作用與脂類等雜質結合，由于其結合力較弱，在洗脫劑的作用下，容易造成共流出，不能完全凈化。

圖1 27種持久性有機污染物氣相色譜-三重四極桿質譜總離子流色譜圖(TIC)

圖2 不同提取溶劑的提取效率比較

圖3 不同酸性硅膠用量的凈化效果比較

2.2.3 酸性硅膠用量

酸性硅膠的用量也對凈化效果有較大的影響[21]。玉米樣品經提取后，其粗脂肪質量分數一般在4%左右，為了更有效穩定地去除雜質，比較了使用2、3、4、5 g的酸性硅膠進行提取物凈化的效果。結果顯示，經不同用量的酸性硅膠凈化后，雖然目標分析物的回收率的差別不大(圖3)，但在實際實驗過程中，使用2 g和3 g用量的硅膠時，洗脫過程中容易發生穿濾，不能有效去除雜質，從而對后續分析產生影響。而使用4 g和5 g用量的酸性硅膠凈化時，可以穩定的去除雜質。綜合考慮方法的適用性，本研究選取5 g酸性硅膠用量用于提取物的凈化。

2.3 方法的檢測限、回收率、重復性及線性范圍

2.3.1 標準曲線繪制

對持久性有機污染物的分析，通常采用內標法進行定量。采用內標法，可以補償待測組分在樣品前處理時的損失，而且可以去除基質效應。氘代多氯聯苯PCB156-d3與目標分析物具有相似性質，而且在環境和玉米中不存在。本研究選用該物質為定量內標，通過多點標準曲線法，確定27種目標分析物的定量范圍。多氯聯苯，有機氯農藥和4種低取代溴聯苯醚(BDE3, 15, 25, 47)在0.1～20 g/L的質量濃度范圍內呈較好的線性關系；而多溴聯苯醚BDE99，BDE100和BDE153，BDE154則分別在0.2～50 g/L和0.5～100 g/L范圍內呈較好的線性關系；而七溴代(BDE183)、八溴代(BDE203)，九溴代(BDE206)和十溴代(BDE209)聯苯醚受其穩定性的影響，其響應與質量濃度的關系為二次曲線關系，線性范圍分別為0.6～200 g/L，4～300 g/L，6 400 g/L，25～500 g/L；所有化合物的回歸決定系數(R2)均大于0.996(表2)。

表2 27種持久性有機污染物的線性回歸方程和決定系數

續表2

2.3.2 加標回收率，方法檢出限和定量限

向空白玉米樣品中添加不同質量濃度的27種持久性有機污染物的混合標準溶液，配制為0.4、1.0、2.0 ng/g(其中BDE183、203、206、209的質量濃度分別為2、3、4、5倍)添加水平的樣品。樣品采用1.4.2進行前處理，并按照1.4.3進行GC-MS/MS測定，每個水平樣品測定6次。計算每個目標物的平均回收率和相對標準偏差(RSD)，定量內標以進樣內標為參照，通過內標法計算定量內標的回收率并計算RSD。表3表明，玉米基質中多氯聯苯，有機氯農藥和多溴聯苯醚單體回收率在55.7%～119.6%之間，相對標準偏差(RSD)為1.4%～16.2%之間；定量內標PCB156-d3的回收率為62.7%～84.9% (RSD 5.4%～12.1%)。僅有4-溴聯苯醚(BDE3)因具有較高的揮發性，回收率低而且不穩定[23]，因此不能進行定量，這可能是樣品前處理過程中4-溴聯苯醚損失較多所致。

采用每個化合物方法檢出限2～10倍的標準添加樣品，按公式計算方法檢出限(LOD)。方法定量限(LOQ)以3.3倍方法檢出限進行計算。

LOD=SD×t(在自由度為6，置信水平為99%時的t值為3.14)

玉米基質中，7個多氯聯苯、7個有機氯農藥和3個多溴聯苯醚(BDE15、25、47)共17個化合物的檢測靈敏度較高，檢出限在0.003～0.010 ng/g之間；5個多溴聯苯醚(BDE99、100、153、154、183)的檢出限稍差，為0.016～0.049 ng/g之間；高取代多溴聯苯醚(BDE203、206、209)的檢出限較差，為0.240、0.553、1.174 ng/g(見表3)。

表3 玉米中27種持久性有機污染物的加標回收率及精密度

2.4 實際樣品測定

采用建立的玉米中多氯聯苯、有機氯農藥、多溴聯苯醚的檢測方法對我國某玉米產區的12份玉米樣品進行檢測。在9個樣品中檢出PCB28，其中1個樣品中的PCB28含量為14 pg/g；4個樣品中檢出PCB52；4個樣品中檢出α-六六六單體或4,4′-滴滴涕單體；1個樣品中檢出十溴聯苯醚BDE209。所檢測玉米樣品中，持久性有機污染物的含量很低，多數檢測陽性結果的樣品中的含量小于相應目標物的定量限。其中，六六六、滴滴涕和多氯聯苯的含量均遠小于食品安全國家標準GB2763和GB5009.190的限量要求，說明所采集的玉米樣品安全，同時也反映出玉米生長地的環境中持久性有機污染物的殘留很低。

3 結論

建立了玉米中多氯聯苯、有機氯農藥和多溴聯苯醚三類持久性有機污染物的前處理方法和氣相色譜-三重四極桿質譜分析方法。采用乙酸乙酯對玉米樣品進行直接提取，并采用酸性硅膠凈化，可以有效提取凈化持久性有機污染物。所建立的方法樣品前處理操作較為簡單，溶劑使用量少，除4-溴聯苯醚(BDE3)因揮發性造成損失較高外，其余目標持久性有機污染物的回收率高，具有較好的準確度和精密度，檢出靈敏度高，適用于玉米樣品中的痕量持久性有機污染物的快速鑒別和分析。