十字花科栽培作物根腫病抗性研究進展

蘇賀楠，楊雙娟，魏小春，趙艷艷，王志勇，尹喜恩，張曉偉，原玉香

（1.河南省農業科學院園藝研究所 鄭州 450002； 2.鄢陵縣甘羅養生養老有限公司 河南 鄢陵 461200）

十字花科根腫病是由蕓薹根腫菌（Woron.）侵染引起的世界范圍內普遍發生的一種重要土傳病害，在全世界多個國家均有分布。黃齊望等首次報道了十字花科作物根腫病在我國江西發生，近年來蔓延速度迅猛、發生程度加重、分布范圍極廣、經濟損失嚴重。據統計，十字花科作物根腫病目前在我國20 多個省（自治區、直轄市）均有不同程度地發生，尤其在西南部和中部發病地區危害最嚴重。該病專性寄生在十字花科作物的根部，包括白菜、菜心、油菜、甘藍、花椰菜、青花菜、芥藍、蘿卜、芥菜和蕪菁等栽培作物，通過侵染根毛導致根部薄壁細胞增生而形成腫瘤，對大面積十字花科栽培作物生產影響巨大，一旦發病，蔬菜作物產量急劇下降，經濟效益嚴重下滑。

1 根腫病病害特點、癥狀及分類

1.1 根腫菌的生物學特征

根腫病病原菌為蕓薹根腫菌，同時具有真菌和原生動物特性，目前普遍認為該菌屬于原生動物界、根腫菌門、根腫菌綱、根腫菌目、根腫菌屬。根腫菌在土壤中的主要存活狀態是形態和大小不一的休眠孢子。王靖等總結出油菜根腫菌休眠孢子直徑為1.7～4.3μm，白菜根腫菌休眠孢子直徑為2.2～4.2μm，結球甘藍根腫菌休眠孢子直徑為1.6～4.0μm，根腫菌休眠孢子呈近球形。

當遇到適宜的環境條件時，土壤中的休眠孢子萌發釋放初級游動孢子，初級游動孢子形成變形體，靠近并接觸寄主根毛表皮，產生一種管狀結構侵入細胞壁，完成根毛侵染階段，此階段的感病植株沒有明顯的表型病征。初級游動孢子在侵染的根毛內形成原生質團，原生質團經過大量的核分裂后形成多個游動的孢子囊，已經成熟的游動孢子囊會釋放出次級游動孢子，隨后2 個次級游動孢子融合形成雙核的次級游動孢子，融合后的次級游動孢子侵入植株根部皮層細胞，完成皮層侵染階段。皮層侵染階段會導致植物根部細胞異常增生，引發根部腫大甚至畸形，形成不同形狀的腫瘤。

1.2 根腫菌的發病癥狀

根腫菌專性寄生在十字花科作物根部，從寄主植株的幼苗期到成株期均可發病。在發病初期，受侵染的植株發病癥狀并不明顯，只在側根處出現一些小瘤子，腫根表面通常比較光滑，對植物的地上部分生長基本沒有影響。但是伴隨著根腫菌侵染時間的延長，植株主根也出現腫瘤，根部的腫瘤逐漸膨大，腫根表面變得粗糙且發生龜裂，使其他的雜菌容易入侵根部，造成植株吸收養分受阻，從而導致發病植株地上部長勢較弱、葉片逐漸萎蔫，且越到侵染后期發病越嚴重，最終引起整個植株枯萎死亡。

根腫菌侵染不同的十字花科栽培作物，根部腫瘤的存在部位、大小以及形狀也會產生差異（圖1）。當根腫菌侵染的寄主是白菜、油菜、甘藍和芥菜類蔬菜作物時，主根的腫瘤體積大且數量少，而在側根的腫瘤體積小且數量多，根瘤的形態特征表現為球形、手指狀或者短棒狀；當蘿卜、蕪菁等蔬菜作物受到根腫菌侵染時，主根一般無腫瘤或者腫瘤存在于主根的末端，根上有較大縊縮黑疤，須根上有較多的腫瘤，侵染后期根上黑疤凹陷形成大的黑洞，且中空腐爛。

圖1 大白菜、甘藍和蘿卜根腫病田間發病情況統計標準[12]

1.3 根腫病生理小種鑒定

Honig于1931 年首先提出根腫菌生理小種存在變異分化，隨著研究的深入，Ayers、Lamrnerink、Williams、Johnston、Toxopeus和Buczack等多位學者已經建立了多種鑒定根腫菌小種分化的系統，目前國內外學者公認的根腫菌生理小種的鑒別系統為Williams 建立的Williams 系統和Buczacki 等建立的European Clubroot Differential（ECD）系統。Williams 系統的鑒別寄主分別由2個蕪菁甘藍品種和2 個結球甘藍品種共4 個十字花科栽培作物品種組成，Williams 通過統計這4 個栽培作物品種對根腫菌不同的抗性反應，從而制定了Williams 系統，該體系可以把從16 個不同的國家和地區收集而來的124 個菌株劃分為9 個不同的根腫菌生理小種。去除Williams 鑒別系統中1個蕪菁甘藍品種，增加12 個不同的十字花科鑒別寄主品種，利用這些鑒別寄主對不同生理小種的根腫病抗性來鑒定生理小種，命名為歐洲鑒別寄主體系的鑒別系統（ECD）。

根腫菌活體寄生的特殊性導致自然環境中并不存在單孢生理小種，侵染時都是以混合生理小種的狀態存在，因此通過鑒別系統鑒別出的小種僅為該菌株的優勢生理小種。目前我國大部分地區的主要優勢小種為4 號生理小種，還有一些其他生理小種也被相繼報道。原玉香等通過Williams 鑒別系統明確了河南省新野大白菜根腫菌是4 號生理小種，通過ECD 系統明確其生理小種為ECD16/15/31 和ECD21/31/31，說明經Williams 鑒別系統鑒定的該地區4 號生理小種實際存在致病性差異；黃蓉等通過Williams 鑒別系統對江西省油菜根腫病發病區域進行鑒定，發現致病菌為4 號和9 號生理小種；張晶等利用單孢分離技術和Williams生理小種鑒定方法對中國湖北利川、內蒙古通遼、陜西太白、山東青島、北京、河南南陽、遼寧大連、遼寧沈陽以及云南昆明等9 個大白菜主產區的根腫菌進行分離及鑒定，發現4 號生理小種為中國大白菜主產區的根腫菌優勢小種，同時還包含除5 號以外的所有生理小種。

2 根腫病抗病基因與分子標記的研究進展

迄今，伴隨著科技的不斷發展，根腫病的相關研究已經從遺傳學的理論水平發展到分子生物學水平，越來越多的十字花科栽培作物的抗根腫病基因被定位出來，通過雜交等常規育種途徑和克隆、轉基因等分子生物學手段導入感病的優良品種中，加快了十字花科作物抗根腫病的育種步伐。因此，研究根腫病的抗病機制和抗病性的遺傳規律，不僅可以為十字花科栽培作物抗病育種提供相應的理論依據，另外，對于挖掘抗病基因、加快抗病育種的進程以及改良育種技術都具有十分重要的意義。

2.1 白菜抗根腫病基因定位與克隆研究

大白菜（ssp.，AA=20）屬于蕓薹屬蕓薹種，是起源于我國的一種重要蔬菜。其根腫病抗性研究工作進行較早，白菜中的根腫病抗性基因來源于不同亞種的歐洲飼用蕪菁（ssp.）。在1998 年，Matsumoto等利用RFLP 標記HC352b 和HC181 將根腫病抗性基因定位于A03 連鎖群上，遺傳距離分別為3 cM 和12 cM。2003 年，Suwabe 等利用4號生理小種接種抗性來源于Siloga 蕪菁的抗病大白菜F分離群體，定位到了2 個與根腫病抗性相關的位點，分別命名為（位于A08）和（位于A01），并篩選出2 個緊密連鎖的SSR 標記BRMS-088 和BRMS-096。2004 年，Hirai 等利用Ano-01 生理小種對大白菜抗病分離群體接種，經遺傳分析確定一個由1 對主效基因控制的新的抗根腫病基因（位于A03）。2006 年，Suwabe 等利用抗感根腫病大白菜材料G004 和A9709 構建的F群體，繪制遺傳連鎖圖譜并進行共線性分析，發現了位于A06 染色體上的。Piao 等對抗性來源于ECD01 蕪菁的大白菜分離群體接種4 號生理小種，發現具有抗性的位于A03 連鎖群，顯性SCAR 標記TCR09 與基因緊密連鎖，遺傳距離為0.78 cM，2 個側翼標記TCR01 和TCR09 與之間的遺傳距離為2.9 cM。Zhang 等認為和是兩個緊密相連的抗性位點。Sakamoto等通過接種2 號生理小種和K04 菌株，定位了來源于Debra 蕪菁的抗病基因，分別命名為（位于A03）和（ 位 于 A02）。 Laila 等利 用ddRAD-seq 技術鑒定到1 個新的抗性位點（位于A08），不同于以往報道的位于A08 染色體上的。Chen 等定位了來源于ECD04 蕪菁的抗根腫病基因.、.和.，這3 個位點分別抗2、10 和7 號生理小種。Kato 等對抗病性來源于Gelria 蕪菁的抗病大白菜材料進行定位研究，定位到抗病基因CRb。Pang 等對大白菜抗感根腫病的F分離群體進行定位研究，發現了位于A03 染色體60 kb 區域內的，且在的上游區域。Chu 等通過構建連鎖遺傳圖譜及轉錄組學測序手段將（）精細定位在A03 連鎖群上，兩側分子標記MS7-9 和sN8591，遺傳距離分別為0.06 cM 和0.19 cM。Huang 等通過對大白菜抗感根腫病材料進行RNA-seq 研究，結果發現了位于A03 染色體近端區的。 Huang 等利 用Bulked Segregant RNA Sequencing（BSR-Seq）技 術 在A03 染 色 體23 339 019～23 465 030 bp 之間定位到1 個新的抗病基因，命名為。Chang 等對大白菜抗感根腫病池進行BSR-Seq 和KASP 分析，結果定位到了1 個新的抗性基因，位于A08 染色體14.8～15.4 Mb 之間，命名為。Yu 等在大白菜根腫病抗性研究中定位了3 個抗性基因（位于A03）、（位于A02）和（位 于A08）。Karim 等利 用BSR-Seq 技術在大白菜A08 染色體上定位了2 個根腫病抗性位點和Rcr9。Choi 等對大白菜抗根腫病研究發現1 個位于和位點附近區域的抗病位點PbBrA08，通過標記驗證、基因的結構變異分析等手段確定了該位點是不同于上述抗病基因的新位點。Wei 等對大白菜抗根腫病研究發現1 個位于A03 染色體80 kb 區域內的，通過RACE 克隆技術克隆出的全長序列，包含3 個外顯子和2 個內含子，與已報道的（3 個外顯子和3 個內含子）CDS 序列一致。

目前蕓薹屬A 基因組已定位的抗根腫病基因或位點有20 余個（表1），、、CRb和基因已經被克隆，Hatakeyama 等通過構建區間的高密度分子遺傳圖譜和BAC 文庫，以緊密連鎖的分子標記為探針對BAC 文庫進行篩選，隨后利用PCR 技術進行cDNA 末端快速克隆，最后分別在抗病和感病材料中克隆出全長序列。Ueno 等利用擬南芥及大白菜參考基因組序列信息，通過cDNA 末端快速克隆技術最終克隆出，另外，利用基因的突變體及多個不同根腫病抗性的白菜材料分析了基因內部可能與抗病相關的結構域。Hatakeyama 等精細定位了位于A03 染色體140 kb 區域的，隨后利用新構建的群體把區間縮小至64 kb，結合擬南芥同源序列及參考基因組信息，克隆出序列信息，與已報道的序列一致，最終確認和是同一個基因。付鵬宇精細定位了位于染色體A03上60 kb 區域的，在抗根腫病和感病白菜材料中利用PCR 擴增出序列全長，另外，把基因轉化到擬南芥中，對獲得的陽性植株進行抗病性鑒定及根部組織細胞學形態觀察，最終結果驗證了抗4 號生理小種。伴隨著大白菜全基因組數據庫的公布，以及更多A 基因組亞種重測序以及從頭測序工作的進行，抗病基因的定位與克隆工作將在白菜類蔬菜作物中加速開展起來，基因的功能研究工作也將得到進一步的提升。

表1 白菜類抗根腫病基因位點及標記信息

2.2 甘藍抗根腫病QTL定位研究

結球甘藍（L. var.，CC=18）簡稱甘藍，近年來研究人員對甘藍品種進行廣泛的根腫病抗病性鑒定，結果發現感病的甘藍品種占大部分，而根腫病抗性資源很少。由于接菌的生理小種及研究的抗源材料的不同，甘藍抗根腫病遺傳規律的研究結果也不同，目前大多數研究認為甘藍中的根腫病抗性是由幾個主效位點和微效位點控制的數量性狀，司軍等認為甘藍根腫病抗性受到3 對以上基因控制，為不完全隱性。

迄今，甘藍中關于抗根腫病位點精細定位的報道較少，目前也沒有克隆出抗病基因。Nagaoka等利用不同根腫病抗性的甘藍DH 系構建分離群體進行QTL 定位，結果定位到了5 個QTL 位點，其中1 個主效QTL 位點的LOD 值為13.7，能夠解釋47%的表型變異。Lee 等利用Genotyping By Sequenceing（GBS）技術，通過構建F群體進行甘藍抗根腫病QTL 定位，一共獲得了抗2 號生理小種的1 個主效QTL 位點CRQTL-YC 和抗9 號生理小種的 2 個 主 效 QTL 位 點 CRQTL- GN_1 和CRQTL-GN_2，其中抗2 號生理小種的CRQTL-YC位點能夠解釋47.1%的表型變異。孫超等通過比較基因組學手段，在甘藍中同源克隆出白菜的和基因，鑒定出1 個可能與抗根腫病相關的位點。張小麗篩選出1 個抗根腫菌4 號生理小種的甘藍近緣野生種B2013，通過與感病品種雜交，后代抗病鑒定結果表明其抗病性狀是多基因控制的數量性狀，且存在顯性的主效基因，并通過QTL-seq將抗病QTL 定位在甘藍C09 染色體560 kb 區域。Peng 等利用SNP 基因芯片在甘藍中檢測到23 個與抗根腫病相關的QTL 位點，可解釋6.1%～17.8%的表型變異。Dakouri 等通過BSR-seq 技術將甘藍抗根腫病3 號生理小種的主效基因定位到C07 染色體41～44 Mb 區間內，通過比較區間內基因組的注釋結果，進一步將TIR-NBS-LRR 類型基因和確定為候選基因。

2.3 甘藍型油菜根腫病抗性研究

甘藍型油菜（L.AACC=38）是通過白菜與甘藍種間雜交，隨后加倍形成的異源四倍體，種內遺傳變異非常少，對根腫病抗性較差，整體上缺乏高抗或抗病品種。傳統遺傳學研究認為，甘藍型油菜的根腫病抗性是由1～2 個獨立的顯性基因控制，這些顯性基因在大量抗性材料中都存在。Chiang 等對甘藍型油菜抗根腫病研究發現，1 號和3 號生理小種的抗性均受單一顯性基因控制，而5 號生理小種的抗性是通過2 個隱性基因遺傳的。余青青等以人工合成甘藍型油菜為材料，對根腫病抗性進行遺傳規律研究，發現該油菜的抗性受到一對顯性基因控制。Rahman 等發現甘藍型油菜抗根腫病基因受1～2 個顯性基因控制。Diederichsen 等利用ECD04 和DH 群體發現1 個控制甘藍型油菜根腫病抗性的主效基因和至少2 個隱性基因。Werner 等應用7 種不同的根腫病生理小種，定位到位于8 條染色體上的19 個QTL，這些QTL 對于不同的根腫病菌生理小種具有特異性。目前研究人員已經在甘藍型油菜上發現一些抗病基因或QTL 位點，這些抗病位點大多與白菜和甘藍存在一定的同源關系，控制根腫病抗性的少數幾個起關鍵性作用的顯性基因很有可能來源于白菜的A 染色體組。

2.4 蘿卜根腫病抗性研究

與白菜、甘藍和甘藍型油菜相比，蘿卜（L. RR=18）的根腫病抗病性整體上更強。Diederichsen 等研究發現大部分蘿卜品種對根腫菌的抗性很有可能是由單個顯性位點控制的。Akaba 等以日本蘿卜為材料，接種根腫病2號生理小種，利用9 種類型的染色單體附加系進行研究，結果表明，根腫病抗性基因存在于蘿卜的1條染色體上，不排除存在微效基因的影響。Kamei等用日本蘿卜和中國蘿卜雜交的95 個F群體進行蘿卜根腫病抗病位點的QTL 分析，使用AFLP 和SSR 標記構建連鎖圖譜，結果表明該蘿卜的抗性由或與其緊密連鎖的基因控制，該基因與擬南芥第3 條染色體頂端區域的基因同源。Gan 等利用抗病蘿卜品種BJJ 和感病品種XNQ 雜交獲得的F群體，通過RAD-seq 技術定位到了分別位于8 號和9 號染色體上的5 個與根腫病抗病相關的QTL 位點，分別命名為、、、和。

3 十字花科栽培作物抗根腫病機制研究進展

3.1 抗病R基因在植物抗病中的作用

當病原體入侵時，植物自身會產生有效的機制來識別和應對，植物抵抗病原體的模式有2 種：由起初的病原體相關分子模式（PAMP）觸發的免疫（PAMP-triggered immunity，PTI）和隨后的效應因子觸發的免疫（effector-triggered immunity，ETI）。植物抗病基因（disease resistance gene，）編碼的R蛋白可以識別相應的PAMP 和效應因子，基因通常含有核酸結合位點（nucleotide binding site，NBS）、亮氨酸重復（leucine rich repeat，LRR）結構，可以直接或間接地與病原菌的效應因子結合，從而激發ETI 免疫反應，這些基因使植物能夠識別外源病原體從而激活誘導防御。

迄今，根據基因和蛋白的序列和結構特點可將基因分為分為5 大類型：NBS-LRR（nucleotide binding site plus leucine richrepeat ）、LRR-TM（leucine-rich repeat plus transmembrane receptor）、STK（serine-threonine kinase）、RLK（recepetor-Iike kinase）和SA-CC（signal anchorplus coiled-coil），其中NBS-LRR 類型基因在植物抗病基因中占據著重要的地位，根據N 端結構特征，可以將其分為2 個亞家族（TIR-NBS-LRR 和non-TIR-NBS-LRR）。目前，已經在白菜上克隆出來的4 個根腫病抗性基因、、和都具有核苷酸結合位點（nucleotide binding site，NBS）、亮 氨 酸 富 集（leucine-rich repeat，LRR）和TIR（drosophila toll or animal interleukin-1 receptors）結構域。在白菜中基因是特異的、單一的、顯性的，而甘藍中存在的基因則具有更連續的抗性，包括主基因和次級基因的各種組合。

3.2 植物激素在根腫病反應中的作用研究

植物激素在與病原菌互作過程中起著重要的作用，其中水楊酸（salicylic acid，SA）、茉莉酸（jasmonic acid，JA）和乙烯（ethylene，ET）是植物抵御外界脅迫信號轉導途徑中的重要調控因子，能幫助植物抵御病原菌的侵染；而生長素（indole-3-acetic acid，IAA）、細胞分裂素（cytokinin，CTK）和脫落酸（abscisic acid，ABA）等可能在某些病原菌侵染寄主時起到促進作用。

在擬南芥中至少存在2 種應答病原菌侵染的信號轉導途徑：一種是抵抗活體營養型病原菌侵染的水楊酸信號轉導途徑，另外一種是茉莉酸和乙烯依賴的途徑，主要是抵抗腐生型病原菌的侵染。水楊酸和茉莉酸/乙烯信號轉導途徑在十字花科作物抵抗根腫菌侵染的過程中起著重要的作用，并且外源噴施SA 和JA 可以適當減輕植株根腫病發病癥狀。Lovelock 等對花椰菜根腫病研究發現，與對照相比，在受侵染的根部噴施SA 可以促進一些病程相關基因-及-等上調表達，減少植株根部腫瘤的形成，同時噴施SA 和JA 時，能顯著降低感病植株的發病癥狀。Ning 等在研究根腫病侵染結球甘藍的過程中發現，在抗感材料都受到根腫菌侵染后，與SA 和JA 信號途徑相關的基因在抗病材料中上調表達，而在感病寄主中下調表達。Galindo 等對不同根腫病抗性甘藍型油菜在根腫病侵染后的7、14、21 d 進行轉錄組測序，結果發現在抗病材料中與免疫功能相關的許多基因都與SA介導的反應有關。Ji 等對根腫菌侵染后的大白菜進行差異表達基因的研究發現，在16 個候選基因中有2 個是與SA 信號通路相關，同時還發現在SA處理后抗病寄主中SA 水平上升以及這2 個SA 信號通路相關的候選基因表達上調，說明SA 信號路徑參與了白菜與根腫菌的互作過程。

多數研究認為植物激素包括IAA 和CTK 促進根腫病菌侵染寄主，在侵染過程中，IAA 和CTK 信號途徑均表現活躍，引起受侵染的植株根部IAA 和CTK 含量顯著上升，IAA 水平的上升可導致植株的細胞壁松弛、細胞伸長，最終可造成植株根部形成腫瘤。Xu 等對接種根腫菌后的甘藍型油菜研究發現，接菌后3 d 和7 d 植株根部游離的IAA 水平提高，同時與IAA 合成相關的一些基因在根腫菌侵染早期被誘導表達，另外，向接種后的植株噴施外源IAA 可顯著提高根毛的侵染率，而阻礙IAA傳導途徑可以有效減輕植株發病癥狀。

3.3 其他抗性機制在根腫病反應中的研究

近年來，伴隨著一些高通量測序技術的發展與應用，為研究十字花科作物根腫菌侵染過程中涉及防御反應相關的代謝和信號網絡應答機制提供了有效措施。譚翀通過對大白菜根部接種前后差異基因的表達分析發現，根腫菌侵染后的根部與胼胝質合成相關的基因均下調表達，與胼胝質降解相關的基因上調表達，說明胼胝質可能參與大白菜響應根腫菌的侵染過程。最近，Chen 等對大白菜近等基因系進行轉錄組分析，發現PAMPs、鈣離子泵入、激素信號、PR、轉錄因子及細胞壁重塑等相關基因在不同抗感材料之間呈現差異表達，說明這些基因在根腫菌侵染初級階段的寄主-病原菌互作過程中起作用。Yuan 等對根腫菌侵染不同時期的大白菜進行比較轉錄組學的研究，結果發現與防御酶、生長素、病程相關蛋白、抗病蛋白、細胞壁組織與生物合成、和轉錄因子相關的基因與根腫病抗性有關。Zhang 等對抗病甘藍野生種及感病青花菜進行了轉錄組測序，結果顯示，寄主對根腫菌的防御反應在早期被誘導且相關途徑在侵染14 d 時受到抑制，與細胞壁成分、硫甙葡萄糖苷合成及植物信號轉導相關的基因均在侵染早期表達，且大多數基因在抗病材料中上調表達。Verma 等利用miRNA 測序手段對甘藍型油菜根腫病的發生過程進行了研究，結果發現差異表達miRNA 的靶基因主要涉及轉錄因子、激素相關基因及植物防御反應相關基因等。

4 展 望

十字花科作物作為我國栽培總量最大的蔬菜和油料作物，高發的根腫病嚴重影響著產量。因此，選育抗病品種及探索抗病機制顯得尤為重要。中國現階段白菜類蔬菜、甘藍類蔬菜、甘藍型油菜、蘿卜育種中的基礎研究環節相對薄弱，除了在大白菜中根腫病抗性基因報道的較多，在甘藍和油菜中抗根腫病基因研究目前仍然還是處于QTL 初級定位階段，還未有明確的基因被報道，根腫病抗性的分子機制尚不完全清楚。隨著生物技術的發展，利用生物技術手段選育抗病品種及解析抗病機制已經成為今后的研究趨勢，為在基因水平上認識植物與根腫菌的互作機制創造了有利條件，目前已有很多研究人員通過組學等測序手段研究預測了根腫菌侵染后植物體內基因或蛋白間可能的調控機制，但是關于這些機制研究的內容還是處于初級階段，關于功能的研究較薄弱。因此，需進一步加大對基礎研究的投入力度，建立更準確的十字花科作物根腫病生理小種的鑒別體系，明確國內病原生理小種的分布情況。同時結合高通量測序技術、數量性狀定位及生物信息學分析手段，加快對抗性基因的克隆及功能研究。