西瓜噬酸菌磷酸鹽特異性轉運系統pstS 基因功能分析

蔡馥宇，費諾亞，2，喬 培，關 巍，楊玉文，葉云峰，趙廷昌

（1.植物病蟲害生物學國家重點實驗室·中國農業科學院植物保護研究所 北京 100193；2.沈陽農業大學沈陽 110866；3.廣西壯族自治區農業科學院園藝研究所 南寧 530007）

瓜類細菌性果斑病（bacterial fruit blotch，BFB）是葫蘆科作物上的檢疫性種傳病害，于20 世紀90年代在我國首次被發現和報道，破壞性強，往往給瓜類生產造成嚴重損失。BFB 的病原為西瓜噬酸菌（），是一種革蘭氏陰性細菌。已知III 型分泌系統（type III secretion system，T3SS）在西瓜噬酸菌的致病過程中起關鍵作用。近年來的研究也表明，西瓜噬酸菌的鞭毛、生物膜、群體感應和趨化性等也能在一定程度上影響西瓜噬酸菌的致病能力。

革蘭氏陰性菌中存在多種轉運系統來完成對物質的吸收和利用，比如從外界攝取亞鐵離子的Feo 轉運系統、負責胞內脂蛋白轉運的Lol 系統、轉運大分子營養物的TonB 復合物等。磷酸鹽的吸收和利用主要由磷酸鹽特異性轉運系統（phosphate specific transport，Pst）和 磷 酸 鹽 轉 運 系 統（phosphate inorganic transport，Pit）完成。Pst 屬于磷酸鹽調節子（Pho regulon），一般由PstS、PstC、PstB、PstA 和PhoU 5 個蛋白組成。磷酸鹽調節子的主要功能是控制磷（Pi）穩態，但有研究發現該系統在病原菌的致病過程中也發揮著作用。在遲緩愛德華氏菌（）中，Pst 的突變會影響其在寄主上的毒力，并且T3SS 的跨膜蛋白和其他毒力相關蛋白的分泌也會受到影響。然而，目前Pst 通過何種機制影響細菌的致病性尚未明確。PstS 是Pst 中的Pi 結合蛋白，負責結合周質空間中的Pi。銅綠假單胞菌（）中基因缺失后，細菌一直處于Pi 饑餓狀態，且生物膜形成能力顯著降低，而在致金色假單胞菌（）147-2 菌株中Pst 負調節生物膜的形成。假單胞菌（sp.）wj1 中PstS 蛋白在大腸桿菌中過量表達后，使得重組大腸桿菌的無機磷酸鹽吸收率顯著提高，表明PstS 蛋白具有結合Pi 的能力，但在菌濃度不變的情況下，周質空間的Pi 濃度增加會抑制PstS 蛋白對Pi 的結合。

為明確在西瓜噬酸菌中的功能，筆者構建了西瓜噬酸菌基因的缺失突變菌株和互補菌株，通過對致病性、生物膜形成能力等致病相關表型及轉錄調控能力的測定，初步分析在西瓜噬酸菌致病過程中發揮的作用，為解析西瓜噬酸菌的致病調控網絡提供分子依據。同時通過測定在大腸桿菌中表達西瓜噬酸菌的PstS 蛋白時該蛋白與Pi 的結合能力，初步分析是否在西瓜噬酸菌對磷酸鹽吸收的Pi 結合環節發揮作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株、質粒及引物 試驗所用菌株和質粒見表1，引物序列見表2。

表1 試驗所用菌株和質粒

表2 試驗所用引物

1.1.2 培養基及培養條件（1）金氏B（King’s B，KB）培養基：胰蛋白胨15 g，KHPO1.5 g，MgSO·7 HO 1.5 g，丙三醇15 mL，pH=7.0，加入ddHO 定容至1 L；（2）溶菌肉湯（lysogeny broth，LB）培養基：胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，酵母粉5 g，pH=7.0，加入ddHO 定容至1 L；（3）0.3%半固體培養基：細菌專用運動性蛋白胨0.3 g，酵母提取物0.3 g，瓊脂粉0.3 g，pH=0.7，加入ddHO 定容至1 L；（4）M9 蔗糖培養：NaHPO·12HO 75.6 g，KHPO15 g，NHCl 5 g，NaCl 2.5 g，20% CHNaO10 mL，1 mol·LMgSO1 mL，蔗糖100 g，pH=7.0，加入ddHO 定容至1 L。配置固體培養基（除0.3%半固體培養基外）則在以上配方基礎上再添加1.5%的瓊脂。以上培養基于121 ℃高壓滅菌（蔗糖培養基110 ℃高壓滅菌）20 min。試驗所用抗生素終質量濃度分別為：氨芐青霉素（Ampicillin,Amp）100 μg·mL；卡那霉素（Kanamycin,Km）50 μg·mL；氯霉素（Chloraphenical,Cm）25 μg·mL。試驗中，西瓜噬酸菌及其衍生菌株于KB 培養基28 ℃培養；大腸桿菌及其衍生菌株于LB 培養基37 ℃培養。

1.1.3 試劑及儀器 試驗主要試劑有：KOD 高保真酶（Toyobo）、凝膠回收試劑盒（Axygen）、DNA Marker（北京博邁德基因技術有限公司）、蛋白預制膠（北京全式金生物技術有限公司）等，分別購自國藥集團試劑有限公司和西格瑪公司。試驗所用引物均由北京六合華大基因科技有限公司合成。本試驗所用儀器有：基礎電泳儀和小垂直板電泳槽（BIO-RAD），低溫離心機（Eppendorf）、PCR 儀（BIO-RAD）、智能人工氣候培養箱（寧波江南儀器廠）、分光光度計（Nano VuePlus）等。

1.2 試驗方法

1.2.1 西瓜噬酸菌PstS 蛋白結構域預測分析 根據NCBI 數據庫的氨基酸序列（）使用SMART 網站在線預測PstS 蛋白結構域。

1.2.2 突變菌株Δ及互補菌株Δcomp 的構建和篩選 試驗于2020 年6 月在中國農業科學院植物保護研究所進行。利用Primer 5.0 軟件設計克隆Aac5 菌株基因的上下游片段引物L-F/R、R-F/R（表2），使用DNAMAN 5.2.2 將Aac5的基因序列與KEGG 數據庫中AAC00-1 菌株的基因進行比對，相似性為100%。通過overlapping PCR 技術融合基因上下游片段，將融合片段連接到自殺性質粒pk18中構建重組質粒pk18-。利用同源重組雙交換原理，篩選突變菌株，三親雜交將重組質粒pk18-導入野生型Aac5 菌株中。在含有抗生素加10%蔗糖的M9 平板上篩選得到突變株。使用西瓜噬酸菌特異性引物WFB1/WFB2 以及目的基因的特異性引物-F/R 進行基因的PCR 擴增和測序驗證。

根據的基因序列設計互補引物C-F/R（表2）擴增互補片段并回收，擴增片段與pBBR1MCS-2 質粒連接后導入突變菌株中，并進行基因的PCR 擴增和測序驗證。

1.2.3 致病能力測定 試驗于2020 年7-8 月在中國農業科學院植物保護研究所進行。將野生型菌株Aac5、突變菌株Δ和互補菌株Δcomp培養至對數期，離心收集菌體，使用無菌水重懸2次，將菌液濃度調至3×10CFU·mL。使用噴霧接種的方法將調好的菌懸液均勻噴霧至西瓜（3 周育齡）葉片正反面，每個處理接種幼苗3 盆（每盆5～6株），以無菌水噴霧為陰性對照。筆者所用西瓜品種為中蔬瑞宏，購自中國農業科學院蔬菜花卉研究所。隨后將西瓜幼苗置于人工氣候培養箱培養，培養條件為28 ℃16 h 光照與16 ℃8 h 黑暗交替進行，相對濕度90%。接種8 d 后開始調查發病情況，計算病情指數，試驗設置3 次重復。病情指數按照病情嚴重度分為5 級，標準如下：0 級，葉片無明顯發病癥狀；1 級，葉片小于25%的面積壞死病變；3級，葉片25%～50%的面積壞死病變；5 級，葉片50%～75%的面積壞死病變；7 級，整株幼苗死亡。

病情指數=100×Σ（各級病葉數×各級代表值）/（調查病葉數×最高級代表值）。

1.2.4 煙草過敏性反應測定 試驗于2020 年7 月在中國農業科學院植物保護研究所進行。將野生型菌株Aac5、突變菌株Δ和互補菌株Δ-comp 培養至對數期，離心收集菌體，將菌液濃度調至3×10CFU·mL。用1 mL 一次性無菌注射器將菌液注射至幼嫩三生煙草（）葉片背面兩條葉脈間的葉肉處，每個處理接種3 盆（每盆1 株）置于人工氣候培養箱中28 ℃培養，24 h后觀察是否發生過敏性壞死反應，以無菌水注射為陰性對照。試驗所用三生煙種子由筆者實驗室保存，試驗設置3 次重復。

1.2.5 運動能力測定 試驗于2020 年10 月在中國農業科學院植物保護研究所進行。將野生型菌株Aac5、突變菌株Δ和互補菌株Δcomp 培養至對數期，離心收集菌體，將菌液濃度調至3×10CFU·mL。每種菌液各吸取5 μL 輕點于0.3%半固體培養基上，待菌液晾干后28 ℃正置培養2 d，觀察各菌株菌落大小，測量暈圈直徑。每處理9 個生物學重復，試驗設置3 次重復。

1.2.6 生物膜形成能力測定 試驗于2020 年11 月在中國農業科學院植物保護研究所進行。將野生型菌株Aac5、突變菌株Δ和互補菌株Δcomp培養至對數期，離心收集菌體，將菌液濃度調至3×10CFU·mL。各取1 mL 菌液加入24 孔聚苯乙烯板（COSTAR），28 ℃培養2 d，棄菌液，80 ℃固定30 min，無菌水清洗。加入1 mL 0.1%結晶紫室溫靜置染色30 min，棄廢液。無菌水清洗3～5 次至清洗液透明，37 ℃烘干，拍照。加入1.2 mL 95%乙醇溶解染色的生物膜，測定每孔OD下洗脫液吸光值。每種菌株測定9 個樣品，3 次重復。

1.2.7 體外生長能力測定 試驗于2021 年1 月在中國農業科學院植物保護研究所進行。將野生型菌株Aac5、突變菌株Δ和互補菌株Δcomp培養至對數期，室溫離心收集菌體，將菌液濃度調至3×10CFU·mL。每種菌液各吸取200 μL 加入到聚苯乙烯板（COSTAR）中，放入自動生長曲線儀（芬蘭，Biosceen）中28 ℃震蕩培養，每2 h 測定1 次OD值，試驗持續進行72 h。每種菌株測定9 個樣品，3 次重復。

1.2.8 基因表達量測定 試驗于2020 年8 月在中國農業科學院植物保護研究所進行。通過TRIzol法提取野生型菌株Aac5 和突變菌株Δ的總RNA，將菌液濃度調節一致后使用試劑盒反轉錄成cDNA。試驗選取為內參基因，通過qPCR對III 型分泌系統（T3SS）基因（、、）、鞭毛相關基因（）、群體感應基因（）、趨化性基因（）及磷酸鹽特異性轉運系統相關基因（、、、、）的表達量進行測定。采用相對定量（2）的方法分析結果。試驗所用引物見表3。

表3 試驗所用熒光定量PCR 引物

1.2.9 PstS 蛋白的原核表達 試驗于2021 年3 月在中國農業科學院植物保護研究所進行。利用pET28a--F/R（表2）以西瓜噬酸菌Aac5 基因組DNA 為模板，用KOD Neo 高保真酶體系擴增基因片段。使用限制性內切酶H I/I對質粒pET28a 進行雙酶切，構建原核表達載體pET28a-，將產物轉化至大腸桿菌BL21（DE3）（TaKaRa）感受態細胞中。搖培至OD=0.6～0.8時，取6 mL 上述菌液加入終濃度為1 mmol·L的異丙基--D-硫代半乳糖苷（IPTG），37 ℃繼續誘導4 h。取菌液1 mL，12 000 r·min，4 ℃離心10 min，棄上清液。加入100 μL 無菌水，混勻后加入等體積的蛋白上清液緩沖液。95 ℃變性10 min，12 000 r·min離心3 min。通過SDS-PAGE 凝膠電泳（12%分離膠，5%濃縮膠）檢測重組蛋白是否表達。

1.2.10 PstS蛋白的Pi結合能力 試驗于2021 年3月在中國農業科學院植物保護研究所進行。利用鉬酸銨分光光度法檢測溶液中磷酸鹽含量。將含有pET28a-質粒和空載質粒的大腸桿菌用含有Km 的LB 液體培養基37 ℃培養，至菌液濃度為OD=0.6～0.8 時，加 入 終 濃 度 為1 mmol·L的IPTG，37 ℃繼續誘導培養12 h。4 ℃，7500 r·min離心收集菌體，用0.2、0.5、1.0、2.0 mg·L的KHPO溶液調節菌體濃度至OD=0.5、1.0、1.5。室溫反應6 h 后，4 ℃，7500 r·min離心，用0.45 μm 濾器過濾取上清5 mL 加入50 mL 具刻度磨口試管中。加入ddHO 稀釋至25 mL 后再加入4 mL 50 g·L過硫酸鉀溶液，蓋上塞子，于120 ℃恒溫干燥箱內消解30 min。冷卻至室溫后加入ddHO 稀釋至50 mL。加入抗壞血酸溶液1 mL，混勻，繼續反應30 s。加入鉬酸鹽溶液2 mL，混勻，靜置15 min，用分光光度計檢測其在710 nm 波長處的吸光值，制作標準曲線得出Pi 含量。比較空載與含有重組質粒的菌體對Pi 的吸收差異，Pi 的結合率=[（反應前溶液中的Pi 含量-反應后溶液中的Pi 含量）/反應后溶液中的Pi 含量]×100%，分析在大腸桿菌中表達的西瓜噬酸菌蛋白PstS 對Pi 的結合能力。

1.2.11 數據統計與分析 試驗數據用EXCEL 2019 整理和計算，用SPSS 22 進行統計分析，使用單因素方差分析法進行不同菌株間的差異顯著性分析，使用獨立樣本檢驗進行基因表達量的差異顯著性分析，使用GraphPad Prism 7 制圖。

2 結果與分析

2.1 西瓜噬酸菌PstS蛋白結構域

根據SMART 在線預測，PstS 蛋白（登錄號：A1TQG0_ACIAC）含有一個位于44～254 氨基酸區域的PBP-like 結構域，推測其與Pi 的結合有關（圖1）。

圖1 PstS 的結構與分析

2.2 突變菌株及互補菌株的構建與驗證

通過三親本雜交的方法將質粒pK18-導入野生型菌株Aac5 中，經過同源重組雙交換，得到缺失的突變株。用西瓜噬酸菌的特異性引物WFB1/WFB2 對獲得的突變株進行PCR 電泳驗證，結果顯示能夠擴增出360 bp 的正確條帶（圖2-A），確定其為西瓜噬酸菌；使用目的基因檢測引物-F/R，進行PCR 驗證，突變株無法擴增出目的片段（圖2-B），證明成功敲除基因。使用同樣的方法獲得互補菌株并進行PCR 驗證，結果顯示能夠擴增出正確的（535 bp）目的片段（圖2-B），證明獲得了正確的互補菌株Δcomp。

圖2 ΔpstS 和ΔpstScomp 菌株的電泳驗證

2.3 致病能力測定

噴霧接種8 d 后調查發病情況，接種西瓜葉片的發病癥狀和病情指數見圖3-A 和圖3-B，接種了野生型菌株Aac5 的西瓜葉片出現大小不同的病斑，病情指數為23.93；而接種突變菌株Δ的西瓜葉片發病癥狀較輕，病情指數為14.50，表明突變菌株的致病力下降；接種互補菌株Δcomp 的西瓜葉片病情指數為21.93，高于突變菌株并接近野生型菌株，說明互補菌株部分恢復致病力。與野生型菌株Aac5 和互補菌株Δcomp 相比，接種突變菌株Δ的西瓜病情指數顯著降低，表明基因影響西瓜噬酸菌的致病能力。

圖3 西瓜噬酸菌Aac5、ΔpstS 和ΔpstScomp 菌株致病能力檢測

2.4 煙草過敏性壞死反應測定

注射野生型菌株、突變菌株和互補菌株菌懸液，無菌水為陰性對照（CK），24 h 后觀察結果。由圖4 可以看出，注射3 種菌懸液的煙草均產生過敏性壞死反應，表明基因的缺失不影響西瓜噬酸菌在非寄主煙草上的致敏性。

圖4 煙草過敏性反應測定

2.5 運動能力測定

培養2 d 后對各菌株菌落進行測量、記錄和拍照，發現Aac5、Δ和Δcomp 菌株的菌落暈圈直徑分別為1.33、0.93 和1.16 cm，與野生型菌株Aac5 相比，突變菌株Δ所形成的暈圈直徑最小，差異低于野生型菌株和互補菌株；互補菌株Δcomp 能夠部分恢復運動能力（圖5-A～B）。以上結果表明，基因的缺失導致西瓜噬酸菌運動能力降低。

圖5 西瓜噬酸菌Aac5、ΔpstS 和ΔpstScomp 菌株運動能力檢測

2.6 生物膜形成能力測定結果

在24 孔聚苯乙烯板內壁上觀察Aac5、Δ和Δcomp 菌株的生物膜形成情況，使用95%乙醇溶解后，測量OD下的吸光值，分別為0.86、0.64和0.85。結果表明，與野生型菌株Aac5 相比，突變菌株Δ的吸光值顯著低于野生型菌株和互補菌株；互補菌株Δcomp 的生物膜形成能力能夠恢復至野生型菌株的水平（圖6-A～B）。表明基因缺失導致西瓜噬酸菌生物膜的形成能力降低。

圖6 西瓜噬酸菌Aac5、ΔpstS 和ΔpstScomp 菌株生物膜形成能力檢測

2.7 體外生長能力測定結果

對野生型菌株Aac5、突變菌株Δ和互補菌株Δcomp 的體外生長能力測定后發現，與野生型菌株相比，突變菌株Δ的生長速度降低且達到對數期的時間較晚，互補菌株Δcomp 能夠部分恢復體外生長能力（圖7）。

圖7 西瓜噬酸菌Aac5、ΔpstS 和ΔpstScomp菌株體外生長能力檢測

2.8 基因相對表達量測定

對野生型菌株和突變菌株中磷酸鹽特異性轉運系統相關基因的相對表達量檢測后發現，與野生型菌株Aac5 相比，基因的缺失導致、、、和相對表達量顯著上調（圖8-A），表明基因負調控等基因的表達。利用qPCR 檢測致病相關基因相對表達量后發現，與野生型菌株Aac5 相比，突變株Δ中，T3SS 關鍵調控基因相對表達量顯著上調，相對表達量顯著下調，相對表達量與野生型菌株差異不顯著；鞭毛相關基因、毒力相關基因、趨化性相關基因和群體感應相關基因的相對表達量均顯著上調（圖8-B）。

圖8 ΔpstS 菌株中相關基因相對表達量檢測

2.9 PstS蛋白的原核表達結果

利用SDS-PAGE 凝膠電泳檢測的結果顯示，與含有pET28a 質粒的大腸桿菌相比，含有重組質粒pET28a-的大腸桿菌總蛋白中有一條區別于對照組的條帶，且大小與PstS-6×His 融合蛋白大小（36.7 kDa）基本一致（圖9），說明PstS 蛋白在大腸桿菌中被成功異源表達。

圖9 PstS 蛋白的原核表達

2.10 PstS蛋白的Pi結合能力測定

在不同Pi 濃度和不同菌液濃度下測定菌株PstS 蛋白對Pi 的結合率。結果顯示，在Pi 質量濃度為0.2 mg·L、菌液濃度為OD為0.5 時，PstS 蛋白與Pi 的結合率最高；在Pi 質量濃度為0.5 mg·L、菌液濃度為OD=1.5 時，PstS 蛋白與Pi的結合率最低（圖10-B）。

圖10 PstS 蛋白的標準曲線和Pi 結合能力

3 討論與結論

磷酸鹽是細胞功能實現和生命維持所必需的營養物質，廣泛存在于脂質、核酸、蛋白質和糖類中，對細胞的生物過程有著重要的作用。筆者通過對PstS 蛋白的原核異源表達研究，證實了西瓜噬酸菌中PstS 蛋白具有Pi 結合能力。這與Blus-Kadosh 等在銅綠假單胞菌中發現基因影響Pi 吸收的研究結果一致。目前對的研究多集中于其對磷酸鹽的轉運方面，而對其在病原菌致病過程中所起到作用的研究較少。筆者研究發現，西瓜噬酸菌基因缺失突變菌株Δ的致病能力較野生型菌株Aac5 降低。大多數革蘭氏陰性菌的致病都依賴于T3SS，T3SS 的HrpG 和HrpX對于基因簇、III 型效應子和毒力基因的表達具有重要作用。或的缺失會導致西瓜噬酸菌失去對寄主的致病能力和引起非寄主煙草的過敏性壞死反應。筆者研究表明，通過熒光定量PCR 分析了基因缺失后西瓜噬酸菌中T3SS 基因、、表達量的變化情況，發現基因缺失后，西瓜噬酸菌中表達量顯著上調，而表達量顯著下調，表達量變化雖然不顯著但也是下降的趨勢。筆者推測，基因缺失后，西瓜噬酸菌T3SS 調控基因及T3SS 相關基因的表達受限是其致病能力降低的原因之一。

西瓜噬酸菌的鞭毛、群體感應和趨化性等都是影響西瓜噬酸菌的致病能力的重要因素。張愛萍等研究發現，的缺失會導致西瓜噬酸菌的運動能力顯著降低。而在本研究中，與野生型菌株Aac5 相比，Δ菌株運動能力顯著降低，且鞭毛相關基因在Δ中的表達量顯著上升，這表明基因對運動能力的影響是獨立于的。此外，毒力相關基因、群體感應相關基因和趨化性相關基因在Δ菌株中的表達量顯著上升，說明基因可以調控多種致病相關基因在西瓜噬酸菌內的表達，進而影響西瓜噬酸菌的致病能力。

Pst 系統在細菌對Pi 的吸收和轉運過程中具有重要作用，其能夠維持細菌磷酸鹽的穩態。從本研究中的熒光定量PCR 分析結果可知，基因缺失后，Pst 系統其他基因的表達量均顯著上調，這可能是對基因缺失的一種彌補反應。楊雪等研究發現溶磷菌wj1 PstS 蛋白具有結合Pi 的能力，菌液濃度相同時Pi 溶液濃度的增加會抑制wj1 PstS 蛋白對Pi 的結合。誘導基因表達檢測蛋白對Pi 的結合能力發現，試驗設置的3 個菌液濃度在不同的Pi 濃度環境中PstS 蛋白都能與Pi 結合，這與楊雪等的研究結果一致。在低Pi 濃度時，PstS 與Pi 結合的能力最強，證實了Pst 系統在低Pi環境中對細菌磷酸鹽轉運的重要作用。

筆者的研究初步分析了基因缺失對西瓜噬酸菌的致病能力及生物學表型的影響，證實了西瓜噬酸菌的PstS 蛋白具有Pi 結合能力。但是對于Pst 系統中的其他基因功能以及他們之間的相互作用關系尚未明確。在后期的研究中，需要進一步探究在不同Pi 濃度下西瓜噬酸菌的生長能力、基因缺失后的Pi 結合能力和相關表型，從而進一步明確該基因在西瓜噬酸菌中的功能。