宮頸酸性磷酸酶對宮頸異常細胞進行分流的臨床意義

孔慶楊 董曉斌 王 英 班宏艷 郎曉多

吉林省婦幼保健院(吉林省產(chǎn)科質量控制中心) 1 病理科 2 院長辦公室，吉林省長春市 130051； 3 吉林省雙遼市婦幼保健計劃生育服務中心細胞室； 4 吉林大學第一醫(yī)院病理中心； 5 吉林省婦幼保健院(吉林省產(chǎn)科質量控制中心)體檢中心

通過巴氏染色涂片進行宮頸涂片細胞學篩查是發(fā)達國家最有效和最具成本效益的癌癥篩查方法，可降低宮頸癌的發(fā)病率和死亡率[1]。然而，宮頸涂片篩查有顯著的假陽性和假陰性結果率[2]。為了改善巴氏涂片篩查癌前宮頸病變的更多細節(jié)，已經(jīng)開發(fā)了許多輔助測試[3-6]，包括薄層細胞學檢查;使用放大的化學發(fā)光篩查檢查(窺鏡檢查)與巴氏涂片相結合；細胞學和宮頸造影聯(lián)合使用; 自動復篩方法；通過雜交捕獲或聚合酶鏈反應測試檢測人乳頭狀瘤病毒 DNA；通過端粒重復擴增方案(TRAP)，傅里葉變換紅外(FTIR)光譜和p16INK4a蛋白的免疫細胞化學檢測來評估端粒酶的重復活性。然而，由于成本較高，這些新技術的可用性有限，在發(fā)展中國家的大規(guī)模篩查計劃中沒有任何作用。

最近有研究發(fā)現(xiàn)酸性磷酸酶在發(fā)育不良的宮頸細胞中有高活性。酸性磷酸酶(CAP)是多種溶酶體酶的總稱， 不存在于正常女性生殖道的鱗狀細胞中。子宮頸的再生前病變出現(xiàn)在含有CAP的轉化區(qū)，因此，低級別和高級別鱗狀上皮內病變(分別為LSIL和HSIL)的異常細胞均呈CAP 陽性。其他病變如 ASC-H(非典型鱗狀細胞不能排除高級別SIL)和其他宮頸上皮內瘤變(AGC)病變也表達 CAP。非典型鱗狀細胞(ASC，根據(jù)宮頸TBS報告系統(tǒng))是指形態(tài)上提示為鱗狀上皮內病變的細胞改變，但從質量和數(shù)量上又不足以作出明確判斷。ASC不是一個單一的生物學實體，它包括與致瘤型人類乳頭瘤病毒感染無關的改變(炎性)、瘤變，也包括那些提示可能有潛在宮頸上皮內瘤變(CIN)的情況，以及極少數(shù)的癌。這正是目前細胞形態(tài)學診斷無法解決的問題，此時若能聯(lián)合宮頸酸性磷酸酶檢測，并將有瘤變傾向的鱗狀上皮細胞標記、區(qū)分開來，將會對臨床診斷和治療起到重要的作用，也是宮頸癌篩查細胞學診斷中的重大進步。本研究旨在評估CAP在宮頸異常細胞中輔助診斷的效用，以幫助觀察異常鱗狀細胞和宮頸癌及癌前病變的篩查。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集近5年送檢本院134例患者宮頸標本，經(jīng)常規(guī)液基薄層細胞學技術制片后被診斷為ASC-US，將其作為研究對象。其患者年齡33～64歲，平均年齡(48.80±6.96)歲。本研究經(jīng)醫(yī)學倫理委員會同意。納入標準：(1)18周歲<年齡<65周歲；(2)檢查時未處在生理期內；(3)檢查前1周無性生活；(4)無局部用藥及陰道沖洗史。排除標準：(1)患者無法遵守研究中各項要求；(2)入選前3個月內參與過其他相關臨床研究。

1.2 方法

1.2.1 染色試劑：一抗酸性磷酸酶(FSC-2201，合肥科久盛生物醫(yī)藥有限公司)，二抗、DAB顯色劑、PBS、抗體稀釋液、過氧化物酶封閉液、稀釋液(均為北京中杉金橋生物技術有限公司)，蘇木素染液(珠海貝索生物技術有限公司)。

1.2.2 樣本制備：采用經(jīng)過細胞學TBS報告系統(tǒng)診斷為ASC-US的婦科宮頸標本，用沉降式液基細胞制片機制備薄層細胞片備用；采用Thermo自動免疫組織化學染色機進行染色。

1.2.3 樣本染色步驟：(1)細胞涂片95%酒精固定； (2)PBS沖洗5min,2次；(3)加一抗稀釋液室溫孵育30min；(4)棄掉液體，加過氧化氫孵育10min；(5)滴加一抗酸性磷酸酶(按照1∶150稀釋比例)，室溫條件下孵育1h；(6)PBS沖洗3次；(7)滴加二抗30min；(8)PBS沖洗3次；(9)滴加DAB(1ml加1滴)5min；(10)PBS終止顯色；(11)蘇木素染色；(12)封片。

染色以鱗狀上皮化生或宮頸腺上皮細胞為陽性對照，用抗體的孵育液作陰性對照。有經(jīng)驗的且能熟練掌握判讀標準醫(yī)師進行判讀，同時采用隨機雙盲法，陽性結果的判定標準為在含有豐富酸性磷酸酶的陽性對照的鱗狀上皮化生細胞中，光學顯微鏡下細胞漿內可見明顯棕色顆粒。正常的鱗狀上皮、表層細胞中呈陰性，宮頸腺上皮細胞細胞漿中顯示均勻的棕色顆粒，在萎縮性反應中，一些底層細胞可呈淺棕色著色，同時組織細胞也可以顯色[7]。

1.3 診斷標準 以TBS分類系統(tǒng)作為診斷標準。TBS報告主要包括[8]：(1)良性細胞學改變，主要包括感染(滴蟲感染、真菌感染、嗜血桿病形態(tài)感染、放線菌形態(tài)感染、HPV形態(tài)感染、單純皰疹形態(tài)感染)和炎癥。(2)上皮細胞異常改變：①腺上皮細胞改變，分為不典型的腺上皮細胞，無明確診斷意義，宮頸腺癌、子宮內膜癌及其他腺癌；②異常鱗狀上皮細胞可分為：非典型鱗狀上皮細胞(ASC)：無明確診斷意義的非典型鱗狀上皮細胞(ASC-US)和非典型鱗狀上皮細胞，但高度鱗狀上皮內病變(ASC-H)除外；低度鱗狀上皮內病變(LSIL)；高度鱗狀上皮內病變(HSIL)； 鱗狀細胞癌(SCC)。陽性CAP指ASC-US上方的病變。在用CAP染色的涂片中，宮頸管的正常細胞和一些單核細胞呈陽性，根據(jù)其形態(tài)可以排除。只有未成熟的CAP陽性鱗狀上皮細胞、核擴張的鱗狀上皮細胞和核異型鱗狀上皮細胞被鑒定為CAP陽性細胞。

2 結果

2.1 酸性磷酸酶染色結果 正常鱗狀上皮化生細胞未檢測到CAP(見圖1)，其為細胞學染色的陰性對照；被檢測除棕色沉淀的鱗狀上皮細胞(見圖2)，CAP陽性表達，其為細胞學染色的陽性對照；ASC-US細胞中CAP陽性細胞內有明顯棕色沉淀細胞，CAP陰性細胞無顯著沉淀(見圖3～4)；LSIL患者細胞和HSIL患者細胞中CAP表達均為陽性，有大片棕色沉淀在視野中(見圖5～6)。

圖1正常鱗狀上皮細胞， 圖2鱗化細胞，CAP CAP陰性表達 陽性表達

圖3ASC-US細胞CAP 圖4ASC-US細胞CAP 陽性表達(箭頭所指) 陰性表達

圖5低鱗狀上皮內病變細胞 圖6高鱗狀上皮內病變細胞CAP陽性表達(箭頭所指) CAP陽性表達(箭頭所指)

2.2 酸性磷酸酶結果與組織病理學結果比較 134例經(jīng)宮頸細胞學檢查被判斷為未明確意義的非典型鱗狀上皮細胞婦科宮頸標本經(jīng)組織病理學檢查后發(fā)現(xiàn)，發(fā)生炎癥改變76例，LSIL 50例，HSIL 7例，鱗狀細胞癌1例。酸性磷酸酶染色發(fā)現(xiàn)，酸性磷酸酶在LSIL、HSIL、鱗狀細胞癌中均大量表達，而在大部分炎癥中未有表達，且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

3 討論

子宮頸良性和惡性病變已被評估為多種組織化學反應，包括核糖核酸、糖原、酸性磷酸酶、非特異性酯酶、葡萄糖醛酸酶和磷酸胺酶。其中，酸性磷酸酶因其易于使用細胞化學技術進行細胞內定位而引起了相當大的關注[9]。在正常基底細胞、“非典型”基底細胞、組織細胞以及惡性鱗狀細胞中可見高酸性磷酸酶活性[10]。1997年酸性磷酸酶首次被提出用于檢測常規(guī)巴氏涂片上的非典型鱗狀細胞的作用[11]。

表1組織病理學結果與對應酸性磷酸酶檢測結果

本研究對經(jīng)細胞學檢查為ASC-US的患者進一步進行CAP檢測，134例經(jīng)宮頸細胞學檢查被判斷為未明確意義的非典型鱗狀上皮細胞婦科宮頸標本經(jīng)組織病理學檢查后發(fā)現(xiàn)，發(fā)生炎癥改變76例，LSIL 50例，HSIL 7例，鱗狀細胞癌1例。CAP染色發(fā)現(xiàn)，CAP在LSIL、HSIL、鱗狀細胞癌中均大量表達，在大部分炎癥中其表達呈陽性，且具有統(tǒng)計學意義。

雖然技術簡單性和檢測病變的能力似乎對本次研究有利，但引入CAP檢測這一方法還確實存在許多解釋問題。本次檢測采用的修飾在評估核特征方面似乎在技術上較差。核細節(jié)是檢測非典型鱗狀細胞的最基本標準。在某些情況下，具有非常高宮頸酸性磷酸酶活性的宮頸內膜細胞，其中棕色顆粒往往覆蓋細胞核，很難評估。需要嚴格避免過度染色。鱗狀化生細胞中存在酶活性意味著只有精通常規(guī)細胞病理學的人才能評估CAP涂片。否則所有帶有化生鱗狀細胞的涂片都將被認為是陽性的，在沒有明確的核細節(jié)的情況下，這可以模仿非典型細胞并導致不正確的診斷。

CAP檢測在宮頸癌篩查中的作用需要更多的評估。篩查技術需要高靈敏度，以避免漏診、誤診[12]。CAP檢測最大效用是保證質量和選擇宮頸涂片進行重新篩查。CAP陽性有助于將注意力僅集中在重要細胞上，忽略CAP陰性細胞大大加快了篩選過程。還需要評估聯(lián)合行動方案在資源貧乏地區(qū)的作用。讓檢測人員之間通過酸性磷酸酶染色結果進行篩選，將陽性涂片結果直接進行進一步檢查，這會比讓檢測人員篩查LSIL和HSIL要容易得多。

綜上所述，宮頸酸性磷酸酶對宮頸細胞學檢查結果為未明確意義的非典型鱗狀上皮細胞進行明確診斷的主要作用可能是用于初始篩查或作為宮頸涂片質量保證調查的輔助手段。此外，在缺乏經(jīng)驗豐富的檢測人員的醫(yī)療環(huán)境下，酸性磷酸酶染色與常規(guī)巴氏涂片結合使用時，巴氏涂片的敏感性將有所提高，進而能夠轉化為更有應用價值的宮頸涂片篩查計劃。