樹豆葉醇提物通過mTOR/S6K1降低T1DM小鼠胰島素抵抗

余曉艷，譙 艷，黃 婧， 劉 云

綿陽市中心醫院內分泌科，綿陽 621000

糖尿病是由遺傳因素、免疫功能紊亂等多種因素導致機體胰島功能減退、胰島素抵抗(insulin resistance，IR)等進而引發糖、蛋白質、脂肪等代謝紊亂的綜合征[1-2]。中藥材是純天然產物，具有毒副作用小、不產生耐藥性等優點，備受研究者青睞。樹豆是蝶形花科木豆屬的多年生灌木，研究顯示其脂溶性部位有降血糖、血脂作用[3-4]。葉貴梅等[5]研究顯示，樹豆葉醇提物可一定程度改善糖尿病大鼠糖代謝和脂代謝。既往研究顯示，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白/核糖體S6激酶1(mammalian target of ra-pamycin/S6kinse1，mTOR/S6K1)通路活化與糖尿病IR的發生、發展關系密切[6]。目前有關樹豆葉醇提物對糖尿病的調控作用是否與抑制mTOR/S6K1通路活化有關少見報道，因此本研究探討樹豆葉醇提物對1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus，T1DM)小鼠IR作用的影響，并分析可能的機制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

ACCU-CHEK Advantage Ⅱ型血糖儀，北京中西遠大科技有限公司；BK-400型全自動生化分析儀，山東博科生物科技有限公司；HBS-ScanX全波長酶標儀，南京德鐵實驗設備有限公司；

1.2 試藥

脲佐菌霉素(streptozotocin，STZ)購自上海信帆生物科技有限公司；兔抗鼠mTOR、p-mTOR、S6K1、p-S6K1、β-actin抗體及山羊抗兔HRP二抗，均購自北京索萊寶科技有限公司；胰島素放免試劑盒購自昀冠(上海)生物科技有限公司；Trizol試劑及BCA蛋白定量分析試劑盒均購自美國Thermo Fisher；逆轉錄試劑盒購自日本Takara；上樣緩沖液購自北京Solarbio；PIRA裂解液購自康迪斯化工(湖北)有限公司。

1.3 動物

60只SPF級、6周齡SD雄性小鼠，體質量20～30 g，平均體質量(25±5) g，購自北京唯尚立德生物科技有限公司，許可證為[SCXK(京)2016-0009]。

2 方法

2.1 樹豆葉醇提物制備

取干燥樹豆枝葉100 g，置于1 000 mL圓底燒瓶中，加體積分數為95%的乙醇600 mL回流提取3次，每次2 h，合并提取液，減壓回收干燥，將浸膏分散于1 000 mL熱水中，超聲處理使其成為均勻的混懸液并冷卻至室溫后置于4 ℃冰箱過夜，離心，棄去上清液，沉淀用熱水同法洗滌3次后再混懸于水中，先用石油醚50 mL萃取3次以除去葉綠素，再用50 mL氯仿萃取3次，減壓回收氯仿，得到樹豆脂溶性部位5 g，用質量濃度為5 g·L-1的羧甲基纖維素鈉(CMCNa)研磨，備用。

2.2 T1DM模型建立

將小鼠適應性喂養3 d后，禁食不禁水12 h后以多次小劑量法注射30 mg·kg-1STZ(每日1次，連續5 d)建立T1DM模型，注射結束7 d后，小鼠禁食不禁水10 h，采集尾靜脈血測空腹血糖，以空腹血糖>11.1 mmol·L-1視為造模成功。

2.3 分組及處理

將60只大鼠隨機分為對照組(以普通飼料飼養)、模型組及樹豆葉醇提物低、中和高劑量組，每組10只。樹豆葉醇提物低、中和高劑量組于模型建立成功后，同時間分別給予樹豆葉醇提物50、100、150 mg·kg-1·d-1[5]灌胃處理；對照組、模型組于同時間給予等量CMCNa灌胃處理，每日1次，連續4周，期間均用普通飼料飼養，并觀察小鼠一般情況。

2.4 標本采集

給藥4周結束后，在大鼠空腹12 h情況下用40 mg·kg-1戊巴比妥鈉麻醉大鼠，眼眶靜脈叢取血，及時測定并記錄空腹血糖，靜置1 h后，以3 000 r·min-1離心10 min，取上清液于-80 ℃冰箱保存待測；隨后將大鼠頸椎脫臼處死，取胰腺組織并分為兩部分，保存于液氮中用于后續實驗。

2.5 胰島素抵抗相關指標檢測

用BK-400型全自動生化分析儀測定空腹血糖(asting plasma glucose，FPG)水平；用HBS-ScanX型酶標儀測定血清胰島素(insulin，INS)水平；用胰島β細胞功能指數(homeostasis model assessment for insulin secretion index，HOMA-β)評估β細胞功能；用穩態評估模型評估胰島素抵抗指數(homeostasis model assessment of insulin resistance，HOMA-IR)；用定量胰島素敏感性檢測指數(quantitative insulin check index，QUICKI)評價胰島素敏感度。

2.6 實時熒光定量PCR法

取2.4各組其中一份胰腺組織，Trizol法提取總RNA并測質量濃度，以RNA為模板進行逆轉錄反應得cDNA，以其為模板鏈進行實時熒光定量PCR反應。按照試劑盒說明書設置反應體系；反應條件為預變性95 ℃ 30 s，變性95 ℃ 5 s，退火60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 20 s，重復40個循環。擴增值閾值所需循環次數(CT值)，mTOR、S6K1均以β-actin作為內參，以2-△△CT法計算mTOR、S6K1 mRNA相對表達量。引物由大連寶生生物工程有限公司設計并合成，引物序列分別為：正向引物5′-3′：AAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC，反向引物5′-3′：GGGGTCATTGATGGCAACAATA；正向引物5′-3′：TGGAGTTGGGGGTTTCTGTA，反向引物5′-3′：TTCAGTGCACAGGTTCAAGC；正向引物5′-3′：GTCAACGGATTTGGTCTGTATT，反向引物5′-3′：AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT。

2.7 免疫印跡法

取2.4各組大鼠胰腺組織，剪碎制備勻漿，以RIPA液冰上裂解，孵育20 min，以10 000 r·min-1離心10 min(離心半徑為8 cm)取上清，測定蛋白總量并取20 μg與等量上樣緩沖液混勻，沸水浴變性，進行電泳、轉膜，以質量濃度為0.5 g·L-1的脫脂奶粉封閉2 h，TBST清洗，之后加入mTOR、p-mTOR、S6K1、p-S6K1及內參β-actin作為一抗(1∶500)，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌，加入山羊抗兔二抗(1∶1 000)，37 ℃ 1.5 h，顯影、定影，計算目的基因蛋白相對表達量。

2.8 統計學方法

3 結果

3.1 一般情況比較

除對照組外，其余各組大鼠皮毛松散、毛色發黃，無光澤，精神萎靡，嗜睡，時常扎堆，活動減弱，反應遲鈍，多飲、多食、多尿，尿色偏黃，與對照組比較體質量增加較快。樹豆葉醇提物低、中、高劑量組大鼠一般狀況優于模型組，其中高劑量組改善最為明顯。

3.2 各組大鼠胰島素相關指標比較

與對照組比較，模型組大鼠FPG、INS、HOMA-IR水平升高，HOMA-β、QUICKI水平降低(P<0.05)；與模型組比較，樹豆葉醇提物低、中、高劑量組大鼠FPG、INS、HOMA-IR水平降低，HOMA-β、QUICKI水平升高(P<0.05)，呈劑量依賴性。見表1。

表1 各組大鼠胰島素相關指標比較

3.3 各組大鼠胰腺組織中mTOR、S6K1 mRNA表達

與對照組比較，模型組大鼠胰腺組織中mTOR、S6K1 mRNA水平均升高(P<0.05)；與模型組比較，樹豆葉醇提物低、中、高劑量組大鼠胰腺組織中mTOR、S6K1 mRNA水平均降低(P<0.05)，呈劑量依賴性。見表2。

表2 各組大鼠胰腺組織中mTOR、S6K1 mRNA表達

3.4 大鼠胰腺組織中mTOR/S6K1通路蛋白表達

與對照組比較，模型組大鼠胰腺組織中p-mTOR/mTOR、p-S6K1/S6K1水平均升高(P<0.05)；與模型組比較，樹豆葉醇提物低、中、高劑量組大鼠胰腺組織中p-mTOR/mTOR、p-S6K1/S6K1水平均降低(P<0.05)，呈劑量依賴性。見圖1及表3。

注：A.對照組；B.模型組；C.樹豆葉醇提物低劑量組；D.樹豆葉醇提物中劑量組；E.樹豆葉醇提物高劑量組。

表3 各組大鼠胰腺組織中mTOR/S6K1通路蛋白表達比較

4 討論

T1DM又稱為胰島素依賴型糖尿病，屬于自身免疫性疾病，是由于機體選擇性攻擊胰腺細胞，造成D細胞大量破壞、胰島β細胞發生自身免疫破壞，胰島素分泌嚴重不足，表現為高血糖和酮癥酸中毒，并會引起嚴重代謝紊亂、感染性疾病、慢性并發癥如微血管病變等問題，嚴重影響患者健康[7-10]。IR是指胰島素作用的靶器官對胰島素作用的敏感性下降，即正常劑量的胰島素產生低于正常生物學效應的一種狀態。研究顯示，T1DM患者存在IR[11]。

樹豆是蝶形花科木豆屬多年生常綠灌木，研究顯示，其脂溶性部位能夠降血糖、調節血脂[13]。葉貴梅等[5]研究顯示，樹豆葉醇提物對糖尿病大鼠糖代謝和脂代謝具有一定調節作用。本研究結果顯示，除對照組外，其余各組大鼠皮毛松散、毛色發黃，無光澤，精神萎靡，嗜睡，時常扎堆，活動減弱，反應遲鈍，多飲、多食、多尿，尿色偏黃，與對照組比較，體質量增加。樹豆葉醇提物低、中、高劑量組大鼠一般狀況優于模型組，隨著用藥時間的延長，大鼠一般狀況明顯得到改善，呈劑量依賴性。與葉貴梅等研究結果相似，說明樹豆葉醇提物對T1DM有一定治療作用。INS是一種蛋白質類激素，體內胰島素是由胰島β細胞分泌的，INS是機體內唯一降低血糖的激素，也是唯一同時促進糖原、脂肪、蛋白質合成的激素[14]。HOMA-β反映胰島β細胞合成并分泌胰島素的能力，其值越高表明胰島β細胞分泌胰島素的能力越強[15]。HOMA-IR是用于評價個體胰島素抵抗水平的指標，反映機體對胰島素的敏感性[16]。QUICKI是描述胰島素抵抗的程度，胰島素敏感性越低，單位胰島素的效果越差，分解糖類的程度越低，在分泌量足夠的情況下，提高胰島素敏感性是很好的治療糖尿病的方法[17]。本研究結果顯示，與對照組比較，模型組大鼠FPG、INS、HOMA-IR水平升高，HOMA-β、QUICKI水平降低；與模型組比較，樹豆葉醇提物不同劑量組大鼠FPG、INS、HOMA-IR水平降低，HOMA-β、QUICKI水平升高，呈劑量依賴性。說明樹豆葉醇提物能夠降低T1DM小鼠血糖水平，降低IR，增加胰島素敏感性。

研究顯示，mTOR/S6K1通路與糖尿病IR發生、發展有關，當機體長期處于高質量濃度葡萄糖或氨基酸刺激，促使mTOR發生磷酸化反應，進而激活下游S6K1并使其發生磷酸化反應，阻止胰島素信號傳導最終產生IR[18-20]。本研究結果顯示，與對照組比較，模型組大鼠胰腺組織中mTOR、S6K1 mRNA及蛋白水平均升高；與模型組比較，樹豆葉醇提物低、中、高劑量組大鼠胰腺組織中mTOR、S6K1 mRNA及蛋白水平均降低，呈劑量依賴性。說明樹豆葉醇提物能夠降低T1DM小鼠血糖水平，降低IR，增加胰島素敏感性，可能是通過抑制mTOR/S6K1通路活化實現的。

綜上所述，樹豆葉醇提物可能通過抑制mTOR/S6K1通路活化，降低T1DM小鼠血糖水平，降低IR以增加胰島素敏感性。本研究并未能明確樹豆葉醇提物對mTOR/S6K1通路的具體調控作用，后期應進一步深入闡述。