牛蒡根結線蟲生防芽孢桿菌篩選及其生防機制研究

孫 科， 王 萌， 馮希勇

(徐州生物工程職業技術學院藥品食品學院，江蘇徐州 221006)

根結線蟲(spp.)是一種寄生性植物病原線蟲，能侵染3 000多種植物，對世界農業危害嚴重，每年約造成1 000 億美元的損失。其中，南方根結線蟲()是危害我國農作物及蔬菜的優勢種，也是牛蒡種植中重要的蟲害，亟需安全有效的防治措施。由于化學農藥對生態環境的破壞越來越嚴重，我國對化學農藥的使用限制也越來越嚴格，絕大多數殺線劑我國已經禁用。生物防治根結線蟲病是減少化學農藥危害實現綠色環保的重要途徑。目前，許多學者做出了有意義的探索與研究，分離篩選得到多種拮抗根結線蟲的生防菌，其中真菌比例最大，如哈茨木霉()、厚垣輪枝孢菌()、淡紫色擬青霉()等。芽孢桿菌()是一類重要的植物病蟲害生防菌，具有抗逆性強、功能多樣、親和性好等特性。目前，芽孢桿菌對根結線蟲的防治研究逐漸增多，Gao等發現蠟質芽孢桿菌()S2的發酵產物鞘氨醇對南方根結線蟲以及秀麗桿線蟲具有較強的致死性。史鳳玉等研究發現，巨大芽孢桿菌()以及解淀粉芽孢桿菌()的次生代謝產物具有顯著的殺滅根結線蟲的能力。雖然篩選出的根結線蟲的生防菌種類較多，但真正用于實際生產中極少，因此，挖掘新的根結線蟲生防菌仍然具有重要意義。

隨著時間的推移，植物病蟲害發病嚴重的田塊會出現病蟲害減輕的現象，并成為自然衰退現象，研究學者把具有自然衰退現象的土壤成為抑制性土壤。研究者認為之所以會出現病蟲害自然衰退現象，是因為土壤中存在大量病蟲害天敵，特別是一些拮抗微生物。因此，利用牛蒡根結線蟲自然衰退現象的抑制性土壤篩選根結線蟲拮抗劑，為尋找根結線蟲生物防治提供了一條新的途徑。本研究從江蘇省徐州市豐縣、沛縣牛蒡種植南方根結線蟲病自然衰退的土壤中，篩選南方根結線蟲生防菌，并研究生防菌發酵產物對南方根結線蟲的作用機制，以期為牛蒡根結線蟲病的綠色防治提供理論和實踐依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣本來源 從徐州市豐縣、沛縣種植牛蒡的9個鎮，選取根結線蟲發病嚴重的牛蒡大田中采集生防菌芽孢桿菌樣本。南方根結線蟲由徐州市綠色植保工程技術研究中心提供。

試驗時間為2019年3月至2020年11月，試驗地點為徐州生物工程職業技術學院生物發酵研究中心和江蘇省徐州市沛縣牛蒡生產基地。

1.1.2 培養基 LB固體培養基：NaCl 10 g，酵母提取物 5 g，胰蛋白胨 10 g，瓊脂18 g，去離子水 1 000 mL，pH值為6.8～7.2。121 ℃滅菌20 min，培養基冷卻到50～55 ℃，加入過濾的放線菌酮20 mg。

LB液體培養基：LB固體培養基配制過程中去掉瓊脂和放線菌酮。

1.1.3 供試牛蒡品種 牛蒡品種為新林-徐州1號，由徐州山崎農產品技術研發有限公司提供。

1.1.4 檢測試劑盒 總糖含量測定試劑盒、過氧化氫酶(CAT)活性檢測試劑盒、總蛋白(TP)含量測定試劑盒、羧酸酯酶(CES)活性檢測試劑盒、乙酰膽堿酯酶(ACh)活性檢測試劑盒，均購自上海酶聯生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-1FD單人單面超凈工作臺，購自上海滬凈醫療器械有限公司；FA1004B-2204B萬分之一電子分析天平，購自青島聚創華業分析儀器有限公司；QM-QX-20L行星球磨機，購自長沙米淇儀器設備有限公司；MS-3漩渦混合儀，購自上海巴玖實業有限公司；SHP-80D生化培養箱，購自上海森信實驗儀器有限公司；SN5000SPlus紫外可見分光光度計，購自青島精誠儀器儀表有限公司；TG16G離心機，購自常州市億能實驗儀器廠；HWY-2112B立式雙層恒溫搖床，購自蘇州威爾實驗用品有限公司；G-12K離心機，購自濟南泰醫生物技術有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 生防菌篩選 把采集的9份樣品各取10 g加入裝有90 mL無菌生理鹽水的250 mL三角瓶中，80 ℃、180 r/min水浴加熱60 min，取1 mL菌懸液加入裝有9 mL無菌生理鹽水的試管中，充分振蕩，按此方法進行濃度梯度稀釋。取10、10、10濃度的菌懸液0.1 mL進行平板涂布，每個濃度3次重復。在28 ℃恒溫箱中倒置培養2 d，挑取平板上細菌單菌落劃線純化，將純化的單菌落接種于試管斜面，4 ℃保藏備用。

挑取分離純化的試管菌種接種到LB液體培養基中，28 ℃、200 r/min培養18 h制成種子液。以2%接種量進行發酵液制備，28 ℃、200 r/min發酵 48 h。將發酵液在12 000 r/min離心10 min，上清液用0.22 μm濾膜過濾，取上清液備用。

用2% NaClO溶液對根結線蟲卵囊塊消毒，25 ℃ 恒溫箱中孵化5 d獲得根結線蟲二齡幼蟲。在96孔板上每孔加入30頭根結線蟲二齡幼蟲，同時滴入 200 μL 過濾發酵液，進行毒力測定，每株菌株進行3次重復，并用LB液體培養基對照。25 ℃恒溫培養，24、48、72 h后用顯微鏡觀察根結線蟲的存活狀況。判斷線蟲死亡的標準為針觸碰不動為死亡個體。死亡率計算公式如下：

死亡率=線蟲死亡數/線蟲總數×100%；

校正死亡率=(處理線蟲死亡率-對照線蟲死亡率)/(1-對照線蟲死亡率)×100%。

1.3.2 盆栽試驗 將牛蒡種子在0.2% KMnO溶液種浸泡30 min后，用無菌水洗滌5次。放置于底層鋪滿吸水濾紙的培養皿中萌發。把發芽的牛蒡種子種植在裝有無菌培養土的花盆中，當牛蒡長出4張真葉時，在距根5 cm處灌入10 mL發酵過濾液，5 d后每盆接入含有約3 000頭根結線蟲懸液 3 mL，同時用0.5%阿維菌素進行比較，對照組接入5 mL無菌水，每個菌株設置3次重復。溫室大棚中培養50 d，拔出牛蒡植株，用無菌水反復沖洗根部，統計根結數量。根據文獻[14]，確定根結指數和防治效果。

1.3.3 菌株鑒定 把篩選出的菌株在LB培養基平板上培養并觀察菌落形態，革蘭氏染色后進行顯微觀察，并進行生理生化試驗。同時利用細菌總DNA提取試劑盒對篩出的菌株進行基因組提取，采用16S通用引物進行分析比對，利用系統進化分析及分子鑒定軟件Mega 7.0.14進行系統發育進化樹構建。

1.3.4 抗根結線蟲菌株的生防機制研究 取根結線蟲卵囊塊，用1%NaClO溶液表面消毒2 min，用無菌水沖洗3～5次，在25 ℃恒溫箱中培養孵化，用無菌生理鹽水把孵出的二齡幼蟲配成2萬頭/mL懸浮液，備用。

發酵濾液用乙酸乙酯萃取、減壓蒸餾、真空冷凍干燥，制成凍干粉。用去離子水配制成濃度為5、10、15 μg/mL發酵產物溶液，保存于4 ℃冰箱。

在1.5 mL離心管中加入100頭南方根結線蟲二齡幼蟲，同時加入500 μL濃度為5、10、15 μg/mL的發酵產物溶液，在25 ℃恒溫箱中培養，分別于12、24、36、48 h后在離心管中加入1 mL緩沖液于冰浴中勻漿，對照組加入無菌LB液體培養基，4 ℃、12 000 r/min 離心15 min，取上清液。利用相關試劑盒測定發酵濾液對根結線蟲二齡幼蟲體內總糖、總蛋白降解情況，并檢測發酵濾液對南方根結線蟲體內羧酸酯酶、乙酰膽堿酯酶及過氧化氫酶等活性的影響，每個處理3次重復。

2 結果與分析

2.1 生防菌分離篩選結果

從9個鎮牛蒡種植區共篩選出產芽孢的細菌72株，通過制備細菌發酵過濾液作用于南方根結線蟲的卵囊及二齡幼蟲，從表1可以看出，8株細菌的發酵過濾液對南方根結線蟲二齡幼蟲校正死亡率大于65%，其中LB-16菌株的發酵過濾液對線蟲的校正死亡率最高，達到了86.24%，菌株LB-24、LB-07、LB-36、LB-59發酵過濾液對線蟲的校正死亡率>70%，分別達到了80.19%、76.57%、74.83%、71.53%。同時測定了細菌發酵過濾液對南方根結線蟲卵孵化的影響，可以看出，菌株LB-16對線蟲卵孵化抑制率最高達到82.24%，相對應的孵化率為11.75%。孵化抑制率大于75%的菌株還有LB-24、LB-07、LB-36，抑制率分別為76.83%、77.67%、79.96%，對應的孵化率分別為15.37%、14.62%、13.67%。因此，挑選LB-16、LB-24、LB-07、LB-36等4株菌株進行盆栽試驗。

表1 不同細菌發酵濾液對南方根結蟲卵孵化率和二齡幼蟲死亡率的影響

2.2 盆栽試驗結果

從盆栽試驗結果(表2)可以看出，菌株LB-16發酵濾液灌根處理后牛蒡的根結指數較小，防治效果最好，高于0.5%阿維菌素的防治效果。菌株 LB-24 的防治效果為63.58%，菌株LB-07的防治效果為59.92%，防治效果都大于50%。同時，菌株LB-16的株高和鮮質量與CK相比顯著增加。由此可見，菌株LB-16的生防效果最好。

表2 盆栽試驗結果

2.3 菌株LB-16鑒定

菌株LB-16在LB固體培養基上菌落呈白色、不透明，邊緣為不規則圓形，革蘭氏染色呈陽性。從表3可以看出，菌株LB-16與短短芽孢桿菌的生理生化反應具有相同的特征。將菌株LB-16的16S rDNA PCR擴增產物進行瓊脂凝膠電泳檢測，獲得擴增片段大約約 1 500 bp，與原核生物的16S rRNA片段大小相符。把擴增產物回收純化，進行基因序列測定。測序結果在NCBI數據庫中比對，選取重疊率大于98%的菌株構架系統發育樹。從圖1可以看出，短短芽孢桿菌() strain CanS-411(KT580607.1)與菌株LB-16的同源性最近，并處在同一分支中。結合菌株的形態特征、生理生化特征及16S rDNA基因分子鑒定結果，菌株LB-16是和短短芽孢桿菌親緣關系較近的一種芽孢桿菌。

表3 生防菌LB-16生理生化特性

2.4 菌株LB-16生防機制的研究結果

2.4.1 菌株LB-16發酵產物對南方根結線蟲體內總糖含量的影響 由圖2可知，發酵產物處理過的線蟲體內總糖含量明顯低于對照組，并且隨著發酵產物濃度的增加總糖含量逐漸下降，隨著作用時間的延長總糖含量也迅速降低，而對照組的總糖含量隨著線蟲的生長逐漸增加。48 h時，對照組線蟲的總糖含量達到54.16 μg/mL，而15 μg/mL發酵產物處理的線蟲總糖含量只有4.78 μg/mL，前者是后者的11.33倍。說明菌株LB-16的發酵產物具有明顯的抑制南方根結線蟲糖代謝的作用，限制了線蟲體內糖的積累，從而抑制了線蟲的正常生命活動。

2.4.2 菌株LB-16發酵產物對南方根結線蟲體內總蛋白含量的影響 由圖3可知， 經過發酵產物處理過的線蟲總蛋白含量與對照相比明顯降低，隨著發酵產物濃度的增加，總蛋白含量降幅也在增加，隨著作用時間的延長，總蛋白含量逐漸減少，且總蛋白含量變化趨勢和總糖含量變化趨勢基本一致。48 h時，對照組的總蛋白含量達到了 118.24 μg/mL，而15 μg/mL發酵產物處理的總蛋白含量只有 4.58 μg/mL，前者是后者的25.82倍。對照組的總蛋白含量呈上升趨勢， 表明線蟲蛋白質代謝正常，體內蛋白質不斷積累，而試驗組蛋白質代謝受到破壞，體內總蛋白積累明顯減少，影響了線蟲的正常生命活動。

2.4.3 菌株LB-16發酵產物對南方根結線蟲體內乙酰膽堿酯酶活性的影響 由圖4可知，發酵產物處理過的線蟲體內乙酰膽堿酯酶活性相對于對照組受到明顯抑制，隨著發酵產物濃度的增高乙酰膽堿酯酶活性明顯下降。15 μg/mL濃度處理的酶活性最低，基本沒發生變化(24 h時酶活性略有增加)。5 μg/mL濃度處理下酶活和對照組差異不明顯，10 μg/mL濃度處理的乙酰膽堿酯酶活性降幅最大。48 h時，15 μg/mL濃度處理組的酶活性比對照組下降了77.24%，說明菌株LB-16發酵產物能明顯抑制乙酰膽堿酯酶活性，造成根結線蟲神經系統紊亂，從而影響線蟲的正常生命活動。

2.4.4 菌株LB-16發酵產物對南方根結線蟲體內過氧化氫酶活性的影響 由圖5可知，對照組的過氧化氫酶活性隨著時間的延長呈逐漸增加的趨勢，但處理組的過氧化氫酶活性隨著發酵產物濃度的增加和處理時間的延長呈現出明顯的降低趨勢，在12～24 h酶活性降幅較大。15 μg/mL濃度處理組的酶活性最低且基本不隨時間變化而變化，5、10 μg/mL 濃度處理組酶活性下降幅度大致相同。48 h時，15 μg/mL濃度處理組的酶活比對照組下降了84.07%，說明菌株LB-16發酵產物能明顯抑制過氧化氫酶活性，干擾根結線蟲正常代謝，影響線蟲正常的生命活動。

2.4.5 菌株LB-16發酵產物對南方根結線蟲體內羧酸酯酶活性的影響 由圖6可知，對照組的羧酸酯酶活性呈逐漸增加趨勢，且隨著時間的延長，酶活性增幅也在增加。5 μg/mL濃度處理組羧酸酯酶活性比對照組略有降低，但變化幅度較小。10 μg/mL 濃度處理組羧酸酯酶活性比對照組有較大幅度的降低，而15 μg/mL濃度處理組的羧酸酯酶活性最低，且隨時間變化的幅度很小。48 h時，15 μg/mL 濃度處理組酶活性比對照組下降了93.75%，說明菌株LB-16發酵產物能明顯抑制羧酸酯酶活性，降低線蟲正常代謝功能，影響其正常的生命活動。

3 討論

分離和篩選高效生防菌是進行南方根結線蟲生物防治的關鍵，本試驗從根結線蟲發病嚴重并逐漸轉輕的田塊中篩選出72株產芽孢的細菌，通過制備發酵濾液進行根結線蟲卵和二齡幼蟲的毒力試驗，篩選出4株毒力較強的細菌。用篩選出的4株細菌發酵濾液進行盆栽灌根試驗，最終篩選出毒力最強的菌株LB-16，經過形態特征、生理生化特征及基因檢測鑒定為和短短芽孢桿菌親緣關系接近的芽孢桿菌，研究結果豐富了南方根結線蟲的生防資源。

目前，枯草芽孢桿菌()和解淀粉芽孢桿菌在根結線蟲的防治中被廣泛應用，短短芽孢桿菌與枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌親緣關系較近，但短短芽孢桿菌在南方根結線蟲防治研究中卻鮮有報道。目前，對短短芽孢桿菌的研究主要集中在代謝產物抑菌性方面。王潔等以短短芽孢桿菌為研究對象，采用DEAE-52陰離子交換層析等方法對其產生的蛋白進行分離純化及鑒定，發現該蛋白的抑菌譜較廣可抑制常見的植物病害真菌。龔國利等從美國黃石國家公園篩選出1株耐高溫的短短芽孢桿菌，對其發酵產物進行初步研究，發現該物質具有良好的抑菌活性。本研究篩選出的芽孢桿菌LB-16發酵濾液通過盆栽灌根對牛蒡根結線蟲病的防治效果達到73.61%，比市售阿維菌素防治效果高出5.14%，表現出較強的根結線蟲生防潛力，同時顯著增加了牛蒡的鮮質量和株高。下一步將對菌株LB-16的發酵產物用于牛蒡大田中根結線蟲的防治進行研究，為開發該菌株的牛蒡生物有機肥提供理論及實踐依據。

本研究結果表明，芽孢桿菌LB-16的發酵產物能夠顯著降低南方根結線蟲二齡幼蟲的乙酰膽堿酯酶、過氧化氫酶以及羧酸酯酶的活性。乙酰膽堿酯酶活性的降低，能夠破壞根結線蟲的神經傳遞，抑制了線蟲的活動能力。同時，乙酰膽堿酯酶是一些農藥如有機磷類的靶標酶，羧酸酯酶是許多藥物的解毒酶，芽孢桿菌LB-16誘導的靶標酶和解毒酶與許多農藥的靶標酶和代謝酶系是一致的，這與楊秀娟等研究的3種植物乙醇提取物對南方根結線蟲卵囊酯酶活性影響的研究結果一致。過氧化氫酶是根結線蟲體內重要的抗氧化保護酶，所以芽孢桿菌LB-16的發酵產物能夠抑制抗氧化保護酶正常的酶促反應，進而導致南方根結線蟲活性降低甚至死亡。同時，研究還發現，短短芽孢桿菌LB-16的發酵產物可以明顯降低根結線蟲二齡幼蟲體內總糖和總蛋白含量。糖和蛋白質是根結線蟲體內維持生命的重要組成物質和功能成分，糖類在根結線蟲體內是重要的信息傳遞物質，線蟲的化學感受器中含有大量的糖類，糖類含量的降低會影響線蟲的趨化性，而蛋白質是線蟲身體的重要組成物質及生命過程調控物質，特別是線蟲體表角質層的重要組成成分，增加了線蟲的抗逆性。因此，芽孢桿菌LB-16的發酵產物可能通過干擾根結線蟲糖和蛋白質代謝進而殺死線蟲。接下來將把芽孢桿菌LB-16和其他根結線蟲生防菌配合使用，以提高對南方根結線蟲的防治效果，減少農藥對生態環境的破壞。

4 結論

本研究從牛蒡種植根結線蟲病高發田塊中分離篩選得到產芽孢的細菌，通過離體毒力測定和盆栽灌根試驗獲得高效生防菌株LB-16，利用形態學、生理生化特性及基因檢測方法將其鑒定為與短短芽孢桿菌()親緣關系較近的一種芽孢桿菌，并初步研究了菌株LB-16對南方根結線蟲的作用機制，結果表明，用菌株LB-16的發酵產物凍干粉溶液處理南方根結線蟲，隨著濃度的增加，明顯降低了線蟲體內總糖和總蛋白含量，同時明顯降低了乙酰膽堿酯酶、過氧化氫酶和羧酸酯酶的活性，可以為牛蒡南方根結線蟲病的生物防治提供依據。