番茄根際產生長素菌株分離及其對番茄和馬鈴薯幼苗的促生作用

何宏濤， 王玉虎， 周洪友， 劉 穎， 趙明敏， 鄭紅麗

(1.內蒙古農業(yè)大學園藝與植物保護學院，內蒙古呼和浩特 010019； 2.鄂爾多斯生態(tài)環(huán)境職業(yè)學院，內蒙古鄂爾多斯 017010)

植物根際促生長細菌(PGPR)是存在于植物根際并促進植物生長的細菌。生物菌肥能促進土壤養(yǎng)分的釋放，改善土壤結構，肥沃土壤，在植物根部大量生長繁殖，成為優(yōu)勢菌，產生屏障效應，增強植物的抗病性和抗逆性。同時，這些細菌的一些代謝產物可以促進植物的生長發(fā)育。已有研究表明，一些微生物能產生生長素(IAA)和1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(ACC)脫氨酶，乙烯生物合成的前體是ACC，ACC可被1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸脫氨酶降解，從而減少乙烯合成，在提高植物對非生物脅迫方面起到重要作用。 生長素調控著植物生長發(fā)育的各個方面，可以促進植物生長發(fā)育，調節(jié)光合作用等。還有一類微生物可以將土壤中的難溶性磷分解，轉化為植物可以吸收利用的可溶性磷，即解磷菌。

細菌產生長素功能于1979年首次被發(fā)現(xiàn)，后出現(xiàn)大量的關于生長素產生菌的報道，已有研究中發(fā)現(xiàn)，有多個菌屬具有產生長素的特性。近年來，為了提高作物產量和品質，生產者在生產過程中大量使用化肥和農藥，破壞土壤結構，降低土壤肥力，破壞生態(tài)環(huán)境。生物菌肥越來越受到人們的關注。植物根際促生菌對多種植物具有促生作用。劉濤等研究發(fā)現(xiàn)，從番茄組織及根際分離的細菌能促進番茄植株的生長。

本研究用不同培養(yǎng)基從番茄根際土壤中分離得到番茄優(yōu)勢細菌，從中篩選能高效分泌生長素、具有解磷作用、對番茄和馬鈴薯具有促生作用的細菌，以期為研制生物菌肥提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 土壤樣品 土壤樣品于2021年4月21日采自內蒙古自治區(qū)呼和浩特市賀新草莓園(40.663 199°N，111.775 257°E)的番茄大田。采用五點式取樣法，將番茄植株整株拔起，輕輕抖動根際土壤，并用毛刷輕輕刷下根表土壤，裝袋、標號，帶回實驗室進行菌株分離。

1.1.2 培養(yǎng)基配制 LB培養(yǎng)基、阿須貝培養(yǎng)基、蒙金娜無機磷培養(yǎng)基、有機磷卵磷脂培養(yǎng)基、Salkowski顯色液、產蛋白酶培養(yǎng)基等的配制詳情可見參考文獻[11-13]。

1.2 試驗方法

1.2.1 根際土壤細菌的分離 根際土壤細菌的分離純化：稱取5 g土樣置于裝有玻璃珠的三角瓶中，加入45 mL水，在28 ℃160 r/min條件下?lián)u動 30 min，靜置10 min，得土懸液母液，分別稀釋成10、10、10、10、10、10、10倍液，選擇10、10、10、10倍液，涂在LB培養(yǎng)基上，每盤50 μL，每個梯度重復3次，根據(jù)外觀、形態(tài)在28 ℃培養(yǎng)2～3 d后，挑出具有明顯特征的菌落，純化并在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，將分離得到的所有來自番茄土壤中的細菌置于50%甘油中，于-80 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

用無菌牙簽挑取平板菌落在阿須貝無氮培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，28 ℃培養(yǎng)5 d觀察有無菌落生長。

1.2.2 番茄根際土壤產生長素菌株的篩選 采用Salkowski比色法，將純化后的細菌接種于含有-色氨酸(100 mg/L)的LB液體培養(yǎng)基中，在搖床上以28 ℃、180 r/min培養(yǎng)2 d，取50 μL菌液滴于96孔板上，并添加50 μL Salkowski比色液。同時加入-色氨酸培養(yǎng)基和無細菌比色液作為空白對照，加入含生長素的蒸餾水作為陽性對照，在黑暗中靜置30 min。變紅的菌株是產生生長素的菌株。

對具有產生生長素功能的菌株進行定量測定。36 h后，通過分光光度法測定上清液在450 nm處的吸光度，并通過標準曲線確定上清液中生長素的含量。采用分析純的生長素繪制標準曲線。

1.2.3 番茄根際土壤細菌溶磷能力測定 分別在無機磷和有機磷卵磷脂培養(yǎng)基中接種產生長素的菌株。每株菌在28 ℃培養(yǎng)5 d，觀察菌株周圍是否有1個透明的圓圈，以判斷其是否具有解磷的能力。并測量透明環(huán)直徑()和菌落的直徑()，并計算溶磷指數(shù)()。

1.2.4 產生長素菌株對番茄和馬鈴薯幼苗的促生作用 IAA產生菌對番茄幼苗促生作用測定方法：挑選飽滿的種子浸種30 min，將濾紙片浸濕，放入干凈的培養(yǎng)皿中，28 ℃放置1～2 d，挑選出芽的種子進行播種。播種后1周，挑選生長均勻的植株采用灌根法接種產生長素的7株菌(FQD13、FQD16、FQD32、FQD42、FQD47-2、FQD58-1、FQD59)，每組處理6次重復，以清水處理為空白對照，不產生長素的菌株4FQD6#為陰性對照。將菌株接種于LB培養(yǎng)基，28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng) 2 d，進行灌根。每株番茄每10 d灌菌液10 mL，共3次。30 d后觀察番茄植株生長情況，分別測定其株高、地上部分干質量以及鮮質量，分析不同產生長素菌株對番茄生長的影響。

IAA產生菌對馬鈴薯幼苗的促生作用測定方法：以產生長素濃度高的菌株FQD47-2及FQD13為供試菌株，研究其對馬鈴薯幼苗的促生作用。馬鈴薯播種于基質土中，出苗后7 d，挑選長勢均勻的馬鈴薯采用灌根法接種菌液300 mL(菌液制備與番茄促生研究方法一致)，以清水處理為空白對照，LB培養(yǎng)基處理為陰性對照，每個處理6次重復，25 d后測量不同處理組植株的各項指標。

1.2.5 菌株FQD47-2產蛋白酶能力的測定 挑取少許菌落接種于蛋白酶篩選培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng) 1 d 觀察能否產生透明圈。

1.2.6 菌株FQD47-2的形態(tài)觀察及生理生化鑒定 參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》及已鑒定完成的菌株，對菌株進行生理生化鑒定，包括革蘭氏染色、V—P試驗、檸檬酸鹽利用試驗、丙酸鹽利用試驗、-木糖利用試驗、-阿拉伯糖利用試驗、-甘露醇利用試驗、明膠液化、硝酸鹽還原、淀粉水解等生理生化測定。

1.2.7 菌株FQD47-2的16S rDNA基因序列測定及系統(tǒng)發(fā)育樹構建 細菌全基因組序列提取試劑盒提取細菌DNA后，采用細菌通用引物7F-1540R進行PCR擴增，反應體系(25 μL)為：r-0.125 μL、dNTP 2 μL、10×buffer 2.5 μL、引物各 1 μL、DNA模板1 μL、ddHO補足，反應程序：98 ℃ 3 min，98 ℃ 10 s、52 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min 40 s、34個循環(huán)，72 ℃ 10 min。對PCR產物進行電泳檢測后，送去北京六合華大基因科技有限公司測序后得到拼接序列，通過與BLAST數(shù)據(jù)庫中的所有序列進行核苷酸同源性比較，用MEGA 7.0構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 20.0進行單因素方差分析(=0.05)，GraphPad Prism 8對數(shù)據(jù)進行分析和作圖。顯著性差異采用不同字母表示。

2 結果與分析

2.1 番茄根際細菌的分離

采用間接分離法從番茄品種金妃根際土壤中分離得到79株細菌。在無氮培養(yǎng)基中劃線培養(yǎng)，64株菌株能生長正常。

2.2 番茄根際細菌產生長素研究

采用Salkowski比色法測定64株在阿須貝培養(yǎng)基上能正常生長的細菌分泌的生長素含量。結果表明，64株細菌中有7株具有分泌生長素的能力，占總數(shù)的10.9%(圖1)。由圖2可知，不同菌株分泌的生長素含量不同。供試菌株產生長素含量在(2.55±0.08)～(15.64±0.14) μg/mL之間。菌株FQD47-2分泌生長素的能力最強，為(15.64±0.14) μg/mL；菌株FQD58-1分泌生長素的能力最弱，為(2.55±0.08) μg/mL。

2.3 番茄根際菌株溶磷能力研究

為進一步研究番茄根際菌株的溶磷能力，將7株番茄根限細菌用牙簽點接于有機磷及無機磷培養(yǎng)基上，觀察有無透明圈產生。結果表明，7株產生長素菌株在無機磷培養(yǎng)基上均無透明圈產生，5株菌株(FQD47-2、FQD13、FQD42、FQD16、FQD59)具有解有機磷能力(圖3和表1)。

2.4 番茄根際細菌對番茄及馬鈴薯幼苗的促生作用

以分泌生長素的7株番茄根際細菌為供試菌株，采用溫室盆栽方式，研究其對番茄幼苗的促生作用。從圖4和圖5可以看出，供試菌株對番茄幼苗有不同程度的促生作用。與空白對照相比，處理組FQD16、FQD47-2、FQD32、FQD58-1、FQD59、FQD42的番茄幼苗植株長勢較好，顯著高于空白對照(<0.05)，其增長率分別為14.92%、16.87%、18.23%、10.05%、9.74%、9.39%。植株鮮質量統(tǒng)計結果表明，7株處理植株都高于對空白對照，地上部分鮮質量增幅最高的為FQD47-2，達到了67.14%，菌株FQD32、FQD42的增幅分別為57.44%、23.00%，地下部分鮮質量僅有FQD47-2菌株顯著高于空白對照，增幅為29.58%。

表1 各菌株溶磷能力測定結果

以分泌生長素含量高的菌株FQD47-2和FQD13為供試菌株，采用溫室盆栽灌根法研究其對馬鈴薯幼苗的促生作用。從圖6和表2可以看出，與空白對照相比，F(xiàn)QD47-2和FQD13菌株處理對馬鈴薯幼苗均具有促生作用，地上部分長度差異達到顯著水平，分別增長了21.26%、22.77%。地上部分及地下部分鮮質量結果表明，F(xiàn)QD47-2和FQD13菌株處理均高于空白對照，地上部分鮮質量分別增加17.64%、16.15%，地下部分鮮質量分別增加15.26%、5.72%。地上、地下部分干質量統(tǒng)計結果表明，菌株FQD47-2處理的馬鈴薯幼苗都高于空白對照組，地上部分干質量增加了12.71%，地下部分干質量增加了15.00%，菌株FQD13處理的馬鈴薯幼苗干質量與對照相比沒有明顯變化。

表2 番茄根際產生長素細菌對馬鈴薯幼苗的促生作用

2.5 菌株FQD47-2產蛋白酶能力測定

把菌株FQD47-2接種于蛋白酶篩選培養(yǎng)基上，結果顯示，28 ℃培養(yǎng)24 h后有透明圈產生，證明菌株FQD47-2具有產蛋白酶能力(圖7)。

2.6 菌株FQD47-2的形態(tài)特征及生理生化鑒定

菌株FQD47-2的菌落形態(tài)特征為表面光滑、濕潤、乳白色、邊緣整齊(圖8)。參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》及已鑒定完成的菌株，選取部分生理生化指標對菌株FQD47-2進行測定，結果見表3。

表3 菌株FQD47-2的生理生化鑒定結果

2.7 菌株FQD47-2的16S rDNA基因序列鑒定與系統(tǒng)發(fā)育樹構建

為進一步明確菌株FQD47-2的分類地位，通過7F和1540R引物對其16S rDNA序列進行PCR擴增，獲得的片段大小符合預期(圖9)。通過測序進行序列比對，構建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)菌株FQD47-2與阿氏芽孢桿菌()的親緣關系較近并聚為一支(圖10)，結合形態(tài)鑒定及生理生化鑒定結果，確定菌株FQD47-2是阿氏芽孢桿菌。

3 結論與討論

土壤微生物的豐度和種類反映了土壤狀況的好壞，而自生固氮菌的數(shù)量可以反映土壤肥沃程度。氮素是植物生長發(fā)育必不可少的營養(yǎng)元素之一，固氮菌能夠產生固氮酶，可以固定空氣中的分子態(tài)氮，還原轉化為植物可以吸收利用的形態(tài)，從而促進植物生長發(fā)育。促生菌種類有很多，根據(jù)其來源分為根際促生菌和植物內生促生菌，本試驗通過選擇性培養(yǎng)基，從番茄根際土壤中通過阿須貝培養(yǎng)基初步篩選得到64株細菌，已有研究表明，一種促生菌同時具有多種功能作用。陳陽從水稻根系分離得到23株內生固氮細菌，5株擴增出基因，平板篩選得到1株具有抑制多種病原菌活性的菌株。

現(xiàn)已有大量關于固氮菌的分離報道，研究表明，植物促生菌對植物的促生效用是多方面的，如固氮、溶磷、分泌生長素。解磷菌是指能將植物難以吸收利用的磷轉化為可吸收利用磷的土壤微生物。崔偉國等從馬鈴薯根際土壤及葉片中分離得到78株細菌，采用Salkowski比色液顯色法篩選得到58株產生長素菌株，其分泌量在 0.80～40.2 μg/mL之間。本研究從64株細菌中篩選得到7株分泌生長素的細菌，36 h后分泌量在(2.55±0.08)～(15.64±0.14) μg/mL之間，低于其他文獻報道的菌株分泌量。7株分泌生長素菌株中的5株具有降解有機磷的能力。根際促生菌分泌生長素能夠促進植物生長發(fā)育，提高植物生物產量。邢芳芳等從番茄根際土壤中分離得到12株產生長素菌株，復篩得到1株高產生長素菌株，通過發(fā)酵液盆栽灌根，結果表明，HB-1處理組的葉綠素含量和葉片數(shù)均高于清水對照組，鮮質量和干質量均比空白對照增加，鮮質量增幅達1.16%和13.55%，差異達到顯著水平，干質量增幅達到2.97%和14.92%。本試驗通過盆栽灌根法研究菌株FQD47-2對番茄和馬鈴薯幼苗的促生效果，結果表明，菌株FQD47-2對番茄和馬鈴薯的株高、根長、地下部分鮮質量和地上部分鮮質量具有顯著的促生長作用。說明菌株FQD47-2具有良好的促生潛力，本試驗結果可為生物肥料的研制提供參考。