基于近紅外光譜法的綠豆淀粉和蛋白質(zhì)無損快速檢測

黃 璐， 王富豪， 郭魯平， 張曉燕， 袁星星， 薛晨晨， 陳 新

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，江蘇南京 210014； 2.南京財經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇南京 210095；3.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013)

綠豆(L.)又稱青小豆、植豆，起源于亞洲東南部。綠豆是我國主要的雜糧作物，其營養(yǎng)和經(jīng)濟(jì)價值較高。在我國栽培歷史長達(dá)2 000多年，主產(chǎn)區(qū)在東北、長江下游及黃淮河流域，其適應(yīng)性廣、抗逆性強(qiáng)的特點(diǎn)，成為產(chǎn)區(qū)農(nóng)民致富的主要經(jīng)濟(jì)作物。綠豆具有清熱、解毒等功效，經(jīng)加工可制成具有藥食同源功效的食材，如綠豆湯、綠豆糕、綠豆餅等，其味道香甜、口感松軟，老少皆宜，同時還具有解毒、降低膽固醇、抗腫瘤和抗炎等生物學(xué)功能。綠豆?fàn)I養(yǎng)豐富，最主要的成分是淀粉，籽粒中淀粉含量約為50%，主要分為抗性淀粉和非抗性淀粉。其中，抗性淀粉可為人類帶來理想的生理健康益處，如降血糖、降低膽固醇和甘油三酯等作用。綠豆淀粉具有熱黏度高、易回生等特性，常被用來制做粉絲、粉皮等。綠豆中蛋白質(zhì)含量(25%～28%)僅次于淀粉，高于其他常見谷物，是小麥面粉的2.3倍、玉米面的3.0倍、大米的3.2倍、小米的2.7倍，且綠豆蛋白富含賴氨酸、亮氨酸和蘇氨酸3種必需氨基酸，尤其是賴氨酸水平接近雞蛋，是優(yōu)質(zhì)的植物蛋白來源。

綠豆中淀粉含量的測定通常采用酶水解法和酸水解法，蛋白質(zhì)可通過凱氏定氮法、分光光度法或燃燒法進(jìn)行檢測。常規(guī)化學(xué)分析方法用于農(nóng)產(chǎn)品和食品品質(zhì)檢測通常費(fèi)時、費(fèi)力且成本高。近紅外光(NIR)是一種電磁波，其波長介于可見光(VIS)與中紅外光(IR)之間，近紅外譜區(qū)為780～2 500 nm，對C—H、N—H、O—H等基團(tuán)的振動有強(qiáng)烈的感應(yīng)。近紅外光譜技術(shù)是基于譜區(qū)內(nèi)所包含的物質(zhì)信息，快速對有機(jī)物質(zhì)進(jìn)行定性和定量的物理檢測技術(shù)。因其操作簡便、快捷、成本低、無試劑污染等特點(diǎn)而被廣泛研究和應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、石油化工等各個領(lǐng)域。Plans等采用近紅外光譜技術(shù)對菜豆皮營養(yǎng)品質(zhì)性狀進(jìn)行模型建立，通過模型準(zhǔn)確預(yù)測豆皮中的膳食纖維、糖醛酸、灰分、鈣和鎂的含量，大大縮短了實(shí)驗(yàn)時間，為育種和品質(zhì)質(zhì)量提供了重要的檢測工具。Wang等采用近紅外光譜建立了可快速而準(zhǔn)確地預(yù)測蠶豆淀粉、蛋白質(zhì)、油分和多酚含量的模型。此外，近紅外技術(shù)已廣泛應(yīng)用于大豆、油菜、大麥等作物的品質(zhì)育種中。在美國，近紅外被官方認(rèn)可用于商業(yè)貿(mào)易中分析大豆中主要成分，但對綠豆主要化學(xué)成分的預(yù)測缺少商業(yè)化模型。

本研究基于筆者所在課題組保存的大量綠豆資源，參考多年種植的數(shù)據(jù)報告(在省內(nèi)多點(diǎn)開展種植和農(nóng)藝性狀調(diào)查)，篩選出100份綠豆核心資源作為試驗(yàn)材料，利用化學(xué)方法測定綠豆淀粉(酸水解法)和蛋白質(zhì)(凱氏定氮法)含量，基于近紅外技術(shù)建立快速檢測模型，用于綠豆育種中蛋白質(zhì)和淀粉含量的無損檢測，以期為綠豆資源的進(jìn)一步快速測定和利用提供技術(shù)支撐，實(shí)現(xiàn)綠豆資源的快速評價，提高育種效率。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器設(shè)備

試驗(yàn)材料：供試的綠豆品種(系)由筆者所在實(shí)驗(yàn)室收集并保存，挑選了品質(zhì)、產(chǎn)地、色澤存在較大差異的100份資源于2020年6月種植于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院六合實(shí)驗(yàn)基地，2020年9月收獲。2020年10月至2021年5月期間進(jìn)行綠豆淀粉和蛋白質(zhì)無損快速檢測研究，試驗(yàn)地點(diǎn)為江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所。本試驗(yàn)所需試劑均為分析純，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

儀器設(shè)備：Matrix-I傅立葉紅外變換光譜儀，購自德國BRUKER公司；K-370全自動凱氏定氮儀，購自瑞士BUCHI公司；Grinder-96高通量組織研磨儀，購自騁克儀器(上海)有限公司；Spark 10M純水儀，購自四川優(yōu)普超純有限公司；AR223CN電子天平，購自奧豪斯儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 綠豆淀粉及蛋白含量測定 淀粉含量根據(jù)GB 5009.9—2016中酸水解方法進(jìn)行測定，蛋白含量根據(jù)凱氏定氮法(GB 5009.5—2016)測定。

1.2.2 樣品近紅外光譜數(shù)據(jù)的采集 對100份綠豆樣品在波長800～2 500 nm(4 000～12 000 cm)范圍內(nèi)進(jìn)行光譜采集，掃描樣品前，將近紅外光譜儀預(yù)熱2 h，以儀器內(nèi)置參比作為背景校正。開啟旋轉(zhuǎn)樣品臺，將綠豆樣品放入旋轉(zhuǎn)樣品池，進(jìn)行綠豆光譜掃描。為降低由取樣所造成的光譜漂移，減小誤差，每份材料重復(fù)裝樣3次進(jìn)行掃描，裝樣時保持樣品的裝載量、表面平整和實(shí)密程度一致。樣品掃描溫度為25 ℃，每個樣品掃描64次，分辨率為8 cm。

1.2.3 近紅外光譜分析模型的建立 根據(jù)3 ∶1的比例，將100份資源分為校正集和驗(yàn)證集，75份樣用于模型建立，25份樣用于模型精度檢驗(yàn)。采用偏最小二乘法(PLS)將化學(xué)方法所得的化學(xué)值與光譜數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)，建立綠豆淀粉和蛋白檢測模型。利用不同的預(yù)處理方法對數(shù)據(jù)優(yōu)化，模型的預(yù)測效果根據(jù)交叉驗(yàn)證決定系數(shù)、交叉驗(yàn)證均方根誤差RMSECV、校正決定系數(shù)、校正均方根誤差RMSEE、外部驗(yàn)證決定系數(shù)和預(yù)測均方根誤差RMSEP等指標(biāo)確定最優(yōu)模型。

1.3 數(shù)據(jù)分析

綠豆淀粉和蛋白含量測定單項(xiàng)試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。采用OPUS 6.5軟件建立近紅外光譜與標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)值之間的數(shù)學(xué)模型，并通過預(yù)測集對近紅外模型的準(zhǔn)確度進(jìn)行評價，同時采用OriginPro 8軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠豆近紅外光譜圖

100份整粒綠豆樣品的近紅外原始光譜圖，見圖1。由圖1可知，綠豆在波段12 000～4 000 cm范圍內(nèi)存在多個吸收峰，不同樣品近紅外光譜圖變化趨勢總體一致，但在近紅外的吸光度有較大差異，有利于建模。近紅外譜區(qū)主要包含2 000 cm以上的基團(tuán)信息，可檢測樣品中的C—H、N—H、O—H、S—H等基團(tuán)振動及光譜疊加吸收，這些基團(tuán)是有機(jī)物的重要組成元素，如淀粉和蛋白質(zhì)。

2.2 綠豆淀粉和蛋白質(zhì)化學(xué)分析結(jié)果

采用傳統(tǒng)化學(xué)分析方法對100份綠豆中淀粉(酸水解法)和蛋白質(zhì)(凱氏定氮法)含量進(jìn)行分析測定，由表1、表2可知，樣品中淀粉含量范圍為40.88%～53.62%，蛋白質(zhì)含量范圍為20.17%～27.38%，淀粉和蛋白質(zhì)含量的平均值分別為47.36%和23.36%。本研究所用的綠豆資源，是通過比較品質(zhì)、產(chǎn)地、色澤等相關(guān)性狀，挑選了存在較大差異的100份資源。淀粉和蛋白的化學(xué)測定結(jié)果與前人相關(guān)報道相比，有更廣泛的區(qū)間，涵蓋了綠豆種質(zhì)淀粉和蛋白質(zhì)含量廣泛的分布范圍。品種的多樣性導(dǎo)致蛋白質(zhì)和淀粉含量的差異性，數(shù)據(jù)具有較寬的變幅，適合用于近紅外分析模型的建立，有較好的適用性。

表1 綠豆淀粉和蛋白質(zhì)含量

表2 綠豆淀粉和蛋白質(zhì)化學(xué)含量分布

2.3 模型的建立與優(yōu)化

使用OPUS軟件，通過偏最小二乘法(PLS)統(tǒng)計方法，考察了不同光譜預(yù)處理和譜區(qū)范圍對近紅外模型的影響。通過選擇信息相關(guān)性最大的譜區(qū)，選擇減少光譜基線偏移、漂移、增加信息量、穩(wěn)定可靠的光譜預(yù)處理方法，對于綠豆樣品近紅外數(shù)學(xué)模型的精確度是非常重要的。利用軟件的功能和大量的譜區(qū)組合選擇，優(yōu)化出所需的最佳光譜預(yù)處理方法和譜區(qū)范圍，從對比驗(yàn)證的統(tǒng)計結(jié)果中選擇最優(yōu)的光譜預(yù)處理方法和譜區(qū)范圍用于建立模型(表3)。對于綠豆淀粉，采用無光譜預(yù)處理，譜區(qū)范圍11 772.2～7 498.4、6 102.1～4 597.8 cm效果最佳。對于綠豆蛋白，采用一階導(dǎo)數(shù)+MSC，譜區(qū)范圍 9 403.9～6 094.4、4 605.5～4 242.9 cm光譜預(yù)處理效果最好。由圖2可知，為通過一階導(dǎo)數(shù)+MSC方式處理后的近紅外光譜，與蛋白質(zhì)相關(guān)信息集中在9 403.9～6 094.4和4 605.5～ 4 242.9 cm波數(shù)，表明綠豆樣品間的差異主要來源于此范圍內(nèi)。

通過交叉驗(yàn)證，比較不同光譜預(yù)處理和譜區(qū)范圍組合的交叉驗(yàn)證決定系數(shù)、交叉驗(yàn)證均方根誤差RMSECV等參數(shù)，確定綠豆淀粉和蛋白最優(yōu)模型。由圖3和表3可知，對于綠豆淀粉來說，在無光譜預(yù)處理?xiàng)l件下，交叉驗(yàn)證決定系數(shù)為0.926 9，交叉驗(yàn)證均方根誤差RMSECV為0.658，模型效果最佳。對于綠豆蛋白質(zhì)來說，采用一階導(dǎo)數(shù)+MSC建立的模型效果最佳，交叉驗(yàn)證決定系數(shù)為 0.934 1，交叉驗(yàn)證均方根誤差RMSECV為0.384。不同光譜預(yù)處理和譜區(qū)范圍對不同營養(yǎng)成分的信息貢獻(xiàn)不同， 不同成分近紅外模型的最佳光譜預(yù)處理方法和譜區(qū)范圍也不同，每一種營養(yǎng)成分近紅外模型的建立都需要單獨(dú)分析和單獨(dú)優(yōu)化，才能建立合適的近紅外模型。

表3 綠豆淀粉和蛋白質(zhì)模型優(yōu)化

2.4 綠豆淀粉和蛋白質(zhì)模型外部驗(yàn)證與評價

本研究選用的100份綠豆資源中75份樣品為校正集，25份為驗(yàn)證集。為驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確性，采用未用于建模的、完全獨(dú)立的且化學(xué)值已知的驗(yàn)證集中的25份資源對所建模型的精確度進(jìn)行評價。由圖4可知，剩余25份綠豆種質(zhì)資源對預(yù)測模型進(jìn)行外部驗(yàn)證的散點(diǎn)圖，發(fā)現(xiàn)淀粉外部驗(yàn)證決定系數(shù)為0.935 1(圖4-a)，預(yù)測均方根誤差RMSEP為0.743，蛋白外部驗(yàn)證決定系數(shù)為0.921 2(圖4-b)，預(yù)測均方根誤差RMSEP為0.31，模型預(yù)測效果較好，近紅外光譜預(yù)測值與真實(shí)數(shù)值基本一致，滿足檢測結(jié)果，能滿足近紅外用于綠豆淀粉和蛋白質(zhì)的無損快速檢測。

3 討論與結(jié)論

淀粉和蛋白質(zhì)是綠豆中主要的營養(yǎng)物質(zhì)，分別占40.88%～53.62%和20.17%～27.38%，傳統(tǒng)化學(xué)分析方法是用來測定綠豆淀粉和蛋白的常用方法，但化學(xué)分析方法通常較為耗時，需要昂貴的化學(xué)試劑、專門的檢測設(shè)備和熟練的分析人員。本研究選用100份綠豆資源用于近紅外數(shù)學(xué)模型的建立，按3 ∶1比例劃分為校正集(75份樣品)和驗(yàn)證集(25份樣品)，通過不同的光譜預(yù)處理方法對淀粉和蛋白質(zhì)的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行優(yōu)化。采用無光譜預(yù)處理和譜區(qū)范圍11 772.2～7 498.4、6 102.1～4 597.8 cm得到最優(yōu)的淀粉數(shù)學(xué)模型，交叉驗(yàn)證均方根誤差為0.658，交叉驗(yàn)證決定系數(shù)為0.926 9。采用一階導(dǎo)數(shù)+MSC預(yù)處理和譜區(qū)范圍9 403.9～6 094.4、4 605.5～4 242.9 cm得到最優(yōu)的蛋白質(zhì)數(shù)學(xué)模型，交叉驗(yàn)證均方根誤差為0.384，交叉驗(yàn)證決定系數(shù)為0.934 1。通過外部檢驗(yàn)方法對綠豆淀粉和蛋白質(zhì)的光譜模型進(jìn)行檢驗(yàn)，淀粉和蛋白外部驗(yàn)證決定系數(shù)分別為0.935 1和0.921 2，模型預(yù)測效果較好。模型涵蓋了綠豆種質(zhì)淀粉和蛋白質(zhì)含量的廣泛檢測分布范圍，有較好的適用性。綠豆淀粉和蛋白質(zhì)近紅外模型的建立可快速完成對育種材料的品質(zhì)測定與分析，極大地縮短檢測時間，減小了工作量，且結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，可實(shí)現(xiàn)對綠豆資源的快速鑒定與評價，對提高育種效率具有一定意義。