鐵死亡相關基因在骨性關節炎患者滑膜組織的表達及基因組調控機制研究

王煥煥，張浛柏，牛泰，張磊磊，韓莉欣，毋瑞朋，熊詠民，史傳道，劉啟玲，張榮強*

（1. 陜西中醫藥大學醫學技術學院，陜西 咸陽 712046；2. 陜西省衛生健康委員會疾病控制處，陜西 西安 710003 ；3.西安交通大學醫學部，陜西 西安 710061；4. 西藏民族大學醫學部，陜西 咸陽 712082；5. 陜西中醫藥大學公共衛生學院，陜西 咸陽 712046）

0 引言

骨性關節炎（Osteoarthritis, OA）是一種臨床常見的慢性退行性、進展性關節病，也被稱為退行性關節疾病，常發生于中老年人，且其隨著年齡的增長，關節軟骨老化，軟骨細胞外基質成分以及軟骨細胞信號傳導發生改變，導致軟骨基質發生水丟失，基質金屬蛋白酶(MMPs)產生增加，軟骨細胞出現不可逆性的損傷，骨量丟失以及骨強度減弱，導致OA的發病率不斷增加[1]。流行病學調查顯示世界范圍內，由于人口老齡化趨勢不斷進展，OA新發病例仍然持續增加。目前我國的OA總患病率約為15%[2]，而60歲以上人群中約70%，80歲以上人群約90%均有骨關節炎的放射學表現。OA的患病率居高不下，嚴重影響患者的生活質量，給家庭和社會帶來沉重負擔[3]。雖然OA被認為是一種非炎癥性關節炎，但其發病與年齡、性別、肥胖、運動損傷、自身免疫以及炎癥代謝等因素密切相關，具體發病機制目前仍未闡明[4]，對OA開展機制仍然很有必要。

鐵死亡(Ferroptosis)是一種鐵離子催化致細胞內脂質氧化物代謝異常的新型程序性細胞死亡形式，其主要機制是在二價鐵或酯氧合酶的作用下，催化細胞膜上高表達的不飽和脂肪酸，發生脂質過氧化，從而誘導細胞死亡；此外，還表現為谷胱甘肽GSH和谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）表達水平降低[5]。研究表明，ACSL4和GPX4是乳腺癌新輔助化療患者新的預測和預后生物標志物的臨界值[6]，調控p53基因可誘導內皮細胞和腫瘤細胞鐵死亡，抑制鐵死亡可使GPX4正常發揮作用[1,7]。另外，過表達mi R NA17-92可保護Erastin誘導血管內皮細胞的鐵死亡，并降低lipid-ROS產生與釋放，其調節機制與干涉miRNA17-92的靶分子A20，進而抑制鐵死亡相關蛋白ACSL4密切相關[8]。在骨關節疾病中，鐵超載可以參與炎癥反應、擾亂BMSCs的增殖潛能和分化平衡、損害軟骨細胞的新陳代謝、激發氧化應激反應從而促進軟骨細胞的凋亡、ECM的降解等，導致骨質疏松，軟骨破壞等病理改變[9]。鑒于鐵死亡相關基因及蛋白等發揮的重要作用是否影響OA的發生和發展仍未明確闡述，仍需進一步探討與驗證，故本研究對鐵死亡相關基因在OA患者體內的表達及影響機制展開研究。

本研究將檢索獲得公共數據集GSE160435，利用GraphPadPrism 9, Network analyst, Cytoscape等軟件對數據進行分析，建立蛋白互作網絡(PPI)、基因- miRNA 交互網絡、轉錄因子-基因交互網絡、轉錄因子- miRNA協同調節交互網絡、蛋白質-化學物交互網絡等，全面探討鐵死亡相關基因對OA的網絡調控機制。

1 資料與方法

1.1 資料來源

以“OA”為關鍵詞檢索美國國立生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information,NCBI）GEO數 據 庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），獲得基因芯片數據GSE55457和GSE55235，數據集包含兩組共20例樣本，即OA患者20例，健康對照20例；數據集的檢測標本為滑膜組織。

1.2 數據預處理

首先將數據集GSE55457和GSE55235的原始數據中的錯誤值或可疑值剔除，消除批間差；隨后對原始數據進行Log2CPM(Log2-counts per million)轉化，提高數據的準確性和可靠性。

1.3 鐵死亡相關基因的來源及在OA的表達

本研究所采用的鐵死亡相關基因來自于Liu Z等于2020年發表在iScience的報道，共獲得22個鐵死亡相關的基因。然后下載GSE55457和GSE55235的原始數據，分析22個鐵死亡相關基因在OA的表達變化。采用兩獨立樣本的t檢驗進行分析，P＜0.05差異有統計學意義。

1.4 差異鐵死亡相關蛋白互作網絡的建立

將差異表達的死亡相關基因列表輸入STRING數據庫（https://string-db.org/）建立蛋白互作網絡。首先選擇Minimum Network，然后將Degree Filter調至1，獲取最終的蛋白互作網絡，最后采用Cytoscape進行可視化獲得蛋白互作網絡。

1.5 差異鐵死亡相關基因調控網絡的建立

利用Networkanalyst（http://www.networkanalyst.ca/）軟 件，以TarBase（http://www.tarbase.com/）數據庫為背景建立差異鐵死亡相關基因-miRNA交互網絡；以ENCODE數據庫(https://www.encodeproject.org/)為背景建立轉錄因子-差異鐵死亡相關基因調控網絡，了解miRNA與轉錄因子對差異鐵死亡相關基因的作用關系。

1.6 化學物-差異鐵死亡相關基因交互作用網絡的建立

將差異表達的死亡相關基因列表上傳至CTD(Comparative Toxicogenomics Database)數據庫，以探討環境化學物對差異鐵死亡相關基因的影響作用，采用Cytoscape進行可視化，建立Chemicals-差異鐵死亡相關基因交互作用網絡。

2 結果

2.1 預處理結果

數據預處理后，數據集GSE55457和GSE55235的各樣本基因表達數據均數穩定，分布基本一致，表示數據穩定，不同數據集無批間差，可進行下一步分析（圖1）。

圖1 數據預處理后的各樣本芯片表達箱式圖

2.2 鐵死亡相關基因在OA滑膜組織中的表達

分析結果顯示，22個鐵死亡相關的基因中共有13個在OA滑膜組織中表達異常，其中HSPB1,RPL8, SLC7A11的表達較對照組明顯升高，ACSL4, CARS,CDKN1A, CS, FDFT1,HSPA5,MT1G,NFE2L2, SAT1及TFRC的表達較對照組明顯降低，差異均有統計學意義（P＜0.05），見圖2。

圖2 鐵死亡相關基因在OA滑膜組織中的表達情況

2.3 差異鐵死亡相關蛋白互作網絡

OA滑膜組織13個差異鐵死亡相關蛋白互作網絡顯示，在該網絡中上調蛋白3個，下調蛋白5個，9個預測蛋白；且UBC蛋白與其它蛋白的相互聯系緊密且對整個網絡的穩定性有重要意義，提示UBC蛋白在OA的發生和發展中的作用關鍵，且對鐵死亡機制影響OA的發生發展發揮一定的調控作用，見圖3。

圖3 OA滑膜組織差異鐵死亡相關蛋白互作網絡

2.4 miRNA-差異鐵死亡相關基因交互作用網絡

miRNA-差異鐵死亡相關基因調控網絡顯示，共有10個miRNA與鐵死亡相關基因存在交互作用，其中hsa-mir-335-5p與4個鐵死亡相關基因存在靶向作用關系;SLC7A11與7個miRNA存在靶向作用關系，CDKN1A與5個miRNA存在靶向作用關系，圖4。

圖4 miRNA-差異鐵死亡相關基因調控網絡

2.5 轉錄因子-鐵死亡差異表達基因交互作用網絡

轉錄因子-鐵死亡差異表達基因交互作用顯示，與轉錄因子有作用關系的鐵死亡相關基因有9個，其中有兩個上調基因為HSPB1與RPL8，二者與7個轉錄因子關系密切，其余均為下調基因，CDKN1A與13個轉錄因子關系密切，SMAD5與8個基因關系密切，見圖5。

2.6 轉錄因子-miRNA-鐵死亡差異表達基因交互作用網絡

轉錄因子-miRNA-鐵死亡差異表達基因交互作用網絡顯示，6個miRNAs與鐵死亡相關基因存在交互作用，hsa-miR-144與4個鐵死亡相關基因存在靶向作用關系，見圖5。

圖5 轉錄因子-鐵死亡差異表達基因交互作用

圖6 轉錄因子-miRNA-鐵死亡差異表達基因交互作用分析

2.7 化學物-鐵死亡差異表達基因交互作用

化學物-鐵死亡差異表達基因交互作用網絡顯示，化學物與鐵死亡相關基因的關系復雜，其中Cadmium chlorideb（氯化鎘）、Benzo（a）pyrene（苯并芘）、Aflatoxin b1（黃曲霉毒素b1）、Chloropicrin（三氯硝基甲烷）在網絡中發揮的作用較大，圖7。

圖7 化學物-鐵死亡差異表達基因交互作用網絡

2.8 鐵死亡差異表達基因-疾病交互作用網絡

鐵死亡差異表達基因-疾病交互作用網絡顯示，疾病與鐵死亡相關基因的關系較復雜，CDKN1A和NFE2L2與4種疾病相關，SAT1與3種疾病相關，HSPA5和TFRC與2種疾病相關，FDFT1和HSPB1與1種疾病相關。liver carcinoma(肝癌)與4種鐵死亡相關基因有關，且不同基因與不同疾病或同一疾病有關，圖8。

圖8 鐵死亡差異表達基因-疾病交互網絡

4 討論

本研究通過系統研究，建立OA差異表達鐵死亡蛋白互作網絡顯示：UBC,AKT1為PPI網絡的重要核心節點。泛素綴合酶（UBC）,也稱為E2酶，極少數情況下也稱為泛素載體酶(ubiquitincarrierenzymes)，其執行泛素化反應的第二步。泛素化修飾主要發生在賴氨酸殘基的側鏈，通常是多聚化(多泛素化)過程，且被多泛素化修飾的蛋白質會被蛋白酶體(proteasome)識別然而被降解反應可以通過蛋白酶體降解靶蛋白。AKT/蛋白激酶B信號作用通道可調控細胞增殖和生長，參與包括細胞凋亡和葡萄糖代謝在內的細胞過程，且已有研究人員在人類乳腺癌、結腸直腸癌和卵巢癌中發現了AKT1中的一個突變通過增強其膜聯系作用來激發這種激酶，將AKT1與癌癥的發生直接關聯了起來。由以上研究可推測UBC,AKT1蛋白在降解蛋白、調控細胞生長及細胞凋亡方面有重要的作用。

miRNA-差異鐵死亡相關基因交互作用網絡發現miRNA與鐵死亡基因也存在著聯系。在膝關節炎患者的靜脈血中已發現miR-200-3p,miR-100-5p,miR-1826的表達水平對膝關節骨性關節炎（KOA）有較高的診斷價值[10]。有研究經過對照實驗發現骨關節炎患者血清中 miRNA-98、CTX-Ⅲ蛋白的表達水平明顯高于健康志愿者；而經過治療后骨關節炎患者血清miRNA-98和CTX-Ⅲ蛋白水平均顯著降低，表明CTX-Ⅲ和miRNA-98是骨關節炎的潛在診斷指標[11]。還有研究發現新止骨增生丸能夠通過miR-146a對TGF-β/SMAD信號通路的調控，達到治療膝骨性關節炎的效果[12]，說明從相關miRNA途徑在一定程度上可以治療骨性關節炎的發病，因此可推測miRNA與鐵死亡基因之間也可能存在交互作用。

本研究還發現，SMAD5,ZNF394,ZNF580,ID3,TFDP1等與鐵死亡相關基因之間交互作用復雜，關系密切。SMAD5是miR-338-3p的直接靶點，因此可通過miR-338-3p介導SMAD5的表達，此外，miR-338-3p在體外通過下調SMAD5來調控細胞惡性行為[13]。ZNF394可能是MAPK信號轉導途徑的一個轉錄抑制子，并對人類的心臟發育可能具有重要的調控作用[14]，推測ZNF394對基因表達也具有調控作用。ZNF580參與內皮炎癥，且過表達的ZNF580蛋白通過調控多個基因的轉錄可顯著促進血管生成[15]。ID3證實了β細胞對鐵過載誘導的應力的響應機制[16]。miR-4711-5p通過KLF5、MDM2和TFDP1調控結腸癌細胞的腫瘤干細胞性和細胞周期進程[17]。Jin SL等人研究發現[18]，沉默miR-330-5p通過激活Bgn介導的BMP/Smad通路刺激骨髓間充質干細胞成骨，抑制骨質疏松中的骨丟失，所以TF與miRNA對鐵死亡差異基因的表達可能具有調控作用。

化學物-鐵死亡差異表達基因交互作用，化學物與鐵死亡差異表達基因的關系復雜，氯化鎘、苯并芘、黃曲霉毒素b1、三氯硝基甲烷等對其可產生影響。羅磊等人[19]研究發現，氯化鎘可活化MDCK細胞中的酸性鞘磷脂酶，引發細胞存活率下降，能量代謝障礙，可推測對鐵死亡差異基因的表達產生影響。白藜蘆醇可抑制環境污染物苯并芘誘導的SZ95人皮脂腺細胞炎癥因子IL-1α表達[20]，由此可知苯并芘參與炎癥形成，故可推測其與OA致病相關。此外，黃曲霉毒素B1可誘導F344大鼠腸道炎癥[21]，三氯硝基甲烷通過吸入、食入、經皮吸收，且其蒸氣強烈刺激眼和肺具有全身毒作用損害中、小支氣管導致中毒性肺炎和肺水腫，也發現對OA產生影響。

本研究還發現疾病與鐵死亡的關系比較復雜。肥胖是公認OA的危險因素，其不僅增加機體的機械負重，導致關節軟骨耗損的增加，還與代謝、炎癥、免疫等因素相關。脂肪組織分泌的脂肪因子，可以促進關節滑膜增生、巨噬細胞活化、軟骨分解代謝和髕下脂肪墊的纖維化，進而導致關節破壞的惡性循環[21]。在所有脂肪因子中，瘦素是目前研究最多也最為重要的因子之一。血清中瘦素水平與體質量指數呈明顯正相關，并在晚期OA患者關節軟骨與關節液中，瘦素的水平和活性明顯增高[22]，瘦素在OA的發生發展中起著雙重作用，既能通過促進軟骨細胞產生IL-1β,MMP-9和MMP-13及OA的進展[23]，又能使軟骨細胞免受不良機械應力等有害刺激，延緩軟骨細胞退化，進而抑制軟骨細胞死亡[25]。有實驗研究通過對比發現[26]，肝癌組和模型組小鼠肝臟組織內ROS水平顯著增高，GSH水平顯著下降，肝臟組織p53蛋白及mRNA的表達增高，GPX4,xCT蛋白和mRNA水平顯著降低，還發現化瘀祛痰方可能通過調控p53/xCT/GPX4通路影響肝細胞鐵死亡，減輕肝臟脂質過氧化損傷,從而防治肝癌。另有研究顯示[27]，鐵死亡在不同的肝臟疾病背景下扮演不同角色，鐵死亡的發生可參與多種肝臟炎癥疾病進展，也可抑制肝纖維化形成、肝癌發生及索拉非尼耐藥，故肝癌與鐵死亡差異表達基因有關[28]。鐵死亡與鐵離子代謝、脂質代謝和氨基酸代謝存在密切關聯，且隨著鐵死亡相關分子機制的不斷發展和完善，鐵死亡在腫瘤治療方面也表現出良好的應用前景[29]。

綜上所述，通過本研究發現UBC,AKT1為PPI網絡的重要核心節點;miRNA與鐵死亡基因之間可能存在交互作用且TF與miRNA對鐵死亡差異基因的表達可能具有調控作用；氯化鎘、苯并芘、黃曲霉毒素b1、三氯硝基甲烷等化學物影響OA的發病機制，同時鐵死亡的發生可參與多種臟炎癥疾病進展。