辛伐他汀對奈必洛爾在體內外代謝的影響

王鵬 陳舒 程樟順*

奈必洛爾是β受體阻滯劑，主要通過抗交感神經的過度激活預防心血管疾病的發生[1］。辛伐他汀是羥甲戊二酰輔酶A還原酶抑制劑，在心腦血管疾病防治方面具有廣泛的使用[2］。因此，兩者在臨床中經常聯合使用。辛伐他汀會通過影響藥物代謝酶改變聯用藥物的藥動學特征，進而改變聯用藥物的療效或增加不良反應發生[3-5］。奈必洛爾主要經細胞色素P450 2D6酶（CYP 2D6）代謝，常與聯用藥物發生藥物相互作用[6］。而CYP2D6在辛伐他汀的代謝中也發揮重要作用[7］。這使得兩藥競爭性代謝性相互作用發生的幾率增加。另外奈必洛爾和辛伐他汀均會誘發橫紋肌溶解癥不良反應[8］。本文探討辛伐他汀對奈必洛爾體內外代謝的影響，為臨床合理聯用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 試劑 鹽酸奈必洛爾標準品（2016072401，1g，99%）和酒石酸美托洛爾標準品（F0601A，1g，99%）購于上海創賽生物科技有限公司；4-OH奈必洛爾標準品（H948530，1 mg）購于Toronto Research Chemicals（TRC，加拿大多倫多研究化學）。辛伐他汀標準品為實驗室前期購置。

1.2 動物 健康雄性SD大鼠，體重250～300 g，由溫州醫科大學實驗動物中心提供。本實驗所有動物實驗均通過溫州醫科大學實驗動物倫理委員會和溫州醫科大學實驗動物中心審查。

1.3 儀器 ACQUITY高效液相色譜儀，XEVO TQD三重四極桿質譜儀（沃特世科技有限公司產品）；VORTEX-5渦旋混合器（其林貝爾實驗室儀器有限公司）；TCL-16G高速離心機（上海安亭科學儀器廠）；DKZ-450B型電熱恒溫振蕩水槽（上海森信實驗儀器有限公司）。

1.4 方法 （1）液質聯用（UPLC-MS/MS）分析法：采用ACQUITY UPLC? BEH C18色譜柱（2.1×50 mm，1.7μmol/L），設置柱溫為40℃。0.1%甲酸：乙腈為流動相，設置梯度洗脫：初始0.3 min乙腈為40%，然后0.2 min內乙腈由40%升至95%，0.5～1.3 min間保持95%，接著在0.2 min內乙腈由95%下降至40%，1.5～2.5 min乙腈保持40%，回到初始狀態。流速設置為0.4 mL/min，進樣量為2 μL。整個過程時間為2.5 min。質譜儀電

噴霧接口去溶劑化溫度設置為500℃；氮氣作為洗脫溶氣，洗脫速率為800 L/h。多反應檢測（MRM）方式進行定量分析，奈必洛爾m/z 406.28→151.1，4-OH奈必洛爾m/z 422.3→151.1，美托洛爾m/z 268.12→115.8。（2）體內實驗方法：將24只雄性SD大鼠隨機分成四組，禁食12 h后給藥：A組為對照組，灌胃給予10 mg/kg奈必洛爾；B、C、D組為實驗組，分別給予辛伐他汀1 mg/kg 、4 mg/kg和10 mg/kg，30 min后給予10 mg/kg奈必洛爾。給藥結束后，于0.25，0.5，1，2，3，4，6，8，12，24 h尾靜脈采血0.3 mL到含肝素的離心管中，迅速低溫離心取出血漿并儲存于-80℃超低溫冰箱中。（3）體外孵育方法：通過摸索建立以辛伐他汀為抑制劑，奈必洛爾為底物大鼠肝微粒體體外孵育體系。體系共計200 μL，包含奈必洛爾4.05μL（體系中終濃度為20μmol/L），大鼠肝微粒體10μL，不同濃度的辛伐他汀1.6 μL（體系中終濃度為0.01～100μmol/L），還原型輔酶Ⅱ（NADPH）10μL（體系中終濃度為1 mmol/L）和磷酸鹽緩沖液174.35 mL（體系中終濃度為0.1 mmol/L）。37℃孵育30 min后儲存于-80℃超低溫冰箱中終止反應。每組樣本設置三個平行管。（4）樣品處理方法：從-80℃冰箱取出已終止反應的樣品，加入400 μL乙腈沉淀蛋白，加入500 μg/mL的美托洛爾甲醇溶液25 μL作為內標。待樣品完全融化后，2 min充分渦旋混勻，13,000 r/min快速離心10 min。取上清液100 μL加入到含有100 μL超純水的試管中稀釋，混勻，2 μL用于UPLC-MS/MS進樣檢測。

1.5 統計學方法 采用Origin 8軟件分析各采血點的血藥濃度，根據時間和各時間點奈必洛爾濃度繪制藥時曲線。采用DAS 2.0軟件，選擇非房室模型進行擬合分析，得到大鼠血漿奈必洛爾與4-OH奈必洛爾的藥動學參數。采用SPSS 17.0軟件對主要藥代動力學參數（AUC，MRT，t1/2，Tmax，Vz/F，CLz/F和Cmax）進行統計學分析，比較給抑制劑組和控制組藥物代謝的差異。體外研究采用Graphpad Prism 6軟件處理大鼠肝微粒體體外數據，繪制抑制曲線并計算IC50值。

2 結果

2.1 UPLC-MS/MS方法專屬性 在建立UPLC-MS/MS方法下，各藥物的出峰時間為奈必洛爾1.26 min，4-OH奈必洛爾0.71 min，美托洛爾（內標）0.51 min。各化合物單通道出峰，色譜圖峰型尖銳對稱，血漿樣本檢測未發現干擾化合物，方法具有良好的專屬性。

2.2 辛伐他汀在大鼠體內對奈必洛爾的影響 4組大鼠血漿樣品經處理檢測后繪制的奈必洛爾藥物濃度-時間曲線圖見圖1，藥代動力學參數見表1。其代謝產物4-OH奈必洛爾的藥物濃度-時間曲線圖見圖2，藥代動力學參數見表2。辛伐他汀中劑量組（4 mg/kg）中奈必洛爾的達峰時間與對照組比較差異有統計學意義；低劑量組（1 mg/kg）和高劑量組（10 mg/kg）的達峰時間分別高于對照組50%和87.5%。4組間藥物曲線下面積（AUC）、藥物平均駐留時間（MRT）、半衰期（t1/2z）、表觀分布容積（Vz/F）、清除率（CLz/F）和最大濃度（Cmax）差異無統計學意義。

圖1 4組大鼠中奈必洛爾藥物濃度曲線

表1 奈必洛爾的主要藥代動力學參數表（±s）

表1 奈必洛爾的主要藥代動力學參數表（±s）

參數 A組 B組 C組 D組AUC（0-t）（μg/L·h）2,908.85±932.68 2,804.43±600.02 2,887.23±899.93 3,356.81±1,327.52 AUC（0-∞）（μg/L·h）3,065.18±935.36 3,060.39±857.10 2,959.05±900.31 3,389.96±1,314.06 MRT（0-t）（h） 4.02±0.18 4.03±0.53 4.57±0.48 5.05±1.05 MRT（0-∞）（h） 4.58±0.05 4.34±0.71 4.86±0.49 5.35±1.14 t1/2z（h） 2.63±0.70 2.65±1.28 2.18±0.73 2.64±0.85 Tmax（h） 1.20±0.45 1.80±0.84 4.00±1.27** 2.25±0.50 Vz/FL/（h·kg） 3.50±0.96 3.47±0.93 3.60±0.92 3.25±1.07 CLz/F（L/kg） 13.60±6.14 12.05±3.48 10.62±1.74 12.81±7.77 Cmax（ug/L） 509.70±134.79 483.52±79.91 453.03±109.42 490.92±61.67

圖2 4組大鼠中4-OH奈必洛爾藥物濃度曲線

表2 4-OH奈必洛爾的主要藥代動力學參數表（±s）

表2 4-OH奈必洛爾的主要藥代動力學參數表（±s）

參數 A組 B組 C組 D組AUC（0-t）（μg/L·h）984.65±110.58 896.67±216.18 949.71±130.93 1,038.97±100.75 AUC（0-∞）（μg/L·h）1,110.21±128.03 998.60±328.85 1,011.28±156.05 1,210.49±175.31 MRT（0-t）（h） 8.30±0.38 8.07±0.88 8.03±0.54 8.45±0.37 MRT（0-∞）（h） 11.30±1.99 10.36±2.66 9.67±0.89 12.27±1.70 t1/2z（h） 7.23±1.73 6.52±1.93 5.58±0.93 8.25±1.50 Tmax（h） 2.40±2.07 3.20±1.79 3.50±1.92 2.25±0.50 Vz/FL/（h·kg） 9.10±1.03 10.68±2.54 10.06±1.52 8.38±1.08 CLz/F（L/kg） 94.15±20.70 94.93±6.63 79.97±8.88 98.00±3.45 Cmax（μg/L） 79.85±10.27 72.64±12.43 92.36±14.06 85.71±4.50

2.3 大鼠肝微粒體中辛伐他汀對奈必洛爾的影響 辛伐他汀對奈必洛爾的代謝有明顯的抑制作用，且不同濃度辛伐他汀對奈必洛爾代謝表現出不同程度的抑制。100μmol/L濃度的辛伐他汀在大鼠肝微粒體中對奈必洛爾代謝的抑制率為18.78%，IC50值為12.67μmol/L，見圖3。

圖3 大鼠肝微粒體中不同濃度辛伐他汀對4-OH奈必洛爾生成的抑制作用

3 討論

奈必洛爾主要經過CYP2D6代謝，除此以外還通過CYP2C19和CYP3A4代謝[9-10］。抑制藥物或誘導藥物可能會改變奈必洛爾的藥代動力學。以往報道臨床常用藥物氟伏沙明、丁氨苯丙酮、帕羅西汀、氟西汀等均不同程度影響奈必洛爾及其代謝產物的體內代謝過程，進而對藥物療效的發揮造成影響[11-14］。在本研究中，1～10 mg/kg的辛伐他汀對大鼠體內奈必洛爾代謝未見明顯影響，而體外結果顯示有明顯抑制作用。其原因可能是：（1）辛伐他汀經過CYP3A4和CYP2D6代謝，而奈必洛爾比辛伐他汀多了CYP2C19的代謝途徑，因此兩藥在體內聯用時，奈必洛爾通過CYP2C19代謝途徑可能弱化代謝性相互作用。（2）在研究CYP2D6基因多態性對奈必洛爾代謝影響時，發現在部分CYP2D6變異型中奈必洛爾有自我抑制的現象發生[10］。因此推測奈必洛爾也會抑制CYP2D6，與辛伐他汀合用時主要由奈必洛爾抑制辛伐他汀代謝，而其自身代謝受辛伐他汀影響小。（3）辛伐他汀在人體中的半衰期約4～5 h，奈必洛爾在人體中的t1/2約12～19 h。單次給藥物在體內的吸收速率有差異，抑制劑在發揮作用前已經被代謝，因此需進一步研究多劑量給藥下兩藥相互作用的影響。此外，本實驗樣本量少，具體機制尚未明確，人體中辛伐他汀對奈必洛爾的影響有待于進一步研究。