閩江河口區水體抗生素污染特征及風險評價

劉四光，張樂蒙，黃智偉，陳 嵐，王 鍵，陳 凱

(福建海洋研究所，福建 廈門 361013)

抗生素是由某些微生物或植物產生的，并且能夠干擾和抑制其他生活細胞增殖的一類化學物質，自1929年被發現以來，在世界范圍內得到廣泛的應用。抗生素已經在醫療、農業養殖等領域使用近百年，但直到近十幾年人們才注意到其環境行為及其可能帶來的危害[1]。除制藥廠排放物和醫療廢水外，人類和動物在使用抗生素后并不能完全吸收或代謝，大部分會以原藥或代謝物的形式排出體外[2]。目前，在河流、湖泊、地下水及沉積物等多個環境中均有多種抗生素被檢出[3-5]。持續輸入環境中的抗生素及抗生素抗性基因可能會改變人體微生物群落、降低機體抵抗力，產生潛在的健康風險[6]。

河口是生態敏感區域，通常也是人口密集區。大量陸源污染物通過徑流經河口區，最終進入海洋環境[7]。水體中的抗生素可以通過徑流長距離傳輸，并進行吸附及沉積[8]。同時，沉積物中的抗生素也會通過再懸浮和解吸附作用重新進入水環境中，造成水環境的二次污染，進而對生態環境以及人類健康造成潛在威脅[9]。

閩江是福建第一大河流，全長為 577 km，流域面積為 60 092 km2，約占福建省面積的一半。它向東流經福州，并在江心被南臺島分為南港和北港兩支，兩港在馬尾交匯后，最終流入東海[10-12]。然而閩江福州段為人口聚集區，城市化、工業化程度較高，導致各類型排污口交錯分布于河口下游，對閩江口生態環境造成了嚴重威脅。本研究對閩江河口區水體中的9類88種抗生素類污染物進行了分析，為了解閩江河口區抗生素的污染狀況奠定基礎，并可初步評估抗生素污染可能帶來的生態風險。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2018年11月(旱季)和2019年9月(雨季)在閩江河口區域共設置24個站位(圖1)，包括河口上游(MJA22～MJA24，3個站位)、北港(MJA11～MJA16，6個站位)、南港(MJA17～MJA21，5個站位)和河口下游(MJA01～MJA10，10個站位)。采集表層水樣4 L，置于棕色玻璃瓶(重鉻酸鉀洗液及超純水清洗)，4℃避光保存，并及時在實驗室進行樣品預處理和分析。水樣的采集和保存均嚴格按照《海洋監測規范 第4部分：海水分析》(GB 17378.4—2007)[13]和《地表水和污水監測技術規范》(HJ/T 91—2002)[14]中的要求執行。

1.2 儀器與試劑

液相色譜質譜聯用儀(HPLC-MS/MS)(Agilent 6490，美國Agilent)；醋酸纖維膜(0.45 μm，天津津騰實驗設備有限公司)；大體積采樣器(匹配20 mL SPE柱，美國Supelco)；固相萃取裝置(12通道，德國CNW)；真空泵(GM-0.33型，天津津騰實驗設備有限公司)；Oasis HLB柱(1 g/20 mL，美國Waters)；PTFE針筒式濾膜(13 mm×0.22 μm，天津賀世科技發展有限公司)。甲酸、乙腈和甲醇均為色譜純級，其中乙腈和甲醇購自美國Tedia公司，甲酸購自上海Aladdin試劑有限公司；超純水取自Milli-Q Advantage純水機(美國Millipore)；乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA，分析純，上海申博化工有限公司)、二氯甲烷(色譜純，美國Tedia)。

88種抗生素包括23種磺胺類(Sulfonamides，SAs)、17種喹諾酮類(Quinolones，QNs)、9種大環內酯類(Macrolides，MLs)、8種四環素類(Tetracyclines，TCs)、12種β-內酰胺類(β-Lactams，β-Ls)、8種硝基呋喃及其代謝物類(Nitrofurans and metabolites derivatives of nitrofurans，NFs and NPs)、5種非類固醇類(Non-steroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs)、3種氯霉素類(Chloramphenicols，CAPs)、3種硝基咪唑類(Nitroimidazoles，NIZs)。13種替代物包括磺胺噻唑-13C6(Sulfathiazole-13C6，STZ-13C6)、磺胺喹惡啉-13C6(Sulfaquinoxaline-13C6，SQ-13C6)、磺胺二甲氧嘧啶-D6(Sulfadimethoxine-D6，SDM-D6)、磺胺嘧啶-D4(Sulfadiazine-D4，SDZ-D4)、甲氧芐啶-13C3(Trimethoprim-13C3，TMP-13C3)、NP-AOZ-D4、NP-AMOZ-D5、NP-AHD-13C3、氯霉素-D5(Chloramphenicol-D5，CAP-D5)、環丙沙星-D8(Ciprofloxacin-D8，CIP-D8)、諾氟沙星-D4(Norfloxacin-D4，NOR-D4)、恩諾沙星-D5(Enrofloxacin-D5，EF-D5)、噻苯咪唑-D6(Thiabendazole-D6，TBZ-D6)。1種內標物為磺胺噻唑-D4(Sulfathiazole-D4，SAZ-D4)。其中，環丙沙星(Ciprofloxacin，CIP)、諾氟沙星(Norfloxacin，NOR)、恩諾沙星(Enrofloxacin，EF)、氧氟沙星(Ofloxacin，OF)、達氟沙星(Danofloxacin，DAN)、氟甲喹(Flumequine，FQ)、麻保沙星(Marbofloxacin，MB)、沙拉沙星(Sarafloxacin，SR)、惡喹酸(Oxolinic acid，QA)和CAP-D5均購自美國Sigma-Alorich公司；CIP-D8和EF-D5均購自上海安譜實驗科技股份有限公司；SAZ-D4、TMP-13C3、STZ-13C6和SDZ-D4均購自加拿大 Toronto Research chemicals 公司；SQ-13C6、NOR-D4、NP-AOZ-D4、NP-AMOZ-D5和 NP-AHD-13C3均購自德國WITEGA 公司；其他標準品均購自德國Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司。

88種抗生素混合標準溶液配制：分別稱取一定質量的目標抗生素標準品，其中四環素、金霉素、土霉素與尼卡巴嗪溶解于純水中，β-內酰胺類藥品溶解于乙腈-水(1∶1，V/V)中，其他藥品則分別溶解于甲醇中，配制成200.0 mg/L單標儲備液，并于-18°C冰箱中保存。以 含0.1%甲酸(V/V)的甲醇-水(2∶8，V/V)為溶劑將上述抗生素單標儲備液分組配制成實驗所需濃度的混合標準工作液。

13種同位素標記物混合標準溶液的配制：分別稱取一定質量的同位素標準品，以甲醇為定容溶劑，配置成100 mg/L單標儲備液，并于-18°C冰箱中保存。以含0.1%甲酸(V/V)的甲醇-水(2∶8，V/V)為溶劑將上述同位素標準品的單標儲備液配制成實驗所需濃度的替代物混合標準工作液。

1種內標物混合標準溶液的配制：磺胺噻唑-D4的單標儲備液配制與13種同位素標記物相同，最后以含0.1%甲酸(V/V)的甲醇-水(2∶8，V/V)為溶劑將磺胺噻唑-D4配制成實驗所需濃度的內標物混合標準工作液。

各目標抗生素的名稱和分組編號列于附表1。

1.3 預處理與測定

預處理方法及儀器分析方法，參照莊姍姍[15]的研究。量取1 L水樣經0.45 μm濾膜過濾后，加入0.5 g Na2EDTA，并加入替代物，混勻，以4～6 mL/min流速通過已活化HLB柱(依次用20 mL甲醇和6 mL超純水活化)；上柱完畢后以10 mL甲醇-水(5∶95，V/V)淋洗，隨后抽干并依次用8 mL甲醇、8 mL含0.1%甲酸(V/V)的甲醇和6 mL甲醇-二氯甲烷(1∶1，V/V)洗脫；接取洗脫液，置于40℃下氮吹濃縮至干，加入一定量的內標物，用含0.1%甲酸(V/V)的甲醇-水(2∶8，V/V)定容至1.0 mL，經0.22 μm PTFE針頭式過濾器過濾至進樣小瓶中，待HPLC-MS/MS檢測。

質譜參數：電噴霧離子源(Electron spray ionization，ESI)，檢測模式為多反應離子選擇監測(Multiple reaction monitoring，MRM)；鞘氣溫度及流速分別設定為350℃和12 L/min；干燥氣溫度及流速分別設定為300℃和10 L/min，鞘氣和干燥氣均由氮氣發生器提供；霧化氣壓力(Nebulizer pressure)定為241.32 kPa；噴嘴電壓和毛細管電壓分別設為 1 500 V 和4 000 V；碰撞氣使用的是高純氮氣(99.999%)；碎裂電壓為380 V。目標物母離子和子離子以及碰撞能等相關信息見附表1。

液相色譜參數：色譜柱為Phenomenex Kinetex C18柱(2.6 μm×150 mm×3 mm i.d.，Phenomenex，USA)；流動相流速：0.25 mL/min；進樣量：10.0 μL；88種目標物分為ESI+項目和ESI-項目兩組。ESI+項目組的流動相為超純水(A)和含0.1%甲酸(V/V)的乙腈(B1)，梯度洗脫程序為0～2.00 min，B1為10%；2.00～10.00 min，B1從10%升至15%，10.00～12.00 min，B1 15%保持；12.00～14.00 min，B1從15%升至20%，14.00～16.00 min，B1 20%保持；16.01～20.00 min，B1從20%升至25%；20.00～23.00 min，B1從25%升至40%；23.00～27.00 min，B1 40%保持；27.00～34.00 min，B1從40%升至80%；34.00～41.00 min，B1從80%升至90%；41.01～46.00 min，B1為10%。ESI-項目組的流動相為超純水(A)和乙腈(B2)，梯度洗脫程序為0～1.00 min，B2為25%；1.01～5.00 min，B2為45%；5.00～9.00 min，B2從45%升至80%；9.00～12.00 min，B2 80%保持；12.01～16.00 min，B2為25%。

1.4 風險評價

抗生素作為一種新興有機污染物，我國尚未建立針對水環境生態風險評價的國家標準。目前針對抗生素的環境風險評價的研究工作，通常依據歐盟技術指導中關于環境風險評價的方法[16]，Chen H Y等[17]和周志洪等[18]在海河及珠江的研究工作中也采用了該評價方法。風險商(RQ)計算公式如下所示：

RQ=MEC/PNEC

(1)

PNEC=(LC50or EC50)/AF

(2)

式(1)～(2)中，MEC為抗生素測定含量，ng/L；PNEC為預計無效應濃度，ng/L；LC50為半數致死濃度，ng/L；EC50為半數效應濃度，ng/L；AF 為標準評價因子，對于急性毒性數據和慢性毒性數據分別取1 000和100。

同時，考慮到水環境中各類抗生素類污染物共存的實際情況，本研究采用混合風險商(MHQ)的方法[19-20]對閩江河口區水體多種抗生素共存所產生的危害進行了評價。

(3)

式(3)中，i為第i種抗生素，i=1，2，…，n；ECxalgae：以藻類為測試生物的效應濃度，ng/L；ECxdaphnids：以蚤類為測試生物的效應濃度，ng/L；ECxfish：以魚類為測試生物的效應濃度。風險評價相關參數見附表2。通常將生態風險程度劃分為3個級別：當RQ或MHQ<0.1時，表示低生態風險；當0.1≤RQ或MHQ<1.0時，表示中等生態風險；當RQ或MHQ≥1.0時，表示高生態風險。

1.5 數據質控

采用內標法定量，并通過全程空白、基底加標實驗、同位素替代物以及基質效應評估等進行質量控制。樣品測定過程中，空白樣品均未檢出目標抗生素；旱季和雨季批次各進行了一次樣品的基底加標回收實驗，在20 ng/L(n=3)和100 ng/L(n=3)加標濃度下，回收率在40%～130%之間且RSD≤30%的目標抗生素分別占總數的95.6%和97.0%；13種同位素替代物中，除氘代氯霉素的回收率略微偏低(在30%～40%之間，基質效應校正后可在80%～100%)外，其余12種同位素的回收率均在40%～130%之間。綜上，認為樣品分析過程的質量控制合格，結果準確可靠。兩批次樣品替代物回收率詳情見附表3。

1.6 數據分析

采用統計分析軟件IBM-SPSS Statistics 22對閩江不同區域(閩江河口上游、北港、南港和下游)抗生素含量的差異進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，并采用Tukey’s檢驗差異的顯著性。采用獨立樣本T-檢驗分析閩江表層水中抗生素總含量的季節性差異。

2 結果與分析

2.1 閩江抗生素類污染物的組成及特征

2.1.1 閩江抗生素類污染物的組成

對旱季和雨季采集于閩江24個站位(圖1)的表層水樣品中的9類88種目標抗生素分別進行了考察，結果共檢出5大類17種抗生素(圖2)，檢出總量范圍為26.31～155.39 ng/L。在旱季，抗生素總量變化范圍在69.22～155.39 ng/L，平均值為123.47 ng/L，標準偏差為24.95 ng/L，共檢出14種，分別為磺胺類8種、大環內酯類2種、喹諾酮類1種、氯霉素類1種、硝基咪唑類2種；而在雨季，抗生素總量范圍為26.31～69.95 ng/L，平均值為47.61 ng/L，標準偏差為12.07 ng/L，檢出10種，分別為磺胺類4種、大環內酯類2種、氯霉素類2種、硝基咪唑類2種。磺胺類、喹諾酮類和大環內酯類污染物含量水平與2017年李文最等[21]在閩江河口上游調查結果處于同一量級，且四環素和β-內酰胺均未檢出，但在本研究中發現氯霉素類是閩江河口水體抗生素類污染物的主要組分。與不同流域抗生素污染情況比較，閩江河口區水體中抗生素污染處于相對較低水平，遠低于海河、珠江(中國)及昆士蘭(澳大利亞)，與長江(南京段)及九龍江含量水平相當，但遠高于瀾滄江(表1)。

表1 國內外不同流域抗生素污染情況

2.1.2 閩江抗生素類污染物的季節差異

對閩江水體抗生素總含量進行季節性差異分析(圖3)，結果顯示旱季抗生素總含量顯著高于雨季(P>0.05)，王若男等[27]對沱江抗生素季節變化的研究也顯示出同樣的變化規律。在旱季各類抗生素檢出占比為氯霉素類(58%)>磺胺類(30%)>大環內酯類(6%)>硝基咪唑類(3%)>喹諾酮類(2%)，且除喹諾酮類(37.5%)外，其他類抗生素檢出率均為100%；在雨季，氯霉素類(61%)>磺胺類(18%)>大環內酯類(13%)>硝基咪唑類(8%)>喹諾酮類(0%)，喹諾酮類抗生素在所有站位中均未檢出，磺胺類、大環內酯類、氯霉素類檢出率均為100%，硝基咪唑類檢出率為79.2%。

磺胺類在旱季和雨季的平均含量分別為36.89 ng/L和8.33 ng/L，相差約3倍，且種類不同。在旱季，磺胺甲惡唑占比為43%，而在雨季，磺胺氯噠嗪占比為39%，磺胺甲惡唑則未檢出。水環境中的磺胺類污染物具有高度穩定性，對水生生物特別是胚胎及幼體具有明顯的毒性，并可能對其發育造成影響[28]。考察的17種喹諾酮類抗生素中僅萘啶酸在旱季有檢出，平均含量為2.55 ng/L，檢出率為38.0%。大環內酯在旱季和雨季的平均含量分別為7.89 ng/L和6.27 ng/L，含量水平相差不大但組成不同，旱季為紅霉素(43%)和林可霉素(57%)，雨季為紅霉素(95%)和延胡索酸泰妙菌素(5%)。延胡索酸泰妙菌素可用于治療家禽類慢性呼吸道病、家畜支原體肺炎，這兩種大環內脂類抗生素在畜牧養殖中應用廣泛[29]。氯霉素類在旱季只檢出氟甲砜霉素1種，平均含量為71.65 ng/L；在雨季檢出2種，為氟甲砜霉素和甲砜霉素(各50%)，平均含量為29.20 ng/L。氯霉素在農業生產中可以有效治療畜禽類致病革蘭氏陰性菌疾病，但其在環境中極穩定，具有致癌風險[30]。我國在2019年將氯霉素列入食品動物中禁止使用的藥品，但近年來氯霉素類抗生素仍在環境[31]及水產品[32]中被檢出。氯霉素是閩江河口區水體中占比最高的抗生素類污染物，在雨季和旱季所有站位均有檢出，表明其可能仍存在被大量使用的情況，應當引起足夠重視。硝基咪唑類在旱季和雨季均檢出2種，為甲硝唑和二甲硝咪唑，兩季含量水平與組分占比均相近。世界衛生組織(WHO)在2017年將甲硝唑列為2B類致癌物，進入河口環境中的甲硝唑污染物極易溶于水，不易降解，在沉積物中的累積作用顯著[33-34]。雨季和旱季不同類別抗生素在檢出種類和含量水平上表現出較大的差異，其影響因素有很多種，一方面雨季徑流量較大對污染物可能產生較強的稀釋作用，另一方面本研究中檢出的抗生素多用于養殖行業，不同季節養殖過程中抗生素的用量也有較大區別[35-36]。此外，抗生素的光降解和生物降解在不同季節也有著較大的差異[37]。

2.1.3 閩江抗生素類污染物含量的時空變化特征

閩江河口區水體中抗生素類污染物總量的空間分布如圖4所示，從圖中可以看出，旱季與雨季抗生物總量的變化趨勢均不明顯，僅在河口下游呈現出一個下降的趨勢。為進一步討論抗生素總量的空間變化趨勢，本研究對4個區域抗生素總量進行討論，并進行差異性分析，結果見表2。可以看出，在旱季，抗生素總量在閩江不同區域差異不顯著，而在雨季，上游和北港則顯著高于下游區域。河口下游是感潮區域，在漲潮過程中涌入的大量清潔海水起到較強的稀釋作用，污染物濃度梯度下降趨勢明顯。

閩江河口區各類抗生素類污染物含量的時空分布如表2和圖5所示。在旱季，磺胺類呈現出上游顯著高于北港和下游地區(P<0.05)，在雨季則呈現出上游和北港顯著高于南港和下游(P<0.05)，由此可見，閩江河口區域的磺胺類抗生素可能主要來源于上游的輸入。喹諾酮類僅在旱季有檢出，且檢出的站位主要分布在北港以及南北港交匯處，這可能意味著福州的城市輸入是閩江喹諾酮類抗生素的主要來源。大環內酯類僅在雨季表現出南港顯著高于下游，而硝基咪唑類僅在旱季表現出北港顯著高于上游、南港和下游(P<0.05)，這可能是由于在不同季節，這兩類抗生素輸入源有所不同，在雨季，雨水的沖刷可能會使南港區域大環內酯類藥物大量進入閩江南港區域，使其含量顯著高于下游地區；在旱季，北港區域硝基咪唑類抗生素的顯著提高可能是由于旱季閩江徑流量減少，閩江北港區域含有硝基咪唑類抗生素的生活污水排放所致。氯霉素類抗生素因其性質穩定，在旱季和雨季不同區域間抗生素含量差異均不顯著，這說明該類污染物可在河口區域穩定存在。

表2 閩江不同區域表層水中各類抗生素含量

2.2 閩江抗生素類污染物的風險評價

閩江水體中抗生素類污染物的風險評價結果以及聯合風險商見圖6和圖7。從圖6中可以看出，在旱季，磺胺甲惡唑的RQ值在MJA21站位大于1.0，為高生態風險，其余站位均處于中等生態風險；紅霉素(92%站位)和林可霉素(42%站位)RQ值在0.1～1.0范圍，具有中等生態風險；在雨季，紅霉素(75%站位)RQ值在0.1～1.0范圍，為中等生態風險。從MHQ計算結果來看，在旱季，盡管只有25%的站位MHQ大于1.0，顯示出高生態風險，但24個站位平均MHQ值為0.88，接近于高風險閾值。此外，雨季除河口下游部分站位顯示為低生態風險外，河口上游、北港和南港均顯示為中等生態風險，值得進一步關注并采取有效控制措施。由于磺胺對甲氧嘧啶、磺胺二甲基異嘧啶、延胡索酸泰妙菌素、二甲硝咪唑、克球酚、金剛烷胺的相關獨立數據缺乏，導致其在環境中的PNEC值無法獲得，RQ值無法計算，因此可能會低估閩江抗生素類污染物的生態風險。

3 結論

在本研究中，閩江河口區水體在旱季和雨季共檢測到5類17種抗生素類污染物，總含量變化范圍在26.31～155.39 ng/L，與國內外其他流域相比，閩江河口水體中抗生素含量處于相對較低的水平。從空間分布來看，在閩江河口上游、北港和南港抗生素總量變化不大，河口下游受海水稀釋作用影響而抗生素含量呈明顯下降的趨勢。不同種類抗生素在不同季節具有相對不同的空間分布特征，其中喹諾酮類和硝基咪唑類在人口密集的北港區域污染較嚴重。在旱季，磺胺甲惡唑具有高生態風險，紅霉素和林可霉素具有中等生態風險；在雨季，紅霉素顯示中等生態風險。從MHQ計算結果來看，閩江河口區大部分站位均處于高生態風險閾值左右，值得相關管理部門進一步關注并制定有效管控措施。