切花小菊“紅昌”脫毒技術研究

劉 丹，王 容，陳天烺，吳海峰，張賓賓，方 萍，陳 煒，赫文韜

(浙江海豐生物科技股份有限公司，浙江紹興 312000)

菊花()，為菊科菊屬多年生宿根草本花卉,是我國的傳統名花，被譽為花卉“四君子”之一。目前切花菊栽培地域廣泛，在花卉產業中占有重要地位，作為世界四大切花之一，在生產規模上居于世界各類切花之冠。切花菊又分為多頭和單頭兩大類，多頭切花菊又稱切花小菊，小菊的一個莖稈上有多個花蕾，一般為5～7個，花朵直徑6 cm以下，主蕾與側蕾長勢均衡，花期接近，呈傘形花序，觀賞價值和經濟價值極高，在國內和國際市場的需求量迅速增加。為了滿足市場需求，近年來，菊花栽培面積不斷擴大，但菊花的病毒病越來越嚴重。已報道侵染菊花的病毒有20余種，如番茄不孕病毒(Tomatoa spermy virus,TAV)是危害菊花的主要病毒之一。TAV 為黃瓜花葉病毒屬的成員。侵染TAV病毒的菊花植株表現矮化、變形、碎花、花葉、皺縮、壞死等現象，嚴重影響菊花的品質和產量，阻礙菊花產業的發展。筆者以切花小菊“紅昌”為試材，探究菊花脫毒技術，以期為脫除菊花病毒及解決品種退化提供技術和數據參考。

1 材料與方法

供試脫毒材料：經鑒定感染TAV病毒的小菊“紅昌”(采自浙江海豐花卉有限公司種植基地)，該小菊為扦插培養18 d后得到的小菊幼苗，處于營養生長時期。

病毒唑預脫毒。用一次性注射器在距離地面2 cm的小菊“紅昌”植株莖稈上注射病毒唑溶液，溶液濃度分別為0(CK)、5、10、15、20 mg/L。培養條件：空氣濕度為50%～75%，環境溫度為15～30 ℃，光照時間為14 h/d，光照強度為50 000～100 000 lx。培養期間注意防蟲防菌，培養30 d后得到預脫毒小菊。

外植體的無菌培養。選取獲得的預脫毒小菊當年生嫩枝，剪去葉片，將其莖段剪成帶4～5個芽的小段，在洗潔精水中浸泡10 min，取出將每個帶芽莖段單獨用自來水流水沖洗1 min；然后將清洗后的帶芽莖段在多菌靈1 000倍液中浸泡30 min，取出單獨用自來水流水沖洗1 min；在超凈工作臺上將清洗后的帶芽莖段在75%乙醇溶液中浸泡30 s，取出用無菌水沖洗2次；最后將沖洗后的帶芽莖段在有效氯為5%次氯酸鈉溶液中浸泡10 min，取出用無菌水沖洗6次，每次沖洗1 min，得到消毒滅菌后的莖段。將獲得的莖段切成長2～3 cm的小段，每個小段帶有1～3個腋芽，同時切除莖段兩端2～3 mm接觸藥品的部位，將其接種于含有不定芽誘導培養基MS(3/4大量元素)+6-BA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L的組培瓶內進行初代培養。25 d繼代培養一次，繼代培養基為MS+6-BA 0.5 mg/L+蔗糖30 g/L+活性炭0.5 g/L。培養條件：溫度為(22±2) ℃，光照強度為2 000 lx，光照時間為14 h/d。

熱處理結合莖尖培養脫毒。將繼代培養基中培養6 d得到的無菌瓶苗在光照培養室中培養7 d后置于光照培養箱內，采用晝夜變溫的方式進行熱處理，進一步提高莖尖的脫毒率。設置2種熱處理方式：處理T，熱處理35 d；第1～5天：白天(8:00—20:00)高溫28 ℃，晚上(20:00—次日8:00)低溫25 ℃；第6～12天：白天(8:00—20:00)高溫33 ℃，晚上(20:00—次日8:00)低溫28 ℃；第13—35天：白天(8:00—20:00)高溫39 ℃，晚上(20:00—次日8:00)低溫33 ℃，濕度均為30%～50%。處理T，光照時間12 h/d，光照強度3 000 lx，按晝夜溫度28～32、30～35、33～38 ℃的順序，每2 d變換1檔。然后在33～38 ℃下繼續熱處理脫毒培養30 d。熱處理培養后進行莖尖剝離。

莖尖剝離、接種與培養。將經過熱處理的無菌苗在超凈工作臺上用鑷子和刀片切下菊苗頂端1～2 cm，接種于含有莖尖固定培養基MS+瓊脂5 g/L的培養皿中，以防在莖尖剝離過程中由于脫水而影響成活率(以不使用莖尖固定培養基直接剝離作為對照)。在40倍解剖鏡下，一手用鑷子輕輕將材料固定于視野中，另一手用11號手術刀將菊花頂芽外的幼小葉片小心依次剝離，注意操作過程中不要過早折斷莖，以免增加剝離難度，直至在解剖鏡下能看清表面光滑、呈圓盤狀輕微發亮的莖尖為止。用手術刀割取莖尖組織，大小分別為0.1～0.3、0.8、1.5、1.9 mm，然后迅速接種于莖尖誘導培養基中進行培養，pH 6.0，接種時輕輕放置于培養基表面，避免將莖尖深埋培養基中。培養條件：溫度為(22±2) ℃，光照強度為2 000 lx，光照時間為14 h/d，30 d后統計莖尖成活率。

莖尖成活率=(莖尖成活數/接種莖尖總數)×100%

莖尖誘導培養基的不同配方:CHR-1,改良MS+6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.1 mg/L+活性炭0.5 g/L+蔗糖30 g/L+瓊脂5 g/L;CHR-2,MS+6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.1 mg/L+活性炭0.5 g/L+蔗糖30 g/L+瓊脂5 g/L;CHR-3,ZL+6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.1 mg/L+活性炭0.5 g/L+蔗糖30 g/L+瓊脂5 g/L;CHR-4,1/2B5+6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.1 mg/L+活性炭0.5 g/L+蔗糖30 g/L+瓊脂5 g/L(ZL為申請公布號為“CN109258460A”發明專利中的培養基組成成分)。

病毒檢測。對所得的小菊植株(莖尖組織培養苗)進行TAV檢測，統計脫毒率確定脫毒效果。

脫毒率=(脫毒植株數/熱處理植株數)×100%

增殖培養。將獲得的經鑒定確認不攜帶TAV病毒的小菊植株接種至增殖培養基中進行增殖培養，培養條件：溫度為(22±2) ℃，光照強度為2 000 lx，光照時間為14 h/d。

生根培養。將增殖后的脫毒植株切成2 cm左右并帶有1～3個葉芽的莖段，接種于生根培養基中進行生根培養。培養條件：溫度為(22±2) ℃，光照強度為2 000 lx，光照時間為14 h/d。

2 結果與分析

經RT-PCR檢測，小菊“紅昌”脫毒前感染TAV的結果呈陽性(圖1)。

注：M.Marker；1.陰性對照;2.供試脫毒材料TAV病毒的檢測結果Note:M.Marker;1.Negative control;2.TAV test results of the tested virus-free material圖1 TAV病毒檢測結果Fig.1 Test result of TAV

由表1可知，采用不同濃度病毒唑對小菊進行預脫毒處理，小菊的脫毒率不同，以處理③的脫毒率最高，達92.50%；CK的脫毒率最低。部分莖尖組織培養苗的病毒檢測結果呈陽性(圖2)，說明病毒唑預脫毒對菊花脫毒有重要作用。

表1 不同濃度病毒唑對脫毒率的影響

注：M.Marker;1.陰性對照;2.供試脫毒材料TAV病毒的檢測結果Note:M.Marker;1.Negative control;2.TAV test results of the tested virus-free material圖2 未經病毒唑預脫除TAV病毒檢測結果Fig.2 Detection results of TAV virus without virazole pre removal

由表2可知，2種不同熱處理方式對小菊脫毒率的影響呈極顯著差異；處理T，病毒唑濃度及莖尖剝離大小均一致時，熱處理溫度采用25～39 ℃的方式，脫毒率極顯著高于處理T，達92.50%。因此，熱處理溫度為25～39 ℃是熱處理結合莖尖脫毒的最佳溫度。無菌瓶苗在熱處理前狀態見圖3，熱處理后狀態見圖4。

表2 不同熱處理溫度對脫毒率的影響

圖3 無菌苗熱處理前Fig.3 Sterile seedlings before heat treatment

圖4 無菌苗熱處理后Fig.4 Sterile seedlings after heat treatment

由表3可知，剝離莖尖大小為0.1～0.3 mm，莖尖誘導培養基為CHR-1時，莖尖的存活率最高，達53.33%。因此，莖尖誘導培養基CHR-1時，即改良MS+6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.1 mg/L+活性炭0.5 g/L+蔗糖30 g/L+瓊脂5 g/L為最適合莖尖培養的培養基。莖尖培養30 d的狀態見圖5，莖尖培養60 d的狀態見圖6。

表3 不同莖尖誘導培養基對莖尖成活率的影響

圖5 莖尖培養30 d的狀態Fig.5 The state of shoot tip culture for 30 days

圖6 莖尖培養60 d的狀態Fig.6 The state of shoot tip culture for 60 days

由表4可知，莖尖大小為0.1～0.3 mm，莖尖誘導培養基為CHR-1時，小菊的脫毒率最高，達89.00%；且莖尖增大，小菊的脫毒率降低，說明莖尖越小，病毒的數量越少，越有利于小菊脫除病毒。因此，莖尖大小為0.1～0.3 mm(圖7)，有助于病毒的脫除，提高脫毒率。

由表5可知，莖尖大小相同時，剝離莖尖時采用莖尖固定培養基和不采用莖尖固定培養基的小菊莖尖存活率有著明顯差異。處理①，采用莖尖固定培養基，莖尖大小為0.1～0.3 mm時，莖尖存活率最高，達60.00%。由此說明，剝離莖尖時，采用莖尖固定培養基能提高莖尖的存活率。

表4 不同大小莖尖對脫毒率的影響

圖7 0.1～0.3 mm的莖尖Fig.7 0.1-0.3 mm stem tip

表5 莖尖固定培養基對莖尖成活率的影響

經病毒唑預脫毒，熱處理結合莖尖剝離及莖尖培養得到脫毒無菌苗，通過RT-PCR檢測無菌苗是否脫除TAV：首先提取待測無菌苗的RNA，反轉錄獲得cDNA；以cDNA為模板，采用TAV-F1和TAV-R1進行第1輪PCR反應，得到第1輪PCR產物；以第1輪PCR產物為模板，采用TAV-F2和TAV-R2進行第2輪PCR，得到第2輪PCR產物(終產物)。引物序列如下：

TAV-F1：CCATCCCTTCAACATCCGAC

TAV-R1：GTTGAAGCGGAAGGAATACG

TAV-F2：TTATTGCTGGGAAGAAGTGTCG

TAV-R2：CGGTGGGAACGTGCTGAT

圖8為脫毒后植株病毒檢測結果，結果顯示呈陰性。

注：M.Marker;1.陰性對照;2.莖尖組織培養苗TAV檢測Note:M.Marker;1.Negative control;2.TAV test results of shoot tip tissue culture seedling圖8 脫毒后TAV病毒檢測結果Fig.8 Test results of TAV virus after virus removal

將獲得的經鑒定后確認不攜帶TAV病毒的小菊植株接種至增殖培養基中進行增殖培養，在溫度為(22±2) ℃，光照強度為2 000 lx，光照時間為14 h/d的條件下培養30 d后，得到增殖后的脫毒植株(圖9)，葉色濃綠，長勢較好。

圖9 增殖狀態的脫毒苗Fig.9 Virus free seedling in proliferation

將增殖后的脫毒植株切成2 cm左右并帶有1～3個葉芽的莖段，接種于生根培養基中進行生根培養，培養5～7 d后可明顯觀察到根系長出，在生根培養基中培養30 d后，得到脫毒生根苗(圖10)，植株健壯，根系發達。

圖10 生根狀態的脫毒苗Fig.10 Virus free seedlings in rooting state

3 討論與結論

目前，有關菊花脫除病毒技術的研究已經有大量報道。國內外報道的侵染菊花的病毒種類多，特點不同，脫除難易程度也不同，因此不同的脫毒方法和病毒檢測技術不斷被研究和分析。何旭君等以“增城蜜菊”無菌瓶苗為材料，對脫除菊花B病毒(Chrysanthemum virus B，CVB)和番茄不孕病毒(TAV)進行了研究，得出最佳莖尖誘導培養基為MS+6-BA 0.1 mg/L+椰子汁100 ml/L+蔗糖30 g/L，誘導率為52.67%的結論，而該研究的最佳莖尖誘導培養基為改良MS+6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.1 mg/L+活性炭0.5 g/L+蔗糖30 g/L+瓊脂5 g/L，莖尖的成活率為53.33%，與何旭君等研究的誘導率相差不多。宋瑞琳等以切花菊為材料，采用熱處理結合2次莖尖組織培養技術脫除TAV，莖尖取0.5～1.0 mm，熱處理溫度白天40 ℃，夜間30 ℃，脫毒率達83.3%～90.00%；而該研究的熱處理溫度為25～39 ℃，莖尖大小為0.1～0.3 mm，脫毒率略高于前者，為89.00%～92.50%。魏進莉研究結果表明，剝取的莖尖大小在0.1～0.3 mm時，病毒可100%被脫除，且與該研究中隨著剝取莖尖大小的增大，脫毒效果降低結論一致。吳丹等以莖尖分生組織培養結合熱處理或病毒唑處理脫除“滁菊”病毒效果明顯，與該研究采用病毒唑10 mg/L進行預脫毒處理的結果類似。該試驗的脫毒方法可為菊花的母本復壯和病毒脫除提供技術參考。