畢節市刺梨多酚提取工藝優化及其含量分析

程杏安，劉 欣，張漢輝，東方云，王彩云，李恒謙，呂曉靜，李俊杰，鄒啟文，蔣旭紅*

(1.仲愷農業工程學院化學化工學院，廣東廣州 510225；2.畢節市中藥研究所，貴州畢節 551799)

刺梨(Tratt，RRT)，屬于薔薇科植物，是云貴高原等地區特有的一種植物資源。刺梨富含多種營養元素和功能成分，包括多糖、多酚、V、超氧化物歧化酶、黃酮、V及多種礦物質元素。有研究發現，刺梨中多酚類物質含量豐富，具有多元酚結構，主要由沒食子酸、兒茶素、鞣花酸等成分復合而成，是極具開發利用價值的優質資源。此外，植物多酚的抗氧化能力被認為是抑菌及防治慢性疾病的基礎。而提取工藝的不同會對多酚的組成和微觀結構造成影響，因此選擇合適的提取方法不僅是提高多酚提取率的關鍵，也是維持多酚的理化、流變性、功能、結構和生物學特性的關鍵。

多酚提取的方法有微波輔助法、有機溶劑浸提法、超聲-微波協同輔助法和生物酶提取法等，其中有機溶劑浸提法主要是利用不同酚類成分在溶劑中溶解能力的差別，通過選用合適的溶劑采用浸提的方式使目標物質析出；而生物酶可專一性地作用于植物胞壁與胞間的某些物質成分，導致細胞壁的緊密結構變得膨脹而疏松，細胞膜和細胞壁的通透性增強，進而使細胞內的目標成分更易浸出。筆者采用乙醇提取法和纖維素酶提取法，分別對刺梨果肉多酚進行提取，采用正交試驗優化提取工藝條件，以DPPH和ABTS自由基清除率為指標，評價了2種提取方法的抗氧化活性，旨在為刺梨的開發利用及功能性研究提供理論依據。

1 材料與方法

刺梨樣品為刺梨果期時，按規范采摘自貴州省畢節市7個縣(區)的38個村莊(社區)。借助手機奧維地圖選點定位各采樣點，記錄相關樣品所在經緯度及海拔高度。共計56份樣品，分為野生、貴農5號、貴農7號3個品種(表1)。

2，2’-聯氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)[2，2’-azino-bis(3-ethyl benzothia- zoline-6-sulfonic acid)，ABTS]98%，上海麥克林生化科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼[1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2，2-Diphenyl-1-(2，4，6-trinitrophenyl)hydrazyl，DPPH]純度≥98%，西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司；福林酚，南京都萊生物技術有限公司；纖維素酶，河南萬邦實業有限公司。

UV-2450型紫外分光光度計，美國安捷倫科技有限公司；L400臺式低速自動平衡離心機，長沙高新技術產業開發區湘儀離心機儀器有限公司；SCIENTZ-10N真空冷凍干燥機，寧波新芝生物科技股份有限公司。

表1 畢節市7個縣(區)38個村莊刺梨產地的環境情況

沒食子酸標準曲線的繪制。精確稱取(0.100±0.001) g沒食子酸，5 mL 70%甲醇溶解，用超純水定容至100 mL配制沒食子酸標準溶液(1 mg/mL)。分別移取 2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 mL沒食子酸標準溶液于100 mL容量瓶中，分別用超純水定容至刻度，搖勻，得到的質量濃度分別為20、25、30、35、40、45 μg/mL。分別移取不同質量濃度的沒食子酸工作液1 mL于10 mL 容量瓶中，加入5 mL 10%福林酚試劑，搖勻，反應3～8 min，加入4 mL 7.5%碳酸鈉溶液，加水定容至刻度，搖勻，室溫下靜置60 min。用10 mm比色皿，在765 nm條件下用分光光度計進行吸光度的測定。以沒食子酸質量濃度(μg/mL)為橫坐標，吸光度為縱坐標，用origin 2021軟件繪制沒食子酸濃度-吸光度標準曲線圖。

刺梨果肉多酚的提取工藝。

單酶提取法。產地赫章縣威奢鄉中銀村的野生刺梨在同縣區刺梨品種中多酚含量與出汁率均為最高，以其為試驗樣品，準確稱取該刺梨果肉粉末放入燒杯，按試驗設置的料液比在相應溫度下恒溫水浴，加入相應含量的纖維素酶于刺梨樣品中提取一定時間，80 ℃下水浴滅酶2 min后，將提取液置于臺式低速自動平衡離心機中3 000 r/min離心30 min，收集上清液，記錄體積()，即得到刺梨果肉多酚提取液，測定多酚提取率。

乙醇提取法。準確稱取赫章縣威奢鄉中銀村的野生刺梨果肉粉末放入燒杯中，配置一定濃度乙醇水溶液待用，按試驗設置的料液比將乙醇水溶液加入燒杯中，恒溫水浴提取一定時間后置于臺式低速自動平衡離心機中3 000 r/min離心30 min，收集上清液，記錄體積()，即得到刺梨果肉多酚提取液，測定多酚提取率。

單因素試驗及正交試驗設計。

單酶提取法提取刺梨多酚。以料液比、提取溫度、提取時間、乙醇濃度、纖維素酶含量為單因素，在單因素試驗的基礎上，選取提取時間、料液比、提取溫度3個因素進行L(3)正交試驗設計，確定最佳提取工藝。正交試驗因素與水平見表2。

表2 單酶提取法正交試驗設計

乙醇提取法提取刺梨多酚。以料液比、提取溫度、提取時間、乙醇濃度、提取溶劑種類為單因素，同時在單因素試驗的基礎上，選取料液比、提取溫度、提取時間3個因素進行L(3)正交試驗設計，確定最佳提取工藝。正交試驗因素與水平見表3。

表3 乙醇提取法正交試驗設計

出汁率的測定。各組各取一部分刺梨，洗凈后常溫吹干，去除表面水分，而后進行刺梨重量計算，得到出汁前的重量()，將其放入榨汁機中榨汁，離心去除固體物質后，得到剩余溶液，稱重得。

Folin-Ciocalteu分光光度測定法測定不同區域刺梨多酚含量。參考譚曉舒等的方法，分別取對照品沒食子酸及待測多酚溶液，將待測多酚溶液稀釋倍后，各取1.0 mL于10 mL離心管中，分別加入5.0 mL稀釋10 倍的福林酚試劑(0.1 mol/L)，搖勻。反應3～8 min，加入4.0 mL 7.5%碳酸鈉溶液，充分混勻，黑暗處室溫放置反應60 min。用紫外可見分光光度計在 765 nm 波長處測定吸光度值()，空白組以蒸餾水替代，每組平行測定3次。以為縱坐標()，沒食子酸質量濃度為橫坐標()，繪制標準曲線，得到沒食子酸標準曲線方程=0011 4+0014 9(=0999 6)。根據沒食子酸標準曲線計算待測溶液中的多酚含量，結果表示為沒食子酸(gallic acid equivalents，GAE)當量濃度，即 μg/mL 。

式中，為待測溶液測得的吸光度；為待測溶液稀釋的倍數；為提取離心后的待測溶液總體積，mL;為提取試驗稱取的刺梨樣品質量，g。

抗氧化活性的測定。

清除DPPH自由基能力。參照陳永平等的方法，稱取8 mg DPPH到小燒杯中，加無水乙醇溶解，將溶液轉移到容量瓶中用無水乙醇定容至100 mL，即0.2 mmol/L DPPH溶液配制完成。用無水乙醇稀釋多酚提取液至濃度分別為0.12、0.10、0.08、0.06、0.04 mg/mL。取2 mL稀釋后的提取液和2 mL配制好的DPPH溶液到試管中。二者在室溫黑暗處反應4 h，反應結束后在517 nm處測定，記作。樣品對照組則以無水乙醇代替DPPH測定。空白組以無水乙醇替代樣品液測定。用V重復步驟。所有試驗均重復操作3次，取平均值。

2 結果與分析

以沒食子酸濃度(μg/mL)為軸，以吸光度為軸，建立沒食子酸標準曲線，得到回歸方程=0011 4+0014 9，=0999 6，如圖1所示其線性關系良好。

圖1 沒食子酸的標準曲線Fig.1 Standard curve of gallic acid

單酶提取法。從圖2可見，隨著料液比增加，提取率先增后減，最大值為14.48%，這可能是由于繼續增加料液比，纖維素酶的有效作用濃度被稀釋，酶解不充分，最終多酚提取率下降。溫度升高有利于加快分子間的運動，提高纖維素酶的活性，提取率最大值為14.48%，之后，由于多酚在較高溫度下可能發生氧化或者降解，且纖維素酶可能因溫度過高而失去活性，提取率下降。提取時間剛開始增加時，提取率不斷增加，之后由于提取時間過長，多酚類物質發生了分解，使得提取率下降。乙醇濃度增大時，多酚提取率也隨之增加，之后隨著乙醇濃度繼續升高，醇溶性和親脂性強的雜質溶出增多，導致多酚類含量下降，提取率逐漸下降。提取率隨纖維素酶含量的增加先升后降，在0.6%時達到最大值(14.90%)。這可能是由于細胞壁的分解，增大了細胞內液與外界的接觸面積，促進酚類物質向溶劑中擴散，有利于多酚浸出。但隨著纖維素酶含量的不斷增加，酶與多酚形成絡合物，使得多酚提取率下降。

圖2 單酶提取法單因素對刺梨多酚提取率的影響Fig.2 Effects of single factors on polyphenols extraction rate of Rosa roxburghii Tratt by single enzyme extraction

乙醇提取法。從圖3可見，提取率隨料液比的增加先增后減，在1∶50時，達最大值17.0%。這可能是多酚的溶出已達到飽和，溶劑體積的進一步增加，反而促進了其他成分的溶出，當溶劑比例較低時，溶劑難以將多酚完全提取，增加溶劑用量，未溶解的多酚向提取劑中轉移，溶劑與原料的比值越大，濃度梯度越大，有效成分的擴散速率也越大。由于溫度升高有利于加快分子間的運動，溶劑與刺梨粉末接觸也更加充分，因此促進了提取率的增加，到30 ℃時，提取率達到最大，為16.34%；之后隨著溫度升高，多酚在較高溫度下可能發生氧化或者降解，提取率開始下降。提取率隨著提取時間的延長呈先增后減趨勢，在40 min時達到最大值12.33%。之后由于提取時間過長，多酚類物質發生了分解，使得提取率開始下降。隨著乙醇濃度增大，提取率不斷升高，濃度為40%時，提取率最大，達11.85%。這是由于在乙醇濃度較低時，水溶性糖類等物質溶出，影響多酚的提取，隨著乙醇濃度的增加，多酚與乙醇溶劑的極性越來越接近，根據相似相溶原理，多酚的提取量會增大，但乙醇溶液過高時，一些脂溶性成分也會浸出，同時乙醇與多酚類物質極性差異變大，乙醇溶液在高體積分數條件下會揮發出來，這些都會影響多酚的提取效果。脂溶性物質的極性與無水乙醇最為接近，因此，溶劑種類中，無水乙醇和60%乙醇溶液提取率均高于其他溶劑，參考乙醇濃度單因素結果可知，乙醇濃度超過40%時，提取率逐漸降低，可解釋60%乙醇溶液的提取率高于無水乙醇的提取率。

圖3 乙醇提取法單因素對刺梨多酚提取率的影響Fig.3 Effects of single factors on polyphenols extraction rate of Rosa roxburghii Tratt by ethanol extraction

單酶提取法。根據正交試驗設計原理，進行L(3)正交試驗設計(纖維素酶含量作誤差列)，以確定刺梨多酚的最佳提取工藝，結果見表4。由表4可知，各因素對多酚提取率的影響表現為提取溫度>料液比=提取時間，刺梨果肉多酚單酶提取法的最佳提取工藝組合為提取料液比1∶50，提取溫度30 ℃，提取時間80 min。在該條件下重復3次試驗得到提取率為14.27%。

表4 單酶提取法正交試驗結果

乙醇提取法。在單因素試驗結果的基礎上，進行L(3)正交試驗設計(乙醇濃度作誤差列)，結果見表5。由表5可知，各因素對多酚提取率的影響表現為提取時間>提取溫度>料液比，最佳提取工藝組合為料液比1∶60，提取溫度40 ℃，提取時間50 min。該條件下重復3次試驗得到的提取率為14.47%。

由表6可知，各地區刺梨多酚含量在9.57%～44.42%，最高為納雍縣水東鎮鍋嘎村，達44.42%，最低為金海湖新區小壩鎮水井邊村，僅9.57%。各地區的刺梨出汁率分布在35.30%～83.00%，最高為大方縣黃泥塘鎮甘塘村，達83.00%，最低為黔西縣谷里鎮新陽村，僅35.30%。刺梨鮮果榨汁后可作為原汁進行加工出售，提高經濟效益，但刺梨成熟收獲期為30 d左右，采摘后很快會變質腐爛，鮮果難以運輸保存。因此，需在產地進行初加工，壓榨成原汁后常溫保存，不同地區刺梨出汁率的高低可作為篩選高品質刺梨的指標之一，作為其經濟價值的參考。

表5 乙醇提取法正交試驗結果

表6 畢節市不同地區刺梨多酚含量與出汁率

在相同的多酚濃度下，分別測定乙醇提取法和單酶提取法所得多酚的ABTS自由基清除能力，并與V進行對比，結果如圖4a所示。在多酚濃度小于0.4 mg/mL，通過單酶提取法所得刺梨多酚的ABTS自由基清除能力強于乙醇提取法所得的多酚，2種方法均強于相同濃度下V的清除能力。由圖4b可知，通過乙醇提取法所得刺梨多酚的DPPH自由基清除能力強于單酶提取法，強于相同濃度下V的DPPH自由基清除能力。由以上結果可知，通過不同提取方法得到的刺梨多酚均對DPPH和ABTS自由基具有較強的清除活性，可將其作為潛在的天然抗氧化劑進行開發利用。

3 結論

該研究采用乙醇提取法和單酶提取法對刺梨果實中的多酚進行提取，并分別用正交試驗對這2種刺梨多酚提取工藝進行優化，結果表明，單酶提取法的最優提取工藝為料液比1∶50，提取溫度30 ℃，提取時間80 min；乙醇提取法的最優提取工藝為料液比1∶60，提取溫度40 ℃，提取時間50 min。此外，對比2種提取方法所得刺梨多酚的抗氧化性可知，在多酚濃度小于0.4 mg/mL時，單酶提取法所得刺梨多酚對ABTS自由基清除能力強于乙醇提取法所得多酚；乙醇提取法所得多酚在濃度小于0.1 mg/mL時，清除率即可達到90%，且其對DPPH自由基清除能力強于單酶提取法所得多酚。據此可知，不同提取工藝可能會影響其抗氧化活性。

畢節市不同區域的刺梨多酚含量與出汁率結果顯示，畢節市38個地區多酚含量在9.57%～44.42%，出汁率分布在35.30%～83.00%，不同地區與品種間的刺梨多酚含量與出汁率有差異。數據顯示，貴農品種刺梨優于野生品種刺梨。根據畢節市不同地區采摘的刺梨多酚含量及出汁率的差異，可為后期大規模的種植、培育、加工刺梨提供科學依據。

圖4 提取方法對刺梨多酚抗氧化活性的影響Fig.4 Effect of extraction method on antioxidant activity of Rosa roxburghii Tratt polyphenols