解酒茶配方優(yōu)化及對急性酒精中毒小鼠解酒作用的研究

朱佳依，袁海波，滑金杰，王近近，楊艷芹，沈 帥，江用文

(中國農業(yè)科學院茶葉研究所，國家茶產業(yè)工程技術研究中心，農業(yè)農村部茶樹生物學與資源利用重點實驗室，浙江省茶葉加工工程重點實驗室，浙江杭州 310008)

隨著經濟發(fā)展和生活水平提高，飲酒人數(shù)逐年增加，急性酒精中毒的發(fā)生率隨之大幅增加，不但嚴重損害大眾健康，也非常容易產生許多社會問題。研究發(fā)現(xiàn)，乙醇進入機體后主要依靠肝臟代謝，由乙醇脫氫酶作用后轉化為乙醛，再在乙醛脫氫酶的作用下轉化為乙酸，從而排出體外。在乙醇的代謝過程中，會使機體氧化性應激增強，導致肝臟機體的損傷。因此，在不能立刻拒絕飲酒時，解酒保肝成為克服飲酒所帶來的傷害的又一途徑。我國的藥食同源植物資源豐富，自古以來已發(fā)現(xiàn)眾多具有解酒保肝、抗氧化功效的植物，此外由于作用獨特、方便攜帶、應用廣泛等優(yōu)點，袋泡茶這一形式廣受市場青睞。

葛根、枳椇子是我國藥食同源物質，其營養(yǎng)價值和藥用價值十分豐富，也是經典的解酒原料。根據《千金要方》《神農本草經》等古代醫(yī)藥文獻中記載，葛根在唐代就被用于“解酒毒”。葛根中所含的葛根異黃酮等生物活性物質可以清除乙醇及代謝產物，具有解酒護肝作用。枳椇子，鼠李科植物枳椇的成熟種子，《本草綱目》等文獻記載，枳椇子在民間亦被廣泛用于“治酒病”。藥理研究表明，枳椇的解酒、護肝和抗病毒等作用均與其中的黃酮類成分有關，且中醫(yī)處方也驗證兩者之間無配伍禁忌，結合使用具有止渴除煩、清濕熱、解酒毒的功效。茶葉中大量的茶多酚和茶褐素可顯著降低乙醇和乙醛濃度，提高肝中乙醇脫氫酶(ADH)、乙醛脫氫酶(ALDH)酶活性，并縮短醉酒小鼠醉睡時間，咖啡堿通過興奮大腦，還可以達到“醒酒”的效果，但茶湯濃度不宜太高。羅漢果中含有的黃酮類等成分都利于解酒醒酒、保護肝臟。另外飲茶還可以稀釋酒精，促進胃腸蠕動，減少酒精的吸收。但是，目前研究多集中于解酒配方的優(yōu)化，往往忽略了感官口感的需求，或局限于單一功能評價手段，缺乏全面和系統(tǒng)的研究。同時，將解酒類藥食同源原料與紅茶聯(lián)合應用于袋泡茶方面的研究也鮮有報道。因此，該研究選擇葛根、枳椇子、紅茶和羅漢果作為配方基礎，以解酒活性物質總黃酮及感官審評分數(shù)為指標，研究解酒袋泡茶的配方優(yōu)化；通過建立急性酒精中毒小鼠模型，觀察醉酒行為學指標以及測定血乙醇含量、肝臟生化指標，探討葛根、枳椇子、紅茶、羅漢果混合配方解酒袋泡茶的解酒功效，為解酒茶類產品研發(fā)提供基礎數(shù)據。

1 材料與方法

試材。葛根(益陽神奇草養(yǎng)生茶業(yè)有限公司)，枳椇子(深圳市泰斯古德食品實業(yè)有限公司)，羅漢果(上海梅家塢茶業(yè)有限公司)，紅茶(課題組自制)；實驗動物：SPF級雄性ICR小鼠100只，體質量18～22 g，由杭州醫(yī)學院提供，許可證號SCXK(浙)2019-0002。動物飼養(yǎng)于清潔級動物房，設定室溫20～26 ℃，濕度40%～70%，光照12 h明暗交替。

藥物及試劑。海王金樽(深圳市海王健康科技發(fā)展有限公司，批號20210302)；56°北京二鍋頭酒(北京二鍋頭酒業(yè)股份有限公司，批號20201118)；血乙醇(ALC)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號20210802)；乙醇脫氫酶(ADH)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號20211101)；乙醛脫氫酶(ALDH)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號20211101)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術有限公司，批號1221221323)。亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、三氯化鋁(上海國藥，分析純)；蘆丁對照品(源葉生物科技有限公司，純度95%)。

儀器與設備。Centrifuge 5810R型離心機(Eppendorf公司)；Power Wave XS型全波長酶標儀(Gene 公司)；T10型自動組織勻漿機(IKA公司)；HH2型數(shù)顯恒溫水浴鍋(力辰科技有限公司)；UV-1800型紫外分光光度計(島津公司)。

解酒茶的配方優(yōu)化設計。使用粉碎機將葛根、枳椇子、紅茶和羅漢果適當粉碎過6號篩，備用。配方試驗以感官評分(香氣、湯色、滋味)和總黃酮含量作為評價指標，采用試驗設計軟件Design Expert中混料設計D-Optional方法對解酒茶的配方進行優(yōu)化，確定葛根、枳椇子、羅漢果和紅茶的最佳配比。設定葛根(A)、枳椇子(B)、紅茶(C)和羅漢果(D)為4個參數(shù)，其中紅茶與羅漢果在配方中所占比例不超過50%，A + B + C + D = 100%，經預試驗后葛根、枳椇子、紅茶和羅漢果的質量選定范圍如表1所示。

解酒茶總黃酮含量測定。以蘆丁為標準品，采用硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法測定總黃酮含量，標準曲線為=6527 7+8×10(=0.999 4)。取配備好的解酒茶(3 g/袋)，加入150 mL 100 ℃純凈水沖泡5 min。用移液槍精確吸取1 mL解酒茶茶湯置于25 mL容量瓶中，采用硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法得到待測樣品，在波長511 nm處測定吸光度，通過標準曲線計算出總黃酮含量。

表1 各指標的設定

解酒茶的感官評價。取制備好的袋泡茶以150 mL的100 ℃蒸餾水沖泡5 min后，組織5名品評員分別從湯色、香氣和滋味進行品評打分。感官評分標準參照GB/T 24690—2018《袋泡茶》制定，并結合產品特點進行適當修改(表2)。

表2 解酒茶感官評分標準

動物分組及給藥。將配制好的解酒茶在100 ℃下水浴提取，料水比為1∶10，浸提30 min，過濾，濃縮至0.8、0.4、0.2 g/mL備用。小鼠隨機分成5組，分別為模型組、解酒茶低劑量組、解酒茶中劑量組、解酒茶高劑量組、海王金樽對照組，每組10只，分別根據動物藥理試驗用藥折算方法，以人體劑量的10、20和40倍作為試驗的低劑量、中劑量和高劑量組。試驗分2次進行，禁食不禁水12 h后，各組小鼠分別灌胃相應藥液0.02 mL/g(模型組灌胃等量水)，低劑量為4 g/kg，中劑量組8 g/kg，高劑量組16 g/kg；海王金樽對照組小鼠灌胃給予劑量為4 g/kg。30 min后，空腹灌胃給予北京二鍋頭酒(56°)0.015 mL/g。

解酒茶對醉酒小鼠的解酒評價。給予白酒后開始計時，觀察并記錄造模以及給藥期間小鼠有無死亡、嘔吐、乏力等癥狀，記錄小鼠翻正反射消失和恢復時間，計算小鼠醉倒率、醉酒潛伏期和醉酒維持時間(柔和地翻轉小鼠，使之出于仰臥位，30 s內不能翻正則判定為醉酒，即記錄醉酒潛伏期；恢復翻身反射判定為醒酒)。

解酒茶對醉酒小鼠的酒精代謝評價。給予白酒后，每隔1 h眼眶取血，3 h內共取血3次，室溫靜置后，2 000 r/min離心，取上清-20 ℃保存?zhèn)溆茫凑赵噭┖胁僮髡f明，測定血乙醇(ALC)濃度。于末次小鼠取血后處死并取肝臟，各組拍照，-80 ℃保存?zhèn)溆茫谓M織制備成肝組織勻漿，按照試劑盒操作說明，測定ADH、ALDH水平。

2 結果與分析

按照軟件設計的試驗組合進行復配，試驗方案和結果見表3。應用 Design-expert 軟件對響應值的試驗值進行二次多項回歸擬合，建立感官分數(shù)和總黃酮含量的回歸模型，回歸模型方程如下：

感官分數(shù)=83.32A+86.32B+92.37C+84.04D

總黃酮含量=1.65A+0.49B+3.77C+0.22D

對模型方程進行方差分析，結果發(fā)現(xiàn)，總黃酮含量和感官分數(shù)的線性模型均呈極顯著水平(<001)，判定系數(shù)()均大于0.85，表明試驗結果與模型擬合程度良好。

表3 設計方案和結果

在混料試驗設計中可以根據三元等值線圖直觀反映各原料組分的變化對響應值的影響。由軟件得到各原料交互作用的等高線圖和三維曲面圖。如圖 1 所示，感官評分隨著紅茶的添加量增加而明顯上升；提高枳椇子和葛根的添加量，則感官評分降低；葛根沖泡后茶湯中會帶有淡淡草木清香味，同時茶湯口感醇和，可以在規(guī)定比例內適當提高其用量。紅茶的添加對湯色、香氣和滋味均有較好的提升作用，但由于并不具有較強的解酒功效，因此需控制紅茶添加量來平衡功效和口感的協(xié)調。枳椇子泡水后帶有輕微的苦澀味，會加重茶湯的澀味，降低感官評分，但由于其可以同時賦予茶湯特有的烘烤果仁香味，可以適當少量添加。

圖1 葛根、枳椇子、紅茶對感官分數(shù)交互影響的等高線圖和三維曲面圖Fig.1 Contour map and three-dimensional surface map of the interaction of Radix Puerariae，Semen Hoveniae and black tea on sensory score

從圖2可以看出，當適當控制紅茶的添加量，提高葛根的添加比例更有利于增加茶湯中總黃酮的溶出量。響應曲面隨著紅茶和葛根添加量增加的方向顯著傾斜，說明紅茶和葛根添加量對茶湯中總黃酮含量影響較強，是解酒茶中最主要的黃酮貢獻組分。這與紅茶和葛根中均含有豐富的黃酮類成分有關。從圖2還可以看出，黃酮含量隨著枳椇子添加量的增加沒有明顯的增幅。枳椇子含有解酒活性物質黃酮類化合物，如黃酮醇、二氫黃酮醇、黃酮、二氫黃酮和二倍體黃酮醇等，但推測由于果實粉碎度不高，其黃酮類成分未能在茶湯中大量溶出。

圖2 葛根、枳椇子、紅茶對總黃酮含量交互影響的等高線圖和三維曲面圖Fig.2 Contour map and three-dimensional surface map of the interaction of Radix Puerariae，Semen Hoveniae and black tea on the content of total flavonoid contents

解酒茶配方的確定優(yōu)先考慮其解酒功效，因此，以最大程度獲得活性物質(總黃酮含量)為要點，根據三維曲面試驗結果和對各組分的限制條件，使紅茶的添加量盡可能不超過50%，在保證解酒茶口感醇和的同時，賦予解酒茶良好的解酒功效。得到解酒茶配方的最優(yōu)組合為紅茶50.0%、葛根41.7%、枳椇子8.3%、羅漢果0%。根據優(yōu)化后的配方進行驗證試驗，得到解酒茶的總黃酮含量為26.12 mg/g，感官評分為88.10分，與預測值基本接近，說明混料設計法在解酒茶配方設計和優(yōu)化中的應用有效。

對小鼠給予白酒后，立刻進行“翻正反射”試驗來判斷醉酒與醒酒狀態(tài)，每1 min 觀察一次，造模及給藥期間小鼠無死亡、嘔吐等癥狀(圖3)。由表4可知，中劑量組和高劑量組中均有1只保持“翻正反射”現(xiàn)象，即沒醉；小鼠醉酒潛伏期從短到長依次為海王金樽對照組<模型組<中劑量組<低劑量組<高劑量組。與模型組相比，解酒茶中劑量和高劑量組的醉倒率為90%；低、中、高劑量組的醉酒潛伏期均有延長，平均延長24.44 min，其中高劑量組顯著延長(<0.01)，將醉酒時間延長至69.00 min。小鼠醉酒維持時間從長到短依次為模型組>海王金樽對照組>低劑量組>中劑量組>高劑量組；低、中、高劑量組的醉酒維持時間均顯著縮短(<0.01)，將醉酒維持時間縮短至62～152 min，平均縮短了205.18 min。由此可看出，解酒茶能延長小鼠的醉酒潛伏期并且縮短小鼠的醉酒維持時間，對醉酒小鼠有一定的防醉和解酒作用。

圖3 小鼠急性酒精中毒高劑量組(a)和模型組(b)Fig.3 High-dose group(a)and model group(b)of acute alcoholism in mice

表4 解酒茶對小鼠急性酒精中毒的預防作用(n=10)

血液中酒精濃度也能反映酒精中毒嚴重程度。從圖4可以看出，酒精處理后的模型組小鼠血液中酒精濃度達1 913.3 mg/L。與模型組相比，解酒茶各劑量組1、2 h的血乙醇濃度都顯著降低(<0.05)，在2 h時降低至507.9～767.9 mg/L，其中中劑量組的3 h血乙醇濃度依舊顯著低于模型組(<0.01)，濃度為490.1 mg/L；海王金樽對照組僅在第1小時顯著降低血乙醇濃度(<0.01)，且在2、3 h時高于模型組。此結果表明解酒茶可顯著降低急性酒精中毒小鼠血液中的酒精含量。

從圖5可以看出，與模型組相比，解酒茶低、中、高劑量組均小幅提高了ADH活力，但并無顯著差異，海王金樽對照組顯著提高了ADH和ALDH活力(<0.05)；解酒茶高劑量組能顯著提高ALDH活力(<0.01)，表明解酒茶高劑量組能明顯提升乙醛氧化成乙酸的速度，促進了酒精在肝臟中的分解代謝，降低乙醛對肝臟的損傷作用。試驗結果表明解酒茶具有的解酒功效可能是通過激活肝臟ALDH 活力，加速乙醛的分解，從而降低體內乙醇濃度來實現(xiàn)的。

注：*表示與模型組比較P<0.05；**表示與模型組比較P<0.01Note：* means P<0.05 compared with model group；** means P<0.01 compared with model group圖4 解酒茶對醉酒小鼠血乙醇濃度的影響(n=10)Fig.4 Effect of anti-alcoholism tea on serum ethanol concentration in drunken mice(n=10)

注：*表示與模型組比較P<0.05；**表示與模型組比較P<0.01Note：* means P<0.05 compared with model group；** means P<0.01 compared with model group圖5 解酒茶對醉酒小鼠酒精代謝酶活性的影響(n=10)Fig.5 Effect of anti-alcoholism tea on the activity of alcohol metabolism enzymes in drunken mice

3 討論與結論

急性酒精中毒是當今世界的一大醫(yī)學和社會問題，給人們的日常生活帶來許多嚴重危害和問題。當飲酒后，90%以上的乙醇通過肝臟途徑代謝，首先被 ADH 氧化成乙醛，再經過 ALDH 被氧化為乙酸，最后通過三羧酸循環(huán)被分解為 CO和HO。試驗證明，大量飲酒會對肝臟組織造成損傷，造成ADH、ALDH活性下降，進而影響酒精代謝速度，使血液中乙醇濃度升高。因此，測量血清乙醇濃度、肝ADH、ALDH活性，能夠反映出乙醇在體內的代謝情況以及肝臟損害程度。

該研究應用混料設計法探索解酒茶以功效和口感為基礎的最優(yōu)配方，得到各原料添加的最優(yōu)比例為紅茶50.0%、葛根41.7%、枳椇子8.3%、羅漢果0%，此配方下所得袋泡茶中總黃酮含量26.12 mg/g，感官評分88.10分。沖泡后茶湯橙黃明亮，帶有淡淡果香味，口感醇正，回味甘甜。同時，還進一步探究了解酒茶對醉酒模型小鼠醒酒能力的影響，結果顯示，解酒茶低、中、高劑量均能延長醉酒潛伏期，顯著縮短醉酒維持時間，明顯改善醉酒小鼠的行為學指標。同時，該研究測定了小鼠灌胃白酒后 1、2、3 h 的血乙醇濃度變化，結果顯示，低、中、高劑量組顯著降低了小鼠飲酒后1、2 h的血乙醇濃度(<0.05)；且中劑量組的血乙醇濃度在3 h后依舊顯著低于模型組(<0.01)，表明解酒茶能夠較好地降低血乙醇濃度，且中劑量組體現(xiàn)了良好的持續(xù)性功效。此外，肝臟生化指標試驗結果顯示解酒茶高劑量組有效增強了ALDH的活性，提示解酒茶可能通過提高肝臟中ALDH的水平，加快酒精的轉化過程，從而起到防醉、解酒的作用，有效避免或減輕酒精造成的急性肝臟損傷。

綜上所述，該研究從配方組合、動物行為學指標檢測和生化指標測定這3個層面探討了葛根、枳椇子、紅茶、羅漢果復合袋泡茶的配方優(yōu)化和解酒功效，在保證解酒功效的基礎上，提高其香氣和口感和滋味，使其更易為市場接受。為今后進一步研究解酒作用機制提供試驗基礎，也為解酒保健產品的開發(fā)應用提供科學依據。