高脂血癥對動脈內皮糖萼及動脈粥樣硬化的影響

潘俊，孫世超，羅雅嫻，周揚，周晨明，徐彥楠

（河北醫科大學，河北 石家莊 050017）

0 引言

高脂血癥（Hyperlipidemia，HLP）是由于人體內脂肪代謝或轉運異常引起的血清脂質和脂蛋白水平升高的一種代謝性疾病[1]。其作為動脈粥樣硬化的首要危險因素，已被循證醫學證實是心腦血管病的獨立危險因素之一[2]。內皮糖萼（Endothelialglycocalyx, EGX）主要覆蓋于的血管內皮上，位于血管內皮與血液之間的復合物[3]。其作為血管內皮的屏障，在調節血管通透性、調節炎癥反應、感測流體的剪切力、抗凝等起著重要作用[4]。雖然近些年內皮糖萼相關研究逐年增多，但是內皮糖萼在動脈粥樣硬化中所起作用的具體機制尚不清楚。因此，本文旨在探討高脂血癥對動脈內皮糖萼及動脈粥樣硬化的影響，以期為動脈粥樣硬化機理的闡釋及其防止提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本實驗以5月齡倉鼠為動物模型，將動物分為對照組和實驗組，每組各五只。對照組以普通繁殖飼料喂養12周，實驗組喂養高脂飼料12周（10%豬油，5%蔗糖，2%膽固醇，0.5%牛膽鹽，0.2%丙基硫氧嘧啶）。所有實驗動物飼養于河北醫科大學實驗房，遵循PF級S實驗動物飼養條件。

1.2 方法

1.2.1 相關試劑

醛鑭灌流固定液：1%硝酸鑭-3%戊二醛-2%多聚甲醛-0.1mol/L二甲砷酸鈉

電鏡標本制備所需漂洗液：1%硝酸鑭-0.1mol/L二甲砷酸鈉

1.2.2 標本的收集

用4%水合氯醛經腹腔注射麻醉，打開胸腔，暴露心臟，剪開右心耳，用注射器從右心耳采集心臟血液2mL，置于4℃冰箱保存待測。取血后，立即采用硝酸鑭示蹤技術，用醛鑭灌流固定液進行灌流固定，取胸主動脈，分成三部分：經石蠟包埋切片后進行HE染色；經冰凍切片后進行油紅O染色。經樹脂包埋，進行透射電鏡觀察。

1.2.3 血清學檢測

將 收集 的血 液離 心 (4000r/min，10 min)，取上層血漿樣品，用酶反應比色法按照試劑盒說明書檢測總膽固醇(TC)、甘油三脂（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）。

1.2.4 HE染色

取一段胸主動脈標本經脫水、透明、浸蠟及包埋后，切成厚度為2μm的石蠟切片。切片經二甲苯脫蠟、乙醇水化、蘇木素和伊紅染色，逐級梯度酒精脫水，二甲苯透明，晾干后用中性樹膠封片，顯微鏡采集圖像。

1.2.5 油紅O染色

取一段胸主動脈標本在冰凍切片機上切成 8 μm 厚的切片，切片經60%異丙醇2min，用提前配置好的油紅 O 染液避光染色10min，60%異丙醇染色5s，隨后用蘇木素染色染核 5 min，甘油明膠進行封片，顯微鏡采集圖像。

1.2.6 硝酸鑭示蹤透射電鏡技術

取一段胸主動脈標本，經醛鑭灌流固定液前固定液 4℃ 固定過夜，漂洗液漂洗3次，1% 四氧化鋨-1%硝酸鑭后固定2h，經50%、70%、80%、90%、100%丙酮梯度脫水，Epon812樹脂包埋，超薄切片機切50nm超薄切片，醋酸雙氧鈾及檸檬酸鉛染色，在透射電鏡下檢測、拍照。相同放大倍數下,每只鼠拍照不同部位的內膜照片5 張，每張圖用 Photoshop 軟件分割成等份的方格，測量每個方格內由內皮細胞上糖萼層頂端到內皮細胞膜的垂直距離，然后進行統計學分析。

1.2.7 統計學方法

采用SPSS 13.0統計軟件進行分析，所有數據以均數±標準差（±s）表示，作單因素方差分析(One-Way ANOVA)，結果P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血清學檢測

為了檢測造模是否成功，對實驗動物進行血清學檢測，結果顯示：與對照組相比，模型組TC、TG、LDL-C水平顯著升高， HDL-C水平降低（P＜0.05），兩組差異有統計學意義（圖1）。

圖1 兩組血脂水平比較

2.2 HE染色

結果顯示，對照組主動脈血管壁結構清晰，內皮表面光滑，厚度分布均勻，結構完整，中膜平滑肌細胞排列規則，無增生；而模型組，內皮表面粗糙，厚薄不均，凹凸不平，中膜平滑肌排列紊亂，細胞間纖維組織異常增生（圖2）。

圖2 兩組主動脈HE染色的觀察(A:對照組 B：模型組)

2.3 油紅O染色

結果顯示:對照組主動脈內膜無脂質沉積；而模型組可見動脈內膜有明顯的脂質沉積（圖3）。

圖3 兩組主動脈油紅O染色的觀察(A:對照組 B：模型組)

2.4 透射電鏡觀察內皮糖萼超微結構的改變。

結果顯示對照組內皮糖萼分布均勻，厚薄一致；而模型組內皮糖萼層變薄變稀疏，并伴有部分缺失的現象（圖3）。經測量統計后，對照組內皮糖萼平均厚度為（353.13±181.81）nm，模型組為（188.33±119.50）nm，兩組之間差異有統計學意義 (P＜0.05)（表1）。

圖3 兩組主動脈內皮糖萼透射電鏡的觀察(A:對照組 B：模型組)

表1 兩組內皮糖萼的厚度比較（±s）

注 : *P＜0.05 vs 對照組

組別 n 內皮糖萼厚度(nm)對照組 5 353.13±181.81模型組 5 188.33±119.50 F值 5.565 P值 ＜0.05

3 討論

隨著經濟的發展，人口老齡化及人們生活習慣的改變，動脈粥樣硬化已成為全球死亡率上升的主要原因之一[5]。作為心腦血管疾病的病理基礎，動脈粥樣硬化的預防與治療已成為重點研究對象，而血脂異常又是動脈粥樣硬化發病的主要因素之一[6]。

目前，小鼠和大鼠已被廣泛應用于動脈粥樣硬化的研究。但有研究顯示，小鼠以及大鼠對飲食誘導的動脈粥樣硬化具有不同程度的抵抗力，而倉鼠在高脂模型的制備中，主動脈和冠狀動脈中顯示出更多的動脈粥樣硬化病變，因此本實驗選用倉鼠作為高脂血癥模型動物[7]。高脂血癥是脂質異常的一種表現，其特征是TC、TG、LDL明顯升高，HDL降低。雖然高脂血癥不能直接引起顯著的臨床癥狀，但由于膽固醇和甘油三酯在器官內的積累，高脂血癥可導致動脈粥樣硬化性心血管疾病[8]。本實驗通過對模型組給予高脂飲食喂養，結果發現與對照組相比，模型組血清中的TC、TG、LDL明顯升高，HDL降低，提示高脂血癥模型造模成功。

動脈粥樣硬化形成因素眾多，其中高血脂尤為顯著。動脈粥樣硬化的發病機制“脂質浸潤學說”認為，過量的TC 在血管壁沉積后，引起巨噬細胞和平滑肌細胞吞噬脂質，形成泡沫細胞，同時使內皮增厚[9]。此外，過量的LDL積聚于內皮下，并被血管壁分泌的氧化活性物質氧化修飾形成ox-LDL，與此同時又觸發血管壁的炎癥反應，引發了如血管內皮細胞粘附分子-1（(VCAM-1)）、E-選擇素、P-選擇素等多種炎癥因子的表達[10]。在驅化作用下，單核細胞進入血管壁并分化為巨噬細胞，攝取ox-LDL成為泡沫細胞，進一步導致血管炎癥和動脈粥樣硬化的形成[11]。本實驗通過用HE染色和油紅O染色對血管內皮進行觀察，結果發現內皮不均勻增厚增厚，且有脂質沉積，內膜呈現粥樣硬化的早期病理改變。

內皮糖萼主要由蛋白聚糖、糖胺聚糖、糖蛋白、糖脂構成的復合物，是血管內皮的重要屏障[12]。釕紅染色是透射電鏡觀察糖萼的經典方法，但其具有局限性，因釕紅屬于大分子物質，不能完全進入整個糖萼層使其著色，影響觀察，并且釕紅易與糖萼側鏈作用改變其空間幾何構型，從而造成觀察上的假象，因此本實驗應用硝酸鑭示蹤來顯示內皮糖萼超微結構, 實驗結果直觀且明確。透射電鏡結果顯示與對照組相比，模型組內皮糖萼層變薄變稀疏，并伴有部分缺失的現象。提示高脂血癥可破壞內皮糖萼。有研究表明內皮功能障礙是動脈粥樣硬化病理進展的始動因素[13]。糖萼脫落導致內皮細胞結構發生變化，使其通透性增加，促進血管壁脂質沉積以及炎癥因子釋放，從而誘導單核細胞黏附、巨噬細胞浸潤以及泡沫細胞形成，加速動脈粥樣硬化疾病的進展[14]。此外，糖萼脫落導致細胞間通訊功能改變，剪切力傳導障礙，進一步促進動脈粥樣硬化斑塊的形成。

綜上所述，高脂血癥在影響內皮結構的同時還破壞內皮糖萼，而內皮糖萼的破壞又進一步促進了脂質的沉積，二者共同促進了動脈粥樣硬化的發生。本實驗為動脈粥樣硬化機理的闡釋及其防止提供新的理論依據。