肝癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的機制研究進(jìn)展

陳熙，李海龍

（甘肅中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000）

0 引言

肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC）是消化系統(tǒng)常見的腫瘤之一，其發(fā)病率在全世界惡性腫瘤中排名第六，并且仍然呈上升的趨勢[1]。全球每年有100萬新發(fā)的HCC患者，其中中國占比50%以上[2]。在國內(nèi)，其發(fā)病危險因素主要為HBV、HCV和食用發(fā)霉變質(zhì)的食物，而國外則以酒精性肝病和脂肪性肝病最為常見[3]。由于缺乏有效的藥物和治療方法，其死亡率仍在逐年上升，這主要是由于HCC是一個強侵入性的癌癥，與侵入血管和血行轉(zhuǎn)移相關(guān)。所以，深入研究HCC侵襲轉(zhuǎn)移的發(fā)病機理對于改善病人不良預(yù)后，提高病人生存期有極大的意義。

HCC是一種多因素共同作用導(dǎo)致的疾病，涉及轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor，TGF）β信號通路、Wnt/β-catenin信號通路、大鼠肉瘤蛋白（Rat sarcoma，Ras）/絲裂原活化蛋白 激 酶（Mitogen activated protein kinase，MAPK）信號通路和Notch信號通路等。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是細(xì)胞表型從上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)變，并伴隨上皮和間質(zhì)標(biāo)志物（如 VI、上皮型鈣黏蛋白、神經(jīng)型鈣黏蛋白、Slug、Snail和 Twist1）的變化，其與 HCC進(jìn)展有關(guān)[4]。HCC具有惡性增殖和侵襲能力，在轉(zhuǎn)移過程中，單個腫瘤細(xì)胞在EMT后，進(jìn)入血液循環(huán)，隨后擴散至其他部位[4]。本文將從幾種不同途徑詳述誘發(fā)和控制EMT對HCC侵襲、轉(zhuǎn)移過程的影響。

1 EMT的概念

EMT過程是可逆的，是上皮在某些條件下失去極后轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細(xì)胞的過程，這些間質(zhì)細(xì)胞在不同的條件下可恢復(fù)至上皮狀態(tài)，稱為間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化[5]。EMT參與胚胎形成，如組織形態(tài)、原腸的形成和出生后組織傷口的愈合等[6]。EMT可促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移，主要通過增強癌細(xì)胞的遷移、侵襲和對凋亡刺激的抵抗力，并且EMT來源的腫瘤細(xì)胞具有干細(xì)胞特性和顯著的耐藥性[7]。EMT的發(fā)生涉及不同的因子和通路，包括TGF-β、表皮生長因子、Notch信號通路、成纖維細(xì)胞生長因子、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)和肝細(xì)胞生長因子等[8]。EMT來源的腫瘤細(xì)胞既有形態(tài)學(xué)改變，又有分子學(xué)改變，如上皮細(xì)胞標(biāo)志物(ZO-1、occludin和上皮型鈣黏蛋白)表達(dá)降低、間質(zhì)標(biāo)志物(vientin、纖維連接蛋白、神經(jīng)型鈣黏蛋白和成纖維細(xì)胞特異性蛋白1)表達(dá)增加[7]，此外Twist、表觀遺傳調(diào)節(jié)因子、miRNAs和Zeb也在隨之而變化著[9]。

2 HCC與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)系

2.1 TGF-β在HCC上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用

TGF-β是一種多效細(xì)胞因子，根據(jù)哺乳動物的基因組，該家族由33個成員組成[10]。根據(jù)序列和結(jié)構(gòu)的相似性，這些蛋白質(zhì)大致分為兩個亞家族，BMP和生長分化因子屬于BMP亞類，而TGF-β、激活素、結(jié)節(jié)蛋白和左轉(zhuǎn)運蛋白屬于TGF-β亞家族[11]。其中TGF-β是20世紀(jì)80年代第一個被純化和克隆的，也是研究最廣泛的[12]。早期階段，TGF-β在可通過誘導(dǎo)細(xì)胞停滯和凋亡來抑制肝臟腫瘤的發(fā)生，但其在晚期階段可通過增強癌細(xì)胞存活、EMT、遷移、侵襲和最終轉(zhuǎn)移來促進(jìn)惡性進(jìn)展[13]。TGF-β可誘導(dǎo)HCC發(fā)生EMT，增加間質(zhì)細(xì)胞基因（如CD44）的表達(dá)，并維持上皮基因的表達(dá)；與干細(xì)胞相比，這些混合的上皮-間質(zhì)細(xì)胞具有更高的干細(xì)胞特性[14]。在HCC患者樣本中，TGF-β1的表達(dá)與EMT中間質(zhì)基因的增加有關(guān)，而與上皮基因的維持或過度表達(dá)無關(guān)[14]。

異常的TGF-β信號傳導(dǎo)與EMT和癌癥的發(fā)生相關(guān)，TGF-β 依賴于 Ras和MAPK途徑來誘導(dǎo)EMT，Ras響應(yīng)元件結(jié)合蛋白 1（RREB1）提供了Ras和 TGF-β 通路之間的分子聯(lián)系，用于協(xié)調(diào)誘導(dǎo)EMT和細(xì)胞的纖維化[15]。RREB1是一種 Ras轉(zhuǎn)錄效應(yīng)子，是 EMT 中 TGF-β 激活的 Smad轉(zhuǎn)錄因子的關(guān)鍵因子[16]。MAPK 激活的 RREB1 將TGF-β 激活的 Smad因子募集到 Snail；在癌細(xì)胞中，Smad和RREB1 直接驅(qū)動 Snail和纖維化因子的表達(dá)，刺激肌成纖維細(xì)胞，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞內(nèi)纖維化，并支持腫瘤細(xì)胞的生長[16]。TGF-β下游的非Smad依賴性通路在EMT 的發(fā)生和發(fā)展中也扮演重要角色，如 Wnt/β-cateni、Notch、MAPK、PI3K/Akt、MEK/ERK 和 JNK 等[17]。

2.2 Wnt/β-catenin信號通路在HCC上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用

Wnt/β-catenin 信號通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和遺傳穩(wěn)定性來控制生命早期的幾個發(fā)育過程和成熟組織的穩(wěn)態(tài)，并將成體前體細(xì)胞維持在多能狀態(tài)，這種信號傳導(dǎo)的畸變或突變與人類的多種疾病有關(guān)，包括癌癥、骨質(zhì)疏松癥、神經(jīng)變性和心臟代謝紊亂[18]。Wnt蛋白作為配體，是一種分泌型糖蛋白，與細(xì)胞表面的卷曲家族跨膜受體蛋白Frizzled(FZD)受體相互作用，激活細(xì)胞內(nèi)信號通路[19]。Wnt通路主要包括獨立的(非典型的)和β依賴的(典型的)連環(huán)蛋白信號（β-catenin）。非經(jīng)典的Wnt信號有多種作用機制，包括細(xì)胞極性和Ca2+途徑，在胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖和遷移等多個過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[20]。

經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號通路在在調(diào)節(jié)組織發(fā)育和維持體內(nèi)平衡方面起著關(guān)鍵作用，它的失調(diào)可促進(jìn)包括HCC在內(nèi)的各種肝病的發(fā)展[21]。β-catenin是典型的Wnt信號通路中一個關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄共激活因子，其有一個手臂重復(fù)結(jié)構(gòu)域，可以與E-鈣粘附素結(jié)合，形成細(xì)胞間的粘附連接，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞間的粘附[22]。

通過這種細(xì)胞間的作用，該信號通路參與細(xì)胞間連接、上皮細(xì)胞表型的調(diào)節(jié)、組織穩(wěn)態(tài)，但該信號途徑的損傷可能導(dǎo)致 EMT[4]。經(jīng)典的Wnt/β-catenin通路激活時β-catenin增多，它參與TCF/LEFLegless-PYGO DNA的調(diào)節(jié)，形成轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合物[23]。該過程涉及許多致癌基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，包括 MMP7、Myc、細(xì)胞周期蛋白 D1、CD44、Twist 和Snail，其中 Snail可調(diào)控端粒的分解、細(xì)胞間連接穩(wěn)定性、縫隙連接蛋白的表達(dá)和蛋白酶的表達(dá)，其表達(dá)受Wnt信號介導(dǎo)的EMT調(diào)節(jié)[4]。

經(jīng)典Wnt/β-catenin可激活EMT，其中β-catenin的轉(zhuǎn)位與經(jīng)典信號通路的激活有關(guān)，也是 EMT的標(biāo)志物[24]。當(dāng)使用Wnt和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2 （extracellular regulated protein kinases 1/2，ERK1/2）抑制劑抑制Wnt信號時，也同時抑制了EMT 表型[25]。

2.3 Notch信號通路在HCC上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用

Notch 信號通路參與生理和病理過程，包括腫瘤的發(fā)生和胚胎的發(fā)育。在癌癥進(jìn)展中，Notch介導(dǎo)的生物反應(yīng)涉及多種機制，包括血管生成和EMT[26]。在癌癥進(jìn)展中，EMT 賦予上皮癌細(xì)胞遷移和侵襲特征，主要通過連接蛋白的轉(zhuǎn)錄抑制實現(xiàn)，其中細(xì)胞 - 細(xì)胞粘附分子上皮型鈣粘蛋白在幾種侵襲性癌中受到了抑制[27]。在胚胎發(fā)育中各種高度保守的信號通路可觸發(fā)癌細(xì)胞中的 EMT，在這些通路中，Wnt、TGF-β 和 Notch 信號在誘導(dǎo)上皮型鈣粘蛋白的直接轉(zhuǎn)錄抑制物（包括Twist 、Zeb1/2和Snail/Slug）時共同發(fā)揮作用[27,28]。研究表明，Snail/Slug 的表達(dá)可通過與各種信號通路互相作用來上調(diào)Notch信號通路介導(dǎo)的EMT，這些相互作用的信號包括TGF-β、缺氧和雌激素/ G蛋白偶聯(lián)雌激素受體（G protein-coupld estrogen receptor, GPER）[26]。Snail是導(dǎo)致 EMT的多個信號通路的下游因子，其表達(dá)與不同類型腫瘤的轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后呈正相關(guān)[28]。在不同類型的癌細(xì)胞中，Notch 信號可通過直接誘導(dǎo)Snail 表達(dá)來促進(jìn)EMT[26]。在轉(zhuǎn)錄水平上，Notch 通過三方復(fù)合體NICD-CSL-MAML-1調(diào)節(jié)Snail 表達(dá)，而MAML-1的顯性負(fù)突變體 (DN-MAML-1)則可抑制癌細(xì)胞中的Snail 表達(dá)和 EMT[29]。Notch 還可通過一種間接機制來控制 Snail 蛋白的表達(dá)，該機制增強了缺氧癌細(xì)胞中Snail 蛋白的穩(wěn)定性[26]。

3 其他

除以上兩種重要信號通路外，一些蛋白的表達(dá)也可通過信號通路來促進(jìn)HCC發(fā)生EMT，如線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運體調(diào)節(jié)分子1（mitochondrial calcium uniporter regulator 1，MCUR1）、單過性跨膜蛋白（Nicastrin，NCSTN）、CD24、G 蛋白偶聯(lián)受體激酶相互作用蛋白-1（G-protein-coupled receptor interacting protein 1，GIT1）、缺氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia-inducible factor-1, HIF-1）α和腫瘤干細(xì)胞（Cancer stem cells，CSCs）等。

3.1 MCUR1在HCC上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用

MCUR1 在HCC中長期處于高水平表達(dá)，并促進(jìn)癌細(xì)胞存活，其在有轉(zhuǎn)移的HCC中的表達(dá)明顯增高，且與腫瘤的進(jìn)展有關(guān)。MCUR1可通過Snail促進(jìn)EMT，進(jìn)而促進(jìn)HCC的體外侵襲和體內(nèi)轉(zhuǎn)移。其介導(dǎo)的線粒體Ca2+信號可通過激活ROS/Nrf2/Notch1通路促進(jìn)HCC相關(guān)的EMT，抑制線粒體Ca2+攝取、ROS產(chǎn)生、Nrf2表達(dá)或Notch1活性可顯著抑制MCUR1誘導(dǎo)EMT和HCC轉(zhuǎn)移[30]。

3.2 NCSTN在HCC上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用

NCSTN是 γ-分泌酶的核心亞基，其在腫瘤進(jìn)展中起著至關(guān)重要的作用，與正常肝組織相比，其在HCC中顯著升高；其可通過上調(diào) Zeb1 誘導(dǎo)EMT，主要機制為：（1）NCSTN 促進(jìn)了 β-catenin 的核易位，β-catenin 是 Zeb1 的正轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子；（2）NCSTN 可通過Notch1 和PI3K/AKT 信號通路促進(jìn) β-catenin 激活，并通過切割 Notch1 增加 AKT和糖原合酶激酶3（glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β）磷酸化，從而減少 GSK-3β/β-catenin 復(fù)合物；（3）GSK-3β的失活抑制了β-catenin的降解，促進(jìn)了β-catenin的核轉(zhuǎn)位，啟動了Zeb1的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致了惡性表型[31]。

3.3 CD24在HCC上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用

CD24 是一種細(xì)胞表面蛋白，由包含27個氨基酸的核心蛋白組成，并通過磷脂酰肌醇與細(xì)胞膜結(jié)合[32]。CD24主要由免疫細(xì)胞表達(dá)，但通常在人類腫瘤中過表達(dá)，其與HCC的遷移、侵襲和增殖有關(guān)，并可作為CSCs的標(biāo)記物[33]。Wan等[34]研究指出，CD24 參與HCC的發(fā)生，其在HCC中的mRNA 和蛋白質(zhì)水平都呈高水平表達(dá)，可誘導(dǎo)EMT和促進(jìn)Notch信號通路介導(dǎo)的EMT，進(jìn)而誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞的激活和抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)（導(dǎo)致CD4+T和CD8+T細(xì)胞的比例明顯降低、細(xì)胞因子水平升高）來調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，促進(jìn)HCC的發(fā)生[34]。

3.4 HIF-1α在HCC上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用

CSCs是可自我更新的一類細(xì)胞，可出現(xiàn)在許多實體和非實體腫瘤中，其與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、耐藥和復(fù)發(fā)有關(guān)，Wnt/β-catenin、Hedgehog、TGF-β和Notch信號參與CSCs的自我更新過程[35]。EMT和CSCs在腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展中有共性[36]。

缺氧是腫瘤環(huán)境中始終存在的一種情況，主要是由于人體沒有足夠的血液支持腫瘤細(xì)胞的快速生長，其在腫瘤細(xì)胞的休眠、代謝、干細(xì)胞活性、轉(zhuǎn)移中起重要作用，同時這種環(huán)境導(dǎo)致了HIF-1α的產(chǎn)生，這種因子是一種螺旋轉(zhuǎn)錄因子，其可參與血管生成、糖酵解和腫瘤的生長[37]。缺氧和HIF-1α可以誘導(dǎo)HCC發(fā)生EMT，并增加HCC的耐藥性[38]。Jing等[36]研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT，促進(jìn)了HCC的CSCs特性，并且這一過程是由NICD和Notch1信號通路共同作用導(dǎo)致的；HIF-1α和Notch1在肝癌組織和化學(xué)誘導(dǎo)HCC模型中的表達(dá)均升高。

3.5 GIT1在HCC上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用

GIT1是GIT家族的成員，包括多種功能結(jié)構(gòu)域，一種多功能支架蛋白[39]。GIT1具有多種生物功能，如調(diào)節(jié)受體內(nèi)吞、細(xì)胞運動、細(xì)胞形態(tài)、血管生成和神經(jīng)功能等，其表達(dá)增加可促進(jìn)肝、結(jié)腸、黑色素瘤、肺和腎腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移[40]。GIT1對局灶性細(xì)胞遷移、粘附和片狀脂質(zhì)體的形成至關(guān)重要，可調(diào)節(jié)多條信號通路，包括MEK1/2-ERK1/2、NF-κB和Notch信號通路[41,42]Wang等研究表明：（1）GIT1在HCC組織中表達(dá)高于癌旁正常組織，可加速HCC的轉(zhuǎn)移、增殖和侵襲，并促進(jìn)體內(nèi)腫瘤的形成；（2）其可通過激活ERK1/2信號正向調(diào)節(jié)EMT促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展，是HCC預(yù)后不良的預(yù)測因子，與腫瘤的大小和栓子有關(guān)；（3）ERK1/2抑制劑（SCH772984）可減弱GIT1過表達(dá)引起的EMT改變[43]。

4 展望

EMT參與HCC的全過程，其受多種信號通路調(diào)節(jié)，在多種細(xì)胞因子的共同作用下促進(jìn)細(xì)胞的癌變。從不同的信號通路給予相應(yīng)的抑制劑可起到阻礙EMT的作用，但目前臨床中對HCC的轉(zhuǎn)移預(yù)防仍處于薄弱階段，需要進(jìn)一步研究肝癌EMT的相關(guān)機制，以尋求新的轉(zhuǎn)機。