精子形態學染色的現狀及發明專利的設計方案

史卿菁，胡玉清，湯姣，黃園，孫大林，丁旭鋒*

（1.宜興市婦幼保健院生殖健康科，江蘇 無錫 214200；2.宜興市婦幼保健院檢驗科，江蘇 無錫 214200；3.東南大學附屬中大醫院中西醫結合男科，江蘇 南京 210029）

0 引言

隨著國家生育政策的調整，男性不育癥成為社會關注的問題，需要進一步重視男性的生殖健康保健和檢查治療[1]，男性生育能力主要通過對精子的檢測來評價，主要的指標為精液量、精子濃度、精子活力、精子形態學檢查以及精子碎片指數等[2]。其中精子形態學檢查即精子畸形率檢查，可以有效評估精子使卵細胞受孕的能力[3]。有研究認為精子畸形率過高可以使配偶胚胎丟失，與女方的復發性流產相關[4-5]。依據2021年最新的《世界衛生組織人類精液檢查與處理的實驗室手冊》第六版[6]的要求，檢查精子的形態需要進行精子涂片后染色再進行檢測，仔細觀察精子的形態結構，稍有不足即為異常。精子形態學檢查的染色和普通病理學診斷的染色要求不完全一致，精子形態學檢查的染色對染色時間和染色深淺度要求較高。

1 精子染色的現狀

1.1 染色試劑

精子染色的方法有多種，目前常用的染色方法有三種，分別是Shorr染色、巴氏染色、Diff-Quik染色法[7]。染色需要用固定液及染色劑等2種以上的化學試劑，臨床較常用的Diff-Quik染色法需要依次使用三種化學試劑，分別是固定液、染色劑A、染色劑B，三種試劑按順序與涂有精子的玻璃片進行接觸，玻璃片在接觸后一種試劑的時候，要盡量減少前一種試劑的殘留，但是不能用紙或布擦拭，目前一般采用蒸餾水沖洗后風干，每一種試劑接觸精子玻片時間的長短會影響到精子染色的深淺，而染色的深淺會影響精子形態學的診斷結果，即影響精子畸形率。精子玻片的染色效果不光與染色劑持續的時間相關，與染色試劑純度也相關，與染色劑的溫度也有關，因此，染色的環境溫度、染色劑的純度、染色時間都應該標準化[8]。

1.2 常用的染色方式

目前使用的各種染色方法主要通過兩種基本的染色方式，即滴染和浸染。滴染的主要步驟是幾種染色試劑按時間依次滴于玻璃片表面，這種染色方式的優點主要是不同試劑之間不易導致混和，試劑的純度有保證。浸染的主要步驟是把玻璃片按順序浸到幾種染色試劑里，這種方式分為手工和自動，其優點是玻璃片接觸試劑的時間可以嚴格統一，特別是采用自動化設備開展的成批量浸染。目前只有少量的大型醫療機構采用節省人力的自動化精子染色。對于臨床檢驗，采用快速、精準、簡單標準化的染色技術對精子形態學檢查有重要意義[9-10]。

1.3 目前染色技術的弊端

據研究統計[11]目前精子形態學檢查前的精子處理方式不統一，精子的洗滌、涂片、染色、以及進行精子形態學診斷的檢驗人員較難標準化，對精子畸形率檢測結果影響較大，其中精子的染色過程標準化是一個難點，據陸金春綜述分析[12]精子染色的方法、染色的時間不一致，對精子形態學的檢測結果影響很大。目前臨床使用滴染的缺點為純手工進行，染色過程中每一步驟的時間不統一，對于標本數量較多的單位，該種方式很不方便，也容易導致試劑的浪費。浸染最大弊端是玻璃片接觸前一種試劑后可將附著的試劑帶到后一種試劑內，后一種試劑的純度易改變，一組試劑數次使用后，試劑純度的改變容易影響染色的效果，經常更換試劑也是較大的浪費。臨床多數醫療機構精液檢查的樣本量相對較小，較難采用全自動化的精子染色方法。

2 發明專利的設計

2.1 設計目的

本發明專利根據目前臨床精子染色過程中的不足，設計了一種構造比較簡單，制造成本較低，操作過程比較方便的裝置，可有效杜絕不同試劑之間的混合，以實現精子染色及形態學診斷全過程的標準化。

2.2 發明專利

發明專利名稱：半自動精子染色儀。專利號：ZL 2015 1 0687294.4 申請時間：2015年10月22日，發明專利授權公告時間：2018年2月13日。第一發明人：丁旭鋒。專利權人：宜興市婦幼保健院。

2.3 專利的主要創新

本發明專利創新性的使用壓染的方式，和以往的染色方式有明顯的不一樣，并設計有專門的時間控制儀，控制染色過程中的每一步程序的時間，有效地避免了試劑容易出現混和的弊端，在常規的室溫的情況下可以統一精子染色的每一步程序，有助于統一精子形態學診斷的標準。為以后人工智能技術用于精子形態學診斷提供了可行性。

2.4 發明技術方案

（1）本裝置主要包括長方體的基座，基座中沿長邊并列排布有若干條可以存放少量染色試劑的小容器，以及位于基座上方的一組手工壓染裝置，壓染裝置主要是指與基座短邊相平行的壓板，以及壓板上設置有可裝卸的若干個涂覆有精子的玻璃片，壓板的兩端設計滑動連接裝置，可以使壓板能靈活上下翻轉，并且可以沿基座的長邊往返滑動。

（2）存放染色試劑的容器主要包括可拆卸的長方體基體以及鑲嵌在基體上的多個柔性碗狀存放染色試劑的容器，所述容器用彈性塑膠制成，在外力作用下可以輕度變形。

（3）壓板中固定的涂覆有精子的玻璃片與碗狀存放染色試劑容器的位置對應，翻轉壓板玻璃片可以接觸到碗狀存液容器中的液體。

（4）壓板的長邊設置有柱狀壓桿，壓桿兩端突出為把手，染色時雙手握住兩側把手。

（5）壓桿上對應于玻璃片的方向設計了出水口和出風口，出水口和出風口通過柔性管道連接基座的供水及送風系統，以便沖洗及風干。

（6）基座的長邊上設計有時間顯示器，壓桿的把手附近設計時間顯示器的按鍵，控制及計算時間。

2.5 附圖說明

圖1為本發明的結構示意圖。

圖1

圖中標記簡介如下：1是長方體的染色儀基座。2是設置于基座上沿長邊并列排列的可拆卸的3條存放染色試劑容器條。3是設置于基座上方的可以翻轉壓染裝置；3.1是長邊與基座短邊水平的壓板；3.1.1是數塊涂覆有精子的玻璃片，固定在壓板3.1上。4是滑動連接裝置，位于壓板3.1的長邊兩端，滑動裝置可以使壓板上下翻轉也可以沿基座的長邊往復滑動。2.1是與基座1固接的條狀可拆卸的基體；2.2是設置在條狀的基體上的數個彈性碗狀存液容器，與涂覆有精子的玻璃片3.1.1位置相互對應。5是導軌槽，所述滑動連接裝置4鑲嵌于導軌槽5內，可以沿導軌槽5前后滑動。6是壓桿，位于壓板3.1的長邊上；6.1是把手，位于壓桿6的兩端延長部分；6.2是出風口，6.3是出水口位于壓桿6上；出風及出水方向對應玻片方向，每一塊玻片均有出風口和出水口。7是時間提示器，位于基座1上。8是計時器按鈕位于壓桿6上。

3 發明專利的使用過程描述

精液在恒溫水浴箱中液化后采用精液分析儀檢測精子濃度及活力，剩余的精液標本進行精子形態學檢查，精子染色前，需要對精液進行洗滌和稀釋，根據精子的濃度規范精液洗滌和稀釋的具體方案，使洗滌后稀釋的精液的濃度基本一致，取固定量的稀釋后的精液進行涂片，涂片干燥后的精子玻片放置在本案設計的半自動精子染色儀上進行染色，一般是5～6張玻片同時進行染色。具體操作如下：將玻片固定于3.1.1處，將壓板3.1壓于對應于的2.2碗狀存液器（事先在存液器中加液0.1～0.2mL）,玻片接觸試劑固定時間后時間提示器7會自動提示，手工提起壓板3.1，玻片上的液體會自動往下流，出風口6.2會自動出風吹走液體，出水口6.3會有少量出水進行沖洗玻片，再風干，完成第一排液體的接觸后，按同樣的方式接觸第二排液體，接觸第三排液體。在染色過程中，固定劑或染色劑均保證了同樣的濃度，無混合。玻片接觸固定劑或染色劑的時間以及沖水風干的時間均實現了標準化。染色完成后取下玻璃片進一步干燥后待檢測。將染色液容器條2取下進行充分清洗干凈備用，在實踐過程中可以準備多個容器條2，使用完畢后一起清洗，晾干。本專利設備適合每天精子形態學檢查標本量5～30例左右的中小型醫療機構。

4 總結

精子形態學診斷是評估男性生育能力的重要途徑，目前多數醫療機構特別是廣大的基層醫療機構因為每天的標本量較少，無法采用全自動的染色設備，手工的滴染或浸染較難實現精子染色的標準化，本發明專利采用半自動方式，設備成本很低，體積較小，創新地采用壓染的方式，對染色的每一步驟都可以進行標準化，使用方便，有效地解決了目前手工染色過程中相關不足，便于精子形態學檢查的標準化質量控制，也為未來人工智能自動化閱片提供了保障[13]。