超聲預處理對花生分離蛋白微凝膠顆粒結構及其Pickering乳液特性的影響

葛艷爭，石愛民，任廣躍 ，劉 哲，李嗣生，職蘭懿，王 強,，杜祖波

（1.河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471000；2.中國農業科學院農產品加工研究所，農業農村部農產品加工綜合性重點實驗室，北京 100193；3.山東魯花集團有限公司，山東 萊陽 265200）

食品級Pickering乳液是用天然食品大分子固體顆粒（蛋白質、多糖等食品級顆粒）對油水界面穩定制備的一種新型乳液。與傳統乳液相比，Pickering乳液具有較高的穩定性，不易受外界環境因素的影響，且生產成本低、環境友好。因此，由食品級顆粒穩定的Pickering乳液的開發在食品和醫藥等研究領域有廣泛應用前景。

大豆蛋白、玉米醇溶蛋白、乳清蛋白、大米蛋白、豌豆蛋白等均可有效地穩定Pickering乳液體系。近年來，由于花生蛋白來源豐富、具有優異的營養價值，且對人體健康的有益影響，已被運用在食品配方中。花生分離蛋白（peanut protein isolate，PPI）是最具有商業價值的花生蛋白產品，并且PPI具有優異的乳化性、凝膠性、持水性等多種功能特性，具有發展為Pickering乳液穩定劑的潛力。

目前，制備食品級固體顆粒的方法主要采用復合改性法，分別有加熱復合離子誘導法、加熱復合酶法、超聲復合水解法等。Ning Fangjian等通過加熱和鹽離子雙重誘導法制備了具有較好潤濕性的PPI納米顆粒，并用其穩定了O/W型Pickering乳液。Jiao Bo等利用加熱復合酶法制備PPI納米顆粒，并用其穩定了高內相Pickering乳液。Zhang Xinxia等采用超聲預處理復合酸水解大米蛋白的方法，制備了一種球形結構的大米肽納米顆粒，證實超聲可以顯著減小固體顆粒的粒徑。超聲處理具有效率高、操作簡單、無需化學處理更綠色且更適合于食品加工等優勢，且有研究表明超聲預處理可以改變蛋白質的二級結構，使其三級結構變的舒展，暴露更多的疏水性殘基，有利于酶交聯反應的進行。

因此，本研究以PPI為原料，利用超聲預處理，隨后經過谷氨酰胺轉氨（glutamine transaminase，TG）酶交聯得到PPI凝膠進行高速剪切和高壓均質制備花生分離蛋白微凝膠顆粒（peanut protein isolate microgel particles，PPIMP），構建Pickering乳液體系，并對PPIMP的相關性質及其穩定的Pickering乳液特性進行研究，以期為Pickering乳液在食品工業中的應用提供理論依據和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花生蛋白粉（蛋白質量分數（47.22±0.06）%、油脂質量分數（5.27%±0.06）%、灰分質量分數（4.97±0.03）%） 青島長壽食品有限責任公司；葵花籽油 佳格食品（中國）有限公司；TG 酶北京索萊寶科技有限公司；氫氧化鈉 國藥集團化學試劑有限公司；8-苯胺-1-萘磺酸（1-anilino-8-naphtaalenesulfonate，ANS） 北京百靈威科技有限公司；尼羅紅、尼羅藍 美國Sigma公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

KQ-500DE型數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；DHR-2流變儀 美國TA儀器公司；激光共聚焦顯微鏡 德國Leica公司；Mastersizer3000激光粒度分析儀、Nano-ZS型激光粒度儀 英國Malvern公司；Freezee zone 6真空冷凍干燥機 美國Labconco公司；T18 digital高速剪切機 美國IKA公司；AH-100D高壓均質機 上海ATS公司；J-1500圓二色譜儀日本分光株式會社；多重光散射穩定性分析儀 法國Formulaction公司。

1.3 方法

1.3.1 PPI的制備

參考本研究團隊前期實驗方法并略有改動。將花生蛋白粉與去離子水按1∶10（g/mL）比例混合，用1 mol/L的NaOH溶液調節pH 9.0，再將混合液在室溫下攪拌2 h，4 200 r/min離心10 min取上清液。然后，用1 mol/L的HCl溶液將上清液調pH 4.5，4 200 r/min離心10 min。最后，收集沉淀，并用1 mol/L的NaOH溶液調pH 7.0，冷凍干燥獲得蛋白質質量分數為91.52%的花生分離蛋白。

1.3.2 超聲預處理

制備質量分數為15%的PPI溶液，室溫下攪拌2 h，并調pH 7.0后放入冰箱冷藏過夜。超聲時間分別設置為0、10、20、30、40 min，超聲功率為500 W處理PPI溶液。

1.3.3 PPIMP的制備

參考本研究團隊前期實驗方法并略有改動。將TG酶（20 U/g PPI）加入到處理后的PPI溶液中并在45 ℃水浴加熱4 h。加入2 倍體積的去離子水，隨后使用高速剪切機12 000 r/min剪切2 min，再通過高壓均質機在50 MPa的壓力下均質2 min得到PPIMP分散液。

1.3.4 PPIMP粒徑及Zeta電位的測定

采用Nano-ZS型激光粒度儀對PPIMP進行粒徑與Zeta電位分析。使用超純水將顆粒質量分數稀釋到0.5%，取1 mL樣品緩緩地加入到樣品池中，防止氣泡產生。

1.3.5 表面疏水性測定

參考Zhu Xuefeng等的方法并略有改動。用0.01 mol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖液配制1 mg/mL的蛋白溶液，室溫下10 000×離心20 min后取上清液，用Lowry法測定蛋白濃度。分別將上清液稀釋2、4、8、10 倍后取4 mL加入20 μL的8 mmol/L的ANS熒光探針。在避光條件下，發射波長和激發波長分別為390 nm和470 nm，狹縫5 nm，用熒光分光光度計測定樣品表面疏水性。

1.3.6 傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）分析

參考Mohsin等的方法并略作修改，將處理后的樣品冷凍干燥，再以1∶100比例與溴化鉀混合均勻研磨，并將其壓制成薄片，在波數范圍400～4 000 cm，掃描64 次。

1.3.7 圓二色譜分析

參考操強等的方法并略作修改。將PPIMP配制成0.1 mg/mL的溶液，以超純水為空白在190～250 nm掃描，樣品池光程長為1 mm。

1.3.8 乳化性和乳化穩定性分析

參考Feng Haiying等的方法并略有改動。取20 mL質量分數為1%的PPIMP與5 mL葵花籽油混合，12 000 r/min高速剪切2 min制備成乳液，從底部迅速吸取50 μL加入到4 950 μL 0.1%的十二烷基硫酸鈉溶液混勻，在500 nm波長處測定吸光度。靜置10 min后，以相同方法再次測定吸光度。乳化性和乳化穩定性按式（1）和（2）計算。

式中：為初始吸光度；為稀釋因子；為乳液中的油相體積分數/%；為蛋白質的初始質量濃度/（g/mL）；為10 min后的吸光度；-為兩次測定時間的差值。

1.3.9 Pickering乳液的制備

將制備的PPIMP分散液稀釋到蛋白質質量分數為0.5%，再向上述PPIMP分散液中加入葵花籽油使其體積分數分別達到65%、70%、75%、80%，在10 000 r/min剪切2 min得到Pickering乳液。

1.3.10 Pickering乳液粒徑的測定

參考本研究團隊前期實驗方法并略有改動。采用Mastersizer 3000激光粒度分析儀測定Pickering乳液的粒徑分布以及平均粒徑，用去離子水作為分散劑（1.330），乳液的折光系數為1.471。

1.3.11 Pickering乳液的穩定性動力學指數（turbiscan stability index，TSI）分析

取約20 mL新鮮制備的Pickering乳液于Turbiscan穩定性分析儀專用圓柱形玻璃瓶中，保持樣品瓶外壁潔凈，內壁無樣品區域無殘留，液面平整。在設定溫度（55 ℃）下每隔30 min對樣品掃描一次，共掃描6 h。利用Turbisoft軟件計算乳液隨時間變化的TSI值。

1.3.12 Pickering乳液流變學特性的測定

參考本研究團隊前期實驗方法并略有改動。通過1 Hz的應變掃描得到樣品的線性黏彈區域，所有樣品的測試均在該線性黏彈區范圍內測試。25 ℃條件下，以直徑為40 mm的鋁制平板，在剪切速率1.0～100 s內進行乳液表觀黏度的測定。設置角頻率為0.1～100 rad/s，頻率掃描測量的應變振幅為0.5%，得到頻率掃描曲線。

1.3.13 Pickering乳液激光共聚焦顯微鏡分析

取0.5 mL乳液置于激光共聚焦培養皿中，加入10 μL（1∶1）尼羅紅和尼羅藍混合染料（用異丙醇溶解），混合均勻后，于避光條件下染色30 min。將染色后的乳液置于載物臺上，在488 nm和633 nm激發波長觀察。

1.4 數據處理與分析

每個實驗均重復3 次取平均值，使用Origin 8.5軟件作圖。采用SPSS 19.0軟件進行數據處理和顯著性分析，＜0.05，差異顯著。

2 結果與分析

2.1 超聲時間對PPIMP粒徑及電位的影響

超聲時間對PPIMP 平均粒徑與平均分散系數（polymer dispersity index，PDI）的影響如表1所示，隨著超聲時間的延長，PPIMP的平均粒徑先減小后增大。與未超聲的PPIMP平均粒徑相比，超聲時間為20 min的PPIMP平均粒徑從372.95 nm減小至284.38 nm。與劉競男等研究超聲處理大豆分離蛋白時得到結論相似，其可能原因是超聲處理產生的空化效應使蛋白由大分子物質分解成小分子顆粒。超聲時間延長至40 min時，PPIMP的平均粒徑又逐漸增大至356.40 nm，這可能是超聲過程中蛋白質的重聚現象導致。所有樣品的PDI均小于0.5，表明分散液是均勻且穩定的體系。固體顆粒的粒徑大小直接影響Pickering乳液的液滴大小，粒徑越小其吸附能力越強，越有利于形成穩定性更高的Pickering乳液。由此可知，經過超聲預處理后的PPIMP更有利于Pickering乳液的穩定。

表1 超聲時間對PPIMP粒徑和Zeta電位的影響Table 1 Effect of ultrasonic time on the particle size and zeta potential of PPIMP

超聲時間對PPIMP Zeta電位的影響見表1，超聲處理前后PPIMP的Zeta電位均為負，且Zeta電位絕對值均在30～40 mV之間。在超聲時間為20 min時，PPIMP的Zeta電位絕對值最大（35.38 mV），表明此時蛋白顆粒之間的靜電斥力最大，最不易發生聚集，這與粒徑的結果一致。而隨著超聲時間的增加，PPIMP的Zeta電位的絕對值先增大后減小。可能原因是超聲處理使蛋白質中的極性基團暴露。

2.2 超聲時間對PPIMP表面疏水性的影響

用ANS作為熒光探針檢測不同超聲時間處理的PPIMP的表面疏水性變化如圖1所示，隨著超聲時間的延長，表面疏水性先增高后降低。超聲時間為0 min的PPIMP表面疏水性最小為109.54，超聲時間為20 min的PPIMP表面疏水性最大為138.16。本研究表面疏水性的增長效果明顯高于超聲-TG酶對紅豆蛋白的表面疏水性的影響。表面疏水性對固體顆粒的乳化性有決定性的影響，表面疏水性的提高有利于增強PPIMP的乳化效果。Wang Yuntao等的研究表明在一定的超聲時間內，鷹嘴豆分離蛋白的表面疏水性隨超聲時間的延長而升高。當超聲時間過長時，蛋白質的表面疏水性降低，可能是過度的超聲處理過程中會產生熱量，冷卻過程中，蛋白質的疏水相互作用將導致蛋白質聚集，從而導致其表面疏水性降低，該結果和Cui Qiang等研究結果一致。這些結果表明適宜的超聲處理產生的空化效應會改變蛋白質的空間結構，導致蛋白氫鍵和分子間作用力裂解，蛋白內部的疏水基團暴露，使其表面疏水性增強。

圖1 超聲時間對PPIMP表面疏水性的影響Fig.1 Effect of ultrasonic time on the surface hydrophobicity of PPIMP

2.3 超聲時間對PPIMP二級結構的影響

如圖2所示，FTIR主要峰是3 600～3 100 cm（N—H伸縮和氫鍵）和1 600～1 700 cm（C＝O伸縮和氫鍵）。不同超聲時間處理的PPIMP在1 605 cm均具有強吸收峰。此外，超聲時間為20 min的PPIMP與未經超聲處理的PPIMP相比，3 285 cm處的吸收帶變得更寬，這可能是由于超聲破壞了蛋白中的氫鍵作用，使蛋白質分子展開。圓二色譜分析進一步研究了超聲時間對PPIMP二級結構影響。將圖譜用CD Pro擬合軟件分析，數據如表2所示。超聲處理20 min的PPIMP，-螺旋相對含量增加、-折疊相對含量降低。這可能是超聲的空化效應破壞了蛋白質的剛性結構，而使蛋白質的柔性結構增加。

圖2 不同超聲時間處理PPIMP的FTIR圖Fig.2 FTIR of PPIMP treated by ultrasonic for different periods of time

表2 圓二色譜測定不同超聲時間處理的PPIMP二級結構相對含量Table 2 Relative content of secondary structures in PPIMP treated by ultrasonic for different periods of time determined by circular dichroism spectroscopy %

根據粒徑、Zeta電位、表面疏水性、二級結構、乳化性及乳化穩定性結果可推測，經過超聲預處理改變了PPI空間結構，導致蛋白氫鍵和分子間作用力裂解，疏水基團暴露，有利于TG酶交聯形成凝膠。再通過高速剪切與高壓均質的撞擊、空穴等作用力將凝膠塊破碎，得到納米級的PPIMP。

2.4 超聲時間對PPIMP乳化性及乳化穩定性的影響

乳化性表示蛋白質促進乳液形成的能力，用于表征乳狀液乳化特性；乳化穩定性表示賦予乳液抗應變的能力，以抵抗在一定時間內發生的不穩定性變化，如聚結、絮凝或沉淀等，用于表征乳狀液穩定狀態。如圖3所示，隨著超聲時間延長，PPIMP的乳化性及乳化穩定性均呈先增加后降低的趨勢。超聲時間20 min時，乳化性（20.14 m/g）及乳化穩定性指數（166.42 min）均達到最大值，且具有顯著差異（＜0.05）。王喜波等研究的超聲時間對大豆-乳清混合蛋白乳化性質的影響也得到了相似的結論，可能原因是超聲20 min時暴露了更多的疏水性基團，從而導致蛋白質與油的相互作用增強。這一結果與PPIMP表面疏水性的結果一致。此外，當超聲時間超過30 min時，乳化性及乳化穩定性均有所降低，可能原因是超聲時間過長，蛋白質的重聚現象嚴重而不利于疏水基團的暴露，導致乳化性及乳化穩定性有所降低。

圖3 超聲時間對PPIMP乳化性（A）及乳化穩定性（B）的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on the emulsifying capacity (A) and emulsion stability (B) of PPIMP

2.5 Pickering乳液粒徑分布及平均粒徑分析

制備蛋白質質量分數為0.5%，油相體積分數分別為65%、70%、75%、80%的Pickering乳液。未經超聲處理PPIMP制備的Pickering乳液在放置10 min后出現乳析現象，故未對其進行系統的性質表征。超聲20 min PPIMP制備的Pickering乳液，放置10 min后呈現為均一的乳液體系。圖4為不同油相體積分數（65%～80%）Pickering乳液的粒徑分布及平均粒徑圖。隨著油相體積分數的增加，Pickering乳液的平均粒徑先減小后增加，在油相體積分數為75%時，乳液的平均粒徑最小。由粒徑分布圖（圖4A）可以觀察到，隨著油相體積的增加，粒徑分布圖中的主峰位置先逐漸向小尺寸移動（65%～75%），后又向大粒徑方向移動（75%～80%）。這可能是油相體積分數為80%時，乳液屬于高內相乳液，液滴之間會相互擠壓，測定時攪拌分散不完全。也可能是質量分數為0.5%的PPIMP不能完全包裹住所有液滴，加劇了乳液的絮凝，從而使粒徑增大，這與劉付用大豆蛋白穩定的Pickering乳液粒徑結果一致。

圖4 不同油相體積分數制備的Pickering乳液的粒徑分布（A）及平均粒徑（B）Fig.4 Particle size distribution (A) and average particle size (B) of Pickering emulsions prepared with different oil phase volume fractions

2.6 Pickering乳液穩定性分析

TSI能夠便捷地比較樣品之間的穩定性差異，是分析乳液體系物理穩定性的重要指標。與起始線的偏差越大（TSI＝0），曲線的斜率越小表示體系越穩定。圖5顯示了不同油相體積分數制備Pickering乳液TSI隨時間的變化，TSI在0～5 000 s左右時，不同油相體積分數Pickering乳液的TSI值變化較大，之后變化較平緩。TSI數據表明乳液的穩定性順序為：油相體積分數80%＞75%＞70%＞65%。油相體積分數為65%的Pickering乳液TSI值最大為0.84（斜率最大），油相體積分數為80%的Pickering乳液TSI值最小為0.33（斜率最小）。當內相體積分數大于74%時，稱為高內相乳液。對于高內相乳液，內相體積分數越大，乳液越穩定。當油相體積分數為80%時，乳液的TSI值最小，即乳液最穩定，這與PPIMP不能完全包裹住所有的液滴而液滴間形成橋接絮凝狀網絡結構有關。

圖5 不同油相體積分數制備的Pickering乳液TSI隨時間的變化曲線Fig.5 Turbiscan stability index of Pickering emulsions prepared with different oil phase volume fractions as a function of time

2.7 Pickering乳液流變分析

如圖6A所示，所有乳液隨著剪切速率的增大黏度逐漸下降，表現出典型非牛頓假塑性行為（剪切稀化）。這種剪切稀化行為是乳液間的弱締合相互作用。在相同的剪切速率下，隨著油相體積分數的增加，Pickering乳液的表觀黏度越大。該結果和江連洲等研究大豆分離蛋白凝膠顆粒穩定的Pickering高內相乳液黏度結果一致。

圖6 不同油相體積分數制備的Pickering乳液的靜態（A）、動態（B）流變分析圖Fig.6 Rheological analysis of Pickering emulsions prepared with different oil phase volume fractions

由圖6B可以觀察到，油相體積分數大于等于70%時，表現出彈性凝膠行為，在頻率掃描范圍內，彈性模量始終大于黏性模量。另外，在同一頻率下，隨著油相體積分數的增加，彈性模量和黏性模量逐漸增加。研究表明PPIMP穩定的Pickering乳液的流變行為受油相體積分數影響，油相體積分數越高，越容易形成緊密的網絡結構，有利于乳液的穩定。

2.8 Pickering乳液微觀結構分析

PPIMP和食用油分別被尼羅藍和尼羅紅標記為綠色和紅色。由圖7可以觀察到，綠色的蛋白顆粒包裹著紅色油滴，說明乳液均為水包油型。當油相體積分數由65%增加到80%時，液滴大小呈現先減小后增大的趨勢。油相體積分數為80%時，會出現液滴和液滴絮凝，液滴間排布緊密相互擠壓而失去球形。這可能是由于可用固體顆粒的數量不足以穩定所有液滴，固體顆粒可以橋接液滴，界面上的顆粒與水相中顆粒形成了橋連絮凝，使乳液體系更加穩定。

圖7 不同油相體積分數制備的Pickering乳液的CLSM圖Fig.7 CLSM micrographs of Pickering emulsions prepared with different oil phase volume fractions

3 結論

隨著超聲時間的延長，PPIMP的平均粒徑先增高后降低，表面疏水性、乳化性及乳化穩定性先增大后減小。在超聲時間為20 min時，平均粒徑最小，且表面疏水性、乳化性及乳化穩定性指數最大。此外，采用超聲時間20 min的PPIMP制備不同油相體積分數的乳液，均為水包油型Pickering乳液，非牛頓假塑性流體。乳液穩定性結果表明，當油相體積分數為80%時，制備的高內相Pickering乳液最穩定。因此，通過超聲預處理制備的PPIMP可作為一種有效的Pickering穩定劑，且PPIMP的成功制備對花生蛋白產品的開發具有重要意義。