基于兩種預處理方法的白酒酒醅微生物宏蛋白質組學比較

郭小蛟，唐玉明,2，田新惠,2，何勁松，劉成元,2，馮 軍,2，劉茂柯,2,

（1.四川省農業科學院水稻高粱研究所，四川 德陽 618000；2.四川省瀘州市釀酒科學研究所，四川 瀘州 646100）

中國白酒釀造依賴酒醅微生物的協同發酵。揭示酒醅微生物群落演替對白酒香味物質形成的影響是釀酒領域的研究熱點。目前針對酒醅微生物的研究主要集中于宏基因組水平，宏蛋白質組學研究相對緩慢。蛋白質是基因功能的執行者，宏蛋白質組學是對微生物群落活動的直接表征。酒醅微生物宏蛋白質組學的匱乏阻礙了對白酒發酵機理的深入認識。

環境樣品的理化性質復雜多樣，無法形成統一的蛋白質提取方法。普遍情況下，環境樣品需經液氮研磨和超聲波破碎等方法使蛋白質充分釋放后才能獲得較好的提取效果。但不同于普通的環境樣品，酒醅富含糧谷蛋白質，液氮研磨處理可能使其與微生物蛋白質混為一體。這可能導致在蛋白質的搜庫鑒定中，將糧谷蛋白質誤歸于微生物，出現假陽性結果。在動物組織的宏蛋白質組學研究中，有報道稱離心技術能有效分離動物組織和微生物菌體，降低宿主蛋白質對研究結果的影響。

基于此，本研究分別采用離心-超聲波破碎法（centrifugation-ultrasonic disruption，C-UD）和液氮研磨-超聲波破碎法（liquid nitrogen grinding-ultrasonic disruption，LNG-UD）提取酒醅微生物蛋白質，采用非標記定量蛋白質組學技術進行檢測，比較兩種樣品預處理法獲得的微生物群落結構差異，旨在為相關領域的深入研究提供一定依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

濃香型白酒酒醅樣品采自瀘州市某白酒企業。釀造結束后以窖池表面中心位置為采樣點，利用課題組專利采集窖池上、中、下層酒醅，等量混合作為供試樣品，-80 ℃保存。

甲酸、乙腈、質譜水、丙酮、蛋白標準品、苯甲基磺酰氟、SOLASPE 96 孔板、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法蛋白質定量試劑盒美國Thermo Fisher Scientific公司；乙二胺四乙酸二鈉（ethylene diamine tetracetic acid disodium，EDTA-2Na）、甲醇、蔗糖、NaCl、二硫蘇糖醇、聚丙烯酰胺、四乙基溴化銨、Tris-HCl 生工生物工程（上海）股份有限公司；胰蛋白酶、碘代乙酰胺 美國Sigma-Aldrich公司；DNA抽提試劑盒 美國MP Biomedicals公司；Sensil 110 C-AQ色譜柱（250 mm×75 μm）澳大利亞IonOpticks公司。

1.2 儀器與設備

EASY-nLC1200液相色譜儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；Tims TOF Pro質譜儀 德國Bruker Daltonics公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）儀 美國Bio-Rad公司；5810R臺式冷凍離心機 德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 酒醅蛋白質提取

LNG-UD法：1 g酒醅樣品經液氮研磨后加入離心管中，加入緩沖液（含0.70 mol/L蔗糖、0.01 mol/L NaCl、0.04 mol/L EDTA-2Na、0.01 mol/L二硫蘇糖醇、0.13 mol/L pH 6.8 Tris-HCl、0.38 mol/L pH 8.8 Tris-HCl），加入苯甲基磺酰氟使其濃度為1 mmol/L。80 W冰上超聲共3 min（超聲1 s、間歇1 s）。

C-UD法：向1 g 不經液氮研磨的酒醅樣品中加入緩沖液和苯甲基磺酰氟后超聲波破碎（同LNG-UD法）。將上層漂浮的谷殼去除后，4 ℃、514×離心20 min，吸取中層溶液轉移至新的離心管。

分別向兩種預處理方法獲得的溶液加入中等體積pH 7.8 Tris飽和酚，采用Tris/酚提取-甲醇/醋酸銨沉淀法提取蛋白質。每個處理設置3 個重復。

1.3.2 蛋白質定量和SDS-PAGE

采用BCA試劑盒進行蛋白質定量。從每個樣品取10 μg蛋白質進行SDS-PAGE分析。

1.3.3 酶解及肽段除鹽

將各處理3 次重復提取的蛋白質溶液等量混合，加入二硫蘇糖醇使其終濃度為5 mmol/L，55 ℃孵育30 min。冷卻后加入碘代乙酰胺使其終濃度為10 mmol/L，避光放置15 min。加入6 倍體積的丙酮于-20 ℃過夜。4 ℃、8 228×離心10 min，收集沉淀。加入 100 μL四乙基溴化銨復溶沉淀，以胰酶與蛋白質質量比1∶50加入胰酶，37 ℃過夜。酶解后采用SOLASPE 96 孔板脫鹽。

1.3.4 液相色譜-質譜聯用分析

將除鹽后的肽段溶解于100 μL的流動相A，用EASY-nLC1200液相色譜儀進行分離。色譜條件：Sensil 110 C-AQ色譜柱（250 mm×75 μm）；流動相：A為0.1%甲酸溶液（/）；B為甲酸-乙腈-水溶液（0.1∶80∶19.9，/）；流速300 nL/min；梯度洗脫：0～66 min，97%～73% A、3%～27% B；66～73 min，73%～54% A、27%～46% B；73～84 min，54%～0% A、46%～100% B；84～90min，0% A、100% B。

質譜條件：毛細管電壓1.4 kV；干燥氣溫度180 ℃；流速3 L/min；掃描范圍/100～1 700；電噴霧離子源；離子淌度范圍0.6～1.6 cm/（V·s）；碰撞能20～59 eV。

1.3.5 蛋白質檢索鑒定

質譜數據采用Proteome Discoverer 2.2在Uniprot數據庫進行約束性和非約束性檢索。檢索參數：假陽性率0.01，漏切位點數2，固定修飾為脲甲基化；可變修飾為氧化（M）；誘餌數據庫模式為反向；酶為胰蛋白酶；質譜容忍度20；特征肽段1。

1.3.6 擴增子測序

為指導蛋白質的約束性檢索，對酒醅樣品進行擴增子測序。采用總DNA抽提試劑盒提取酒醅微生物基因組。使用聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）以引物5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′和5′-CGGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′擴增16S rRNA的V3/V4區；以引物5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′和5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′擴增基因。采用Illumina Novaseq平臺對PCR產物進行雙末端測序。PCR擴增、測序文庫的構建及測序由上海派森諾公司完成。原始序列經Qiime 2軟件優化處理，采用DADA 2將序列聚類為擴增子序列變異體后進行分類學注釋，使用的數據庫為SILVA_132（16S rRNA）和UNITE_8（）。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 酒醅微生物蛋白質的SDS-PAGE分析

C-UD和LNG-UD預處理方法提取的酒醅蛋白質質量濃度差異不顯著，分別為（4.19±1.21）g/L和（3.76±0.72）g/L。由圖1可知，LNG-UD處理未見明顯蛋白質條帶，C-UD處理的蛋白質條帶數量較多且清晰，表明兩種預處理法提取的酒醅蛋白質質量有一定差異。

圖1 酒醅微生物蛋白質SDS-PAGE圖譜Fig.1 SDS-PAGE profile of microbial proteins from fermented grains for baijiu production

2.2 酒醅微生物蛋白質的鑒定信息

采用非約束和約束性兩種檢索方式在Uniprot數據庫鑒定酒醅蛋白質。非約束性檢索是指檢索細菌和真菌的蛋白質庫；約束性檢索是首先采用擴增子測序技術確定酒醅微生物的分類，再在綱水平檢索11 個已知類群的蛋白質庫（圖2）。如圖3所示，兩種檢索結果均顯示兩個預處理法獲得的肽段和蛋白質種類差異顯著，其中C-UD處理獲得的酒醅肽段以及蛋白質數量均高于LNG-UD處理。如圖4所示，C-UD處理在約束和非約束性檢索中的蛋白質鑒定平均得分（Score Sequest HT）分別較LNG-UD處理提高了6.41%和15.11%。由表1可知，在兩個處理檢索分值排名前20位的蛋白質中，有13 個為兩者共有；其中除Q6BMK0和I1CB63，其余蛋白質在C-UD處理中的鑒定分值均高于LNG-UD。以上結果說明，C-UD處理蛋白質鑒定結果的可信度較高。

圖2 基于擴增子測序的酒醅微生物群落結構Fig.2 Taxonomic classification of the microbial communities from fermented grains for baijiu production based on amplicon sequencing

圖3 不同預處理方法的酒醅微生物肽段及蛋白質種類Venn圖Fig.3 Venn diagram showing the number of unique and shared microbial peptides and proteins between extracts of fermented grains obtained by different pretreatment methods

圖4 不同預處理方法的酒醅微生物蛋白質鑒定評分Fig.4 Score Sequest HT for proteins from fermented grains extracted by different pretreatment methods

表1 不同處理評分排名前20位的共有蛋白質Table 1 Top 20 shared proteins by Score Sequest HT

2.3 基于宏蛋白質組學的酒醅微生物群落結構

由圖5a可知，酒醅中的細菌和真菌蛋白質數量基本一致，各約占蛋白質總量的50%。綱水平上，兩種預處理方法在非約束性檢索中獲得的微生物群落結構差異顯著。例如，C-UD處理的蛋白質主要屬于Saccharomycetes和Bacilli，兩者蛋白質數量占該組總量的59.79%，較LNG-UD處理顯著提高，優勢度更突出。此外，Schizosaccharomycetes是LNG-UD處理的第一優勢綱，其蛋白質數量占該組總量的21.94%，但該類群在C-UD處理的優勢度顯著下降，蛋白質數量僅占該組總量的3.35%，排第7位。屬水平上，兩種預處理方法獲得的優勢菌屬相似，在約束和非約束檢索中均以和為最優勢屬；不同點在于兩者鑒定的前10位優勢微生物的群落結構不同，也體現在菌屬種類和數量的顯著差異。由圖5b可知，無論以何種方式檢索，兩個處理的共有菌屬數量僅占各處理鑒定總量的61.83%～76.39%，而C-UD處理鑒定的菌屬總量及其獨有種類數量均高于LNG-UD處理。

圖5 基于宏蛋白質組學的微生物群落結構（a）和屬水平的Venn圖（b）Fig.5 Microbial community structure (a) and Venn diagram showing the number of unique and shared microbial genera (b)based on metaproteomics

2.4 宏蛋白質組學和宏基因組學的酒醅微生物群落結構比較

由圖2可知，擴增子測序技術從酒醅樣品檢出21 個已知細菌屬和9 個已知真菌屬，相對豐度大于1%的優勢屬為、和。由圖6可知，兩種預處理法在蛋白質水平上鑒定的菌屬數量均高于擴增子測序。此外，兩種技術檢出的共有菌屬僅占各自檢測物種數量的7.50%～8.33%（宏蛋白質組學）和20%～33.33%（擴增子測序）；其中，C-UD處理和測序技術共有物種的數量高于LNG-UD，但兩個處理均檢出了測序技術檢出的優勢屬和。

圖6 宏蛋白質組學和宏基因組學鑒定微生物菌屬的Venn圖Fig.6 Venn diagram showing shared and unique microbial genera based on metaproteomics and metagenomics

3 討論

3.1 不同預處理方法的酒醅微生物宏蛋白質組學差異分析

建立有效的蛋白質提取方法和檢索適當的蛋白質數據庫是宏蛋白質組學研究須解決的兩個難點問題。研究認為，以基因組測序獲得的物種分類為依據，選擇相應物種的蛋白質數據庫進行約束性檢索可有效降低假陽性，提高結果的準確性。為全面比較兩種預處理方法的提取效果，本實驗采用約束性和非約束性檢索兩種方式。與以往窖泥宏蛋白質組學結果一致，非約束性檢索鑒定的肽段和蛋白質數量均高于約束性檢索（圖3）。然而兩種檢索方式均顯示，C-UD預處理法獲得的酒醅肽段及蛋白質數量高于LNG-UD預處理法，且其蛋白質鑒定結果的可靠性較高（圖3）。此外，在非約束檢索中，兩種預處理法獲得的微生物群落結構顯著不同（圖5a）。這說明不同的預處理法對酒醅宏蛋白質組學的結果具有顯著影響。這與以往腸道、厭氧發酵體系的宏蛋白質組學結果相似。Zhang Xu等比較不同蛋白質緩沖液（SDS、尿素、非離子洗滌劑）對人類腸道宏蛋白質組學的影響，發現用SDS緩沖液提取腸道蛋白質可顯著提高蛋白質的產量以及肽段和蛋白質的鑒定數量；該研究還顯示，在不同緩沖液中加入鋼珠進行敲打，均能使Firmicutes和Actinobacteria的相對豐度顯著增加。該研究結果提示，除樣品預處理方法外，酒醅蛋白質提取過程中的諸多環節還具有進一步優化的空間。

3.2 宏蛋白質組學和宏基因組學的酒醅微生物群落結構差異分析

實驗結果顯示，宏蛋白質組學和擴增子測序技術揭示的酒醅微生物群落結構具有顯著差異。首先，兩種技術檢出的共有物種較少（圖6）。其次在群落結構方面，擴增子測序技術檢出的最優勢真菌屬未被宏蛋白質組學檢出，而蛋白質水平上的最優勢物種未被測序技術獲得（圖2、5）。此外，在測序中的豐度高達36.06%，但其蛋白數量在不同預處理方法的兩種檢索結果中均低于3 個，僅占蛋白質總量的0.33%～0.94%。除方法學因素外，造成以上差異的原因可能包括以下幾點：1）某些微生物的蛋白質未被提取出或未被采用的技術檢出；2）部分微生物的蛋白質組未被充分揭示，Uniprot數據庫尚缺乏相關蛋白質信息；3）某些物種的基因豐度雖高但其生理功能可能被抑制，而一些低豐度物種也可能因生理活性較高而分泌大量蛋白質，行使重要功能。近年來，宏基因組測序技術被廣泛用于酒醅微生物研究。其中，Qian Wei等和本實驗的擴增子測序結果均顯示，和是酒醅的最優勢微生物。但在蛋白質水平上，本實驗雖進一步證實了在酒醅中的優勢地位，但未檢出。以上基因組測序和宏蛋白質組學間的結果差異再次彰顯出整合多組學研究的必要性；為深入認識中國白酒的發酵機制，釀酒微生物的宏蛋白質組學研究亟待進一步加強。

4 結論

分別采用C-UD法和LNG-UD法提取酒醅微生物蛋白質，采用非標記定量蛋白質組學技術進行檢測，比較兩種樣品預處理法獲得的微生物群落結構差異。結果表明，利用不同樣品預處理法提取酒醅蛋白質對酒醅微生物宏蛋白質組學的結果具有重要影響。相對于LNG-UD法，C-UD法可提高酒醅肽段及蛋白質的鑒定數量，且其鑒定結果的可靠性較高；C-UD處理鑒定的菌屬總量及其獨有種類數量均高于LNG-UD處理。后續研究將進一步優化酒醅微生物蛋白質的提取方法以獲得最佳的提取條件，為釀酒微生物宏蛋白質組學的深入研究奠定一定基礎。