表面增強拉曼光譜法靈敏檢測亞硫酸根離子

高月瀅，萬玉琪，劉 琳，劉婧涵，李靖坤，皮付偉

（江南大學食品科學技術學院，食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

亞硫酸鹽具有多種防腐性能，可以抑制微生物生長、防止褐變，并具有抗氧化和漂白作用，被廣泛用作食品防腐劑。此外，亞硫酸鹽在藥物中還具有維持藥物穩定性和效力的作用。由于這種廣泛應用的歷史，在合適的劑量內，亞硫酸鹽通常被認為安全，但仍有小部分人群對亞硫酸鹽敏感。其敏感性臨床表現包括皮膚疾病、呼吸系統疾病以及胃痙攣等胃腸道過敏反應。此外，高濃度的亞硫酸鹽攝入甚至會導致休克等。其中，哮喘患者是亞硫酸鹽敏感癥的高發人群，尤其是類固醇依賴性哮喘患者。Kü?ükatay等也提出亞硫酸鹽會提高大鼠脊髓反射的興奮性，進而對神經系統造成嚴重損傷。因此，食品中亞硫酸鹽的使用成為消費者和監管機構重點關注的問題。美國食品藥物管理局（Food and Drug Administration，FDA）要求含有10 mg/kg亞硫酸鹽的食品需在成分標簽中進行標注，并禁止在新鮮水果和蔬菜及肉類食品中使用亞硫酸劑。世界衛生組織（World Health Organization，WHO）提出每日可接受的亞硫酸鹽的攝入量為0.7 mg/kg。中國嚴格規定白砂糖中亞硫酸鹽含量需低于100 mg/kg。

目前，已經建立了許多用于亞硫酸鹽檢測的分析技術，例如滴定法、熒光光譜法和色譜法等，但這些檢測方法耗時長且需要復雜的測試儀器。表面增強拉曼散射（surface-enhanced Raman scattering，SERS）光譜作為一種超靈敏的分子傳感技術，由于其對多分子的即時信息獲取能力已被廣泛應用于環境監測、生物醫學和食品科學等領域。與有機分子不同，大多數無機離子不能直接產生拉曼信號，因此一般通過無機離子的特異性探針對其進行捕獲。此外，開發用于識別和檢測各種離子的專用傳感器也是當前SERS技術的熱點之一。探針分子與無機離子的結合會改變其分子結構，導致分子振動特性的改變，因此可以監測探針分子與陰離子識別產生的SERS光譜變化間接實現對特定陰離子的檢測。然而，與穩定的陽離子不同，大尺寸的陰離子具有廣泛的幾何形狀和更彌散的性質，這需要探針分子對目標陰離子具有更高的互補性以獲得良好的選擇性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

檸檬酸鈉（98%）、3-氨基丙基三乙氧基硅烷（3-aminopropyltriethoxysilane，APTES，98%） 美國Sigma-Aldrich公司；4-巰基苯硼酸（90%） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氯化鉀、硝酸鉀、溴化鉀、亞硫酸鉀、亞硝酸鈉、磷酸二氫鉀、硝酸銀、氫氧化鉀（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；氮氣（N，純度≥99.99%） 無錫太湖氣體公司；0.22 μm微孔濾膜（水系） 南通海之星實驗器材有限公司；超親水蓋玻片 德國Karl-Hecht公司。

1.2 儀器與設備

超純水純化系統 美國Millipore公司；Dxr2xi共聚焦拉曼顯微鏡 美國賽默飛生物技術有限公司；等離子體清洗機 德國Diener公司；JEM-2100場發射透射電子顯微鏡、SU-8230場發射掃描電子顯微鏡 日本電子株式會社。

1.3 方法

1.3.1 銀納米顆粒（silver nanoparticles，AgNPs）的合成

AgNPs按照檸檬酸鈉還原策略合成。即在600 r/min磁力攪拌下將2 mL、質量分數1%的檸檬酸三鈉加入沸騰的AgNO溶液（1×10mol/L，100 mL）中煮沸1 h。溶液顏色逐漸變為黃綠，冷卻至室溫后置于4 ℃避光保存作為儲備液。

1.3.2 4-MPBA修飾的AgNPs（4-MPBA@AgNPs）芯片的制備

玻璃蓋玻片分別用超純水和無水乙醇超聲清洗30 min，放入等離子體清洗機進行羥基化處理。隨后，將APTES通過氣相沉積修飾在玻璃襯底上，從而完成基底的硅烷化處理。將硅烷化襯底浸入10 倍濃縮的AgNPs膠體中反應4 h，通過Ag-N鍵將AgNPs固定在玻璃襯底上，得到單層的AgNPs基底。將AgNPs芯片浸泡在4-MPBA乙醇溶液（1×10mol/L）中過夜，隨后用乙醇徹底沖洗，即得到4-MPBA@AgNPs芯片（圖1）。

圖1 4-MPBA@AgNPs芯片制備的流程圖Fig.1 Flow chart of the fabrication of 4-MPBA@AgNPs chip

配制0.01 mol/L的KSO標準溶液，并將其進行連續稀釋，得到一系列濃度梯度的KSO標準待測液。隨后，向待測樣品中滴加適量的高濃度氧化劑，振蕩搖勻并靜置反應，使得KSO完全轉化為KSO。調節樣品溶液pH值至中性，然后將在1.5 mL的樣品溶液滴加在4-MPBA@AgNPs芯片表面，充分反應10 min。

反應后的4-MPBA@AgNPs基底從氧化液中取出，自然晾干后進行拉曼檢測。測試參數：激發波長532 nm，激光功率2.0 mW，曝光時間0.01 s，10 次積累。實驗中對所有4-MPBA光譜的SERS基線校正光譜在1 070 cm處進行歸一化處理。誤差棒表示基于10 個獨立測量值的標準差。

1.3.4 實際樣品檢測

白糖參照SN/T 2918—2011對其進行預處理。將4 g樣品溶解在100 mL水中并加入2 mL的NaOH溶液（1 mol/L）。搖勻后9 000 r/min離心30 min。使用0.2 μm濾膜將上清液過濾并再次使用超濾管離心。使用最佳氧化條件對加標樣品進行處理，反應后調節pH值至中性。隨后將樣品引入反應體系進行SERS圖譜采集。相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）基于10 次平行測量值。

2 結果與分析

2.1 基于4-MPBA@AgNPs芯片的檢測機理

圖2 4-MPBA@AgNPs芯片檢測的示意圖Fig.2 Schematic illustration of detection by 4-MPBA@AgNPs chip

圖3 不同pH值環境下4-MPBA（a）和與共存溶液中4-MPBA（b）的紫外吸收光譜Fig.3 UV-vis absorption spectra of 4-MPBA in the absence (a) or presence (b) of under different pH environments

2.2 AgNPs的表征

參照傳統的檸檬酸三鈉還原法成功制備AgNPs，對其紫外特征吸收峰進行表征。如圖4所示，AgNPs在波長407 nm處顯示出較強的特征吸收峰。此外，其紫外吸收峰的半峰寬較窄，說明AgNPs的粒徑尺寸較為均勻。進一步，使用透射電子顯微鏡對AgNPs的形貌進行表征（圖4b），可以看出合成的AgNPs粒徑分布均勻，且呈現出良好的顆粒形態與分散性。

圖4 AgNPs的紫外可見吸收光譜（a）和透射電鏡圖（b）Fig.4 UV-Vis absorption spectrum (a) and TEM image (b) of AgNPs

2.3 AgNPs基底的制備與表征

選用玻璃蓋玻片作為襯底，界面羥基化使襯底獲得良好的親水性，也促使APTES修飾在襯底表面以完成硅烷化處理。最后將AgNPs滴加在硅烷化襯底表面孵育4 h，通過Ag-N鍵固定在襯底表面，得到單層AgNPs基底。如圖5所示，AgNPs通過與APTES的氨基基團反應而嫁接到玻璃基底上，形成AgNPs均勻分布的單層AgNPs基底。

圖5 AgNPs基底的掃描電鏡圖Fig.5 TEM image of AgNPs substrate

2.4 4-MPBA@AgNPs芯片的表征

通過Ag-S鍵將4-MPBA探針分子修飾到AgNPs表面，得到4-MPBA@AgNPs芯片。如圖6、表1所示，在4-MPBA的SERS光譜中，由于S—H拉伸振動（（SH））產生的2 563 cm波段的峰完全消失，證明4-MPBA分子通過Ag—S鍵被成功修飾到AgNPs表面。此外，歸屬于C—S—H彎曲帶模式（（CSH））的911 cm處的峰也在SERS光譜中消失（圖6中的b），同樣證明了Ag—S鍵的形成。

圖6 4-MPBA的普通拉曼光譜（a）和修飾在AgNPs芯片上的SERS光譜（b）Fig.6 Raman spectrum of 4-MPBA power (a),and SERS spectrum of 4-MPBA adsorbed (b) on AgNPs substrate

表1 4-MPBA拉曼特征峰及其歸屬[24]Table 1 Assignments of characteristic Raman peaks of MPBA[24]

2.5 4-MPBA@AgNPs芯片對的檢測可行性

圖7 用4-MPBA@AgNPs芯片檢測氧化前后的離子的SERS響應光譜及其空白對照Fig.7 SERS spectra of 4-MPBA@AgNPs chip for before and after oxidation and blank control

2.6 系統工作pH值的確定

圖8 隨pH值變化的4-MPBA@AgNPs芯片的SERS光譜Fig.8 SERS spectra of 4-MPBA@AgNPs chip under different pH environments

2.7 氧化劑的選擇

圖9 4-MPBA@AgNPs芯片檢測不同氧化劑處理離子的SERS光譜Fig.9 SERS spectra of 4-MPBA@AgNPs chip for treated with different oxidants

2.8 氧化時間的優化

圖10 峰值比（I1382/I1070）隨離子氧化時間的變化Fig.10 Variation in I1382/I1070 with oxidation time of

2.9 氧化處理對4-MPBA@AgNPs芯片選擇性的影響

圖11 4-MPBA@AgNPs芯片檢測氧化處理后不同離子的SERS光譜Fig.11 SERS spectra of 4-MPBA@AgNPs chip for different anions treated by oxidants

2.10 的定量標準曲線

圖12 4-MPBA@AgNPs芯片對不同濃度離子的SERS光譜Fig.12 SERS spectra of 4-MPBA@AgNPs chip for different concentrations of

表2 本研究與其他離子檢測方法的對比Table 2 Comparison between this method and other methods for detection

2.11 白糖樣品中離子的檢測

圖13 4-MPBA@AgNPs芯片對白糖中離子的SERS響應光譜Fig.13 SERS spectra of the proposed 4-MPBA@AgNPs chip for ion spiked in white sugar

表3 白糖中含量的測定Table 3 Recoveries and RSD of in spiked white sugar

3 結論