熱誘導溫度與pH值對乳清濃縮蛋白凝膠結構和性質的影響

劉芙蓉，王雨生,2，李 鵬，房子蔚，陳海華,3,

（1.青島農業大學食品科學與工程學院，山東 青島 266109；2.青島農業大學學報編輯部，山東 青島 266109；3.青島農業大學巴瑟斯未來農業科技學院，山東 青島 266109）

乳清濃縮蛋白（whey protein concentrate，WPC）是指從巴氏殺菌的乳清中去除非蛋白成分后的乳清產品，是乳制品行業的副產物，是必需氨基酸的極好來源。乳清蛋白因具有發泡、包封、凝膠和乳化等優良功能和營養特性，在食品工業中得到了廣泛的應用。目前，乳清蛋白已被應用于嬰兒配方奶粉、烘焙產品、糖果、水果飲料、功能食品（運動飲料、營養品、減肥產品）和藥品中。乳清蛋白最顯著的功能特性之一是能夠通過熱誘導形成可固定大量水和其他食物成分的黏彈性凝膠，從而改善食品的外觀、質地和性能，常被用作制備可食用凝膠。蛋白凝膠網絡還能夠保護和傳遞生物活性分子，提高其利用率。

蛋白凝膠的形成是一個復雜的過程，涉及蛋白質的變性、解離、聚集和凝膠化等反應。膠凝過程受許多因素影響，如熱、酸、壓力和酶等。乳清蛋白對熱和環境pH值更為敏感，其功能特性也高度依賴于熱敏感性和酸堿環境引起的成分變化，這極大地限制了乳清蛋白凝膠在肉制品、烘焙產品和乳制品等食品中的應用。因此，研究熱誘導溫度和pH值對WPC凝膠形成的影響有重要意義。

乳清蛋白的凝膠化過程受到pH值和熱誘導溫度的強烈影響。Nicolai和Jiang Shanshan等的研究表明熱誘導能使蛋白質分子變性聚集，乳清蛋白在低溫下聚集速度過慢，加熱到高溫時形成聚集體或凝膠；Ako等研究發現-乳球蛋白在60 ℃左右開始變性，85 ℃時變性最快。pH值在乳清蛋白凝膠化過程中也起著重要作用。Donato等發現-乳球蛋白的展開和聚集受蛋白質分子電荷分布的影響；Yang Chen等認為pH 5～11的油菜籽蛋白在不同溫度下形成的凝膠網絡主要是通過疏水相互作用和氫鍵連接；Li Quanyang等研究表明80 ℃加熱pH 5.8和pH 6.7的乳清蛋白，蛋白質的聚集和凝膠化過程與疏水相互作用有關。目前的研究多集中在單一pH值或溫度對凝膠的影響，特別是對添加了添加物的蛋白凝膠，然而蛋白質形成凝膠的過程同時受蛋白質濃度、環境溫度、pH值的影響。因此，綜合考慮多因素對WPC凝膠，特別是對無添加物的WPC凝膠的影響很有意義。

本研究采用自動電位滴定儀、動態流變儀、光學微流變儀、圓二色譜（circular dichroism，CD）儀、熒光分光光度計、掃描電子顯微鏡和紫外-可見分光光度計系統研究蛋白質濃度、熱誘導溫度（60、85 ℃）和環境pH值（2.0，酸性；4.5，等電點；7.0，中性；9.0，堿性）對WPC分子構象和WPC凝膠微觀結構的影響，從微觀角度揭示WPC凝膠的形成機制，以期為改善蛋白凝膠性能提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

WPC（蛋白質質量分數80%） 江蘇富盛德生物工程有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

ZDJ-4B自動電位滴定儀 上海儀電科學儀器股份有限公司；MCR103型動態流變儀 奧地利安東帕公司；Rheolaser Master光學微流變儀 法國Formuloction公司；Chirascan CD儀 英國Applied Photophysics公司；F-2700熒光分光光度計、S-3400N掃描電子顯微鏡 日本日立公司；UV-2000紫外-可見分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 WPC溶液的配制

用天平分別準確稱取1.0～15.0 g WPC于100 mL燒杯中，加入去離子水，配制質量濃度分別為10～150 mg/mL的15 組WPC溶液，攪拌1 h，使蛋白質充分溶解。加入2～3 滴質量濃度為0.02 mg/mL的疊氮化鈉以抑制微生物生長，并置于4 ℃冰箱中過夜，使蛋白質充分水化，得到WPC溶液備用。

1.3.2 蛋白質電荷密度（）的測定

參考Kharlamova等的方法，選擇配制的10、40、70、110、150 mg/mL 5 種質量濃度梯度的WPC溶液，用0.1 mol/L和1 mol/L的HCl（或NaOH）溶液調節pH值。首先將所有樣品的pH值調至7.0，然后使用自動電位滴定儀依次滴定至特定pH值（7.0～3.0），記錄WPC溶液的電位和消耗的HCl（或NaOH）溶液體積。根據式（1）、（2）分別計算每個蛋白分子結合或釋放的H數量，推導：

式（1）、（2）中：為WPC質量/g；（HCl）和（NaOH）為滴加的HCl和NaOH溶液體積/mL；（HCl）和（NaOH）為HCl和NaOH溶液質量濃度/（g/mL）；m為WPC分子質量，為1.75×10g/mol；Δ為等離子點處WPC溶液電荷密度。

1.3.3 熱誘導WPC凝膠的形成

用0.1 mol/L和1 mol/L的HCl（或NaOH）溶液調節不同質量濃度的WPC溶液（10～150 mg/mL）至特定pH值（1.0～9.0），分別在60 ℃和85 ℃水浴加熱1 h后，用冰水浴快速冷卻。根據Chihi等的倒管法將上述樣品按外觀狀態分為：傾斜時流動的溶膠；傾斜45°不流動的均勻凝膠；具有脫水收縮現象的蛋白質沉淀。繪制WPC的溶膠-凝膠狀態圖。

1.3.4 動態流變性質測試

移取適量不同pH值（2.0、4.5、7.0、9.0）不同質量濃度（10、40、110、150 mg/mL）的WPC溶液，置于動態流變儀樣品臺。采用直徑50 mm的平行板夾具PP50，設置平行板與樣品臺的間隙為1 mm，振蕩頻率1 Hz，振蕩應變0.5%。將多余樣品用刮刀移走，并用硅油密封邊緣，以防水分蒸發。樣品于25 ℃恒溫3 min，然后以1.6 ℃/min升溫至60 ℃（或85 ℃），恒溫30 min，最后以1.6 ℃/min降溫至25 ℃。記錄過程中彈性模量（′）、黏性模量（″）和損耗角正切值（tan）。

1.3.5 微流變學性能的測定

參照Su Jiaqi等的方法并適當修改，取20 mL 150 mg/mL WPC溶液，采用1.3.3節方法調整溶液pH值至2.0、4.5、7.0、9.0后，加入光學微流變儀玻璃管中，并立即置于流變激光器的腔室中。設置初始溫度30 ℃，升溫速率1.83 ℃/min，升溫至85 ℃后恒溫30 min，最后自動降溫至30 ℃。記錄WPC膠凝過程中顆粒的均方位移（mean squared displacement，MSD）曲線隨加熱時間的變化，并采用儀器自帶軟件RheoSoft Master 1.4.0.0計算彈性指數（elasticty index，EI）、宏觀黏度指數（macroscopic viscosity index，MVI）、固液平衡值（solid-liquid balance，SLB）。

1.3.6 CD分析

蛋白質二級結構的測定參照Yu Yali等的方法并適當修改，取質量濃度為150 mg/mL的WPC溶液，采用1.3.3節方法調整溶液pH值至2.0、4.5、7.0、9.0，分別在60 ℃和85 ℃水浴加熱1 h并冰浴后進行破碎，稀釋成質量濃度為0.5 mg/mL的WPC凝膠懸濁液。置于0.1 cm石英比色皿中，超純水作空白對照，用紫外-可見分光光度計在遠紫外光范圍（波長190～260 nm）進行掃描。測試溫度25 ℃，掃描速率1 nm/s，響應時間0.5 s，帶寬1 nm。采用儀器自帶CDNN軟件計算蛋白質二級結構的含量。

1.3.7 熒光光譜分析

參照Xiao Yaqing等的方法并適當修改。制備與1.3.6節中相同的WPC凝膠懸濁液，使用熒光分光光度計和1 cm石英比色皿，掃描蛋白質的內源熒光光譜。測試溫度25 ℃，激發波長295 nm，發射波長范圍310～450 nm，發射和激發波長狹縫均為5 nm，掃描速率1 500 nm/min。

1.3.8 凝膠微觀結構的觀察

參照He Zhendong等的方法并適當修改。取質量濃度為150 mg/mL的WPC溶液，采用1.3.3節方法調整溶液pH值至2.0、4.5、7.0、9.0，在85 ℃水浴加熱1 h形成WPC凝膠，切成1 cm×1 cm×1 cm凝膠塊，-80 ℃超低溫冷凍12 h后，真空冷凍干燥48 h。置于離子濺射儀中進行抽真空、噴金處理，使用掃描電子顯微鏡分別放大200、6 000 倍觀察WPC凝膠微觀結構，加速電壓為5 kV。

1.3.9 相互作用力分析

取1.3.1節配制的40 mg/mL WPC溶液，調節pH值至2.0，量取4 等份40 mL溶液，分別加入蒸餾水、6 mol/L尿素溶液、0.5%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfonate，SDS）溶液和30 mmol/L二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）溶液各2 mL，混勻。所得溶液一分為二，分別于60 ℃和85 ℃水浴加熱1 h，用冰水浴迅速冷卻，得到WPC微凝膠懸濁液，加入10 倍體積的蒸餾水稀釋，用紫外-可見分光光度計測定600 nm波長處的透光率。重復上述步驟，分別調節pH值至4.5、7.0和9.0，測定不同pH值的WPC微凝膠懸濁液透光率，分析氫鍵、疏水相互作用及二硫鍵對WPC凝膠形成的影響。

1.4 數據處理

所有實驗均重復3 次。利用Excel 2010及Origin 2018軟件繪圖，用SPSS 17.0軟件對數據進行單因素方差分析，＜0.05，差異顯著。

2 結果與分析

2.1 pH值對WPC溶液α的影響

如圖1所示，pH值的降低使WPC的||先減小后增大，pH 4.5時，＝0。Bo?i?等發現，-乳球蛋白的凈電荷會隨環境pH值的變化而變化。Ako等發現電荷斥力在等電點（pI）處最小，改變pH值可使豌豆蛋白和-乳球蛋白更接近＝0的等電點。這可能是因為pH值能改變蛋白質構象，進而改變蛋白質的。

圖1 WPC質量濃度和pH值對α的影響Fig.1 Effect of WPC concentration and pH on α

由圖1可以看出，WPC質量濃度對的影響與pH值有關。＜0時，增加WPC質量濃度會使減小；而＞0時，WPC質量濃度的增加會使增加；在＝0附近，WPC質量濃度對的影響較小。Kharlamova等研究發現相同pH值下，乳清蛋白的一定程度上取決于蛋白質溶液的濃度。這可能是因為接近pI（pH 4.5）時，蛋白質本身的較低，所以濃度對蛋白質的影響不明顯；遠離pI時，蛋白質較高，分子之間的相互作用增強，所以濃度對蛋白質的影響增強。

2.2 WPC的溶膠-凝膠狀態分析

如圖2B所示，熱誘導溫度為85 ℃時，WPC溶液質量濃度小于30 mg/mL時不能形成凝膠；WPC質量濃度在50～80 mg/mL時，可在pH 4.0～6.0范圍內形成均勻凝膠；WPC質量濃度在100～120 mg/mL時，可在pH 2.0～6.0范圍內形成均勻凝膠；WPC質量濃度超過130 mg/mL時，則可在pH 2.0～9.0范圍內形成均勻凝膠。Acosta等研究表明高濃度的蛋白能增強蛋白質之間、蛋白質與水之間的相互作用力，形成更好的凝膠網絡結構。

圖2 不同條件下WPC的溶膠-凝膠狀態圖Fig.2 Sol-gel state diagram of WPC under different conditions

WPC溶液的pH值能夠影響形成凝膠的蛋白質量濃度范圍。由圖2B可知，熱誘導溫度為85 ℃、pH 4.5時（對應＝0），形成均勻凝膠所需的蛋白質量濃度最低，為40 mg/mL；當pH 5～6時，形成均勻凝膠所需的蛋白質量濃度則增加至50 mg/mL；當pH≥7時，形成均勻凝膠所需的蛋白質量濃度超過120 mg/mL。由此可以看出，WPC易在酸性條件下形成凝膠，且接近于0時，更容易形成凝膠。Acosta等認為pH值通過調整蛋白質之間引力和斥力的平衡影響蛋白質的凝膠化。pH值的變化可以引起蛋白質的變化，進而影響凝膠的形成。不同時形成的蛋白凝膠狀態不同，降低蛋白質的||使蛋白質分子間的斥力減弱，分子間的相互作用增強，可以促進凝膠的形成；而||較高時，蛋白質分子間靜電斥力增強，能抑制蛋白質的聚集。

由圖2A、B可知，與60 ℃的熱誘導溫度相比，WPC在85 ℃加熱時，可形成均勻凝膠的蛋白質量濃度范圍、pH值范圍（范圍）更大。Nicolai等也發現在低于70 ℃加熱乳清分離蛋白懸濁液時，膠凝效果不理想。這表明較高的熱誘導溫度能促進蛋白質分子鏈的展開，增強蛋白質分子間的疏水相互作用和靜電吸引力，形成更好的三維凝膠網絡。

為進一步研究WPC膠凝特性，根據圖2B中WPC凝膠形成所需的不同pH值范圍及蛋白質量濃度，選擇10 mg/mL（在酸性、堿性范圍內均不能形成凝膠的質量濃度）、40 mg/mL（能夠形成凝膠的最小質量濃度）、110 mg/mL（在酸性范圍內能夠形成凝膠的質量濃度）、150 mg/mL（在酸性、堿性范圍內均能形成凝膠的質量濃度）的WPC溶液，研究在酸性、等電點、中性和堿性（pH 2.0、4.5、7.0和pH 9.0）環境中凝膠的動態流變性質。

2.3 WPC凝膠化的動態流變性質分析

根據加熱過程中WPC溶液的′、″和tan等黏彈性行為的變化，可判斷凝膠體系的形成情況。通常，當′＞″或tan＜1時，凝膠開始形成，且tan值越小，樣品膠凝的程度越高。

如圖3B所示，85 ℃熱誘導的凝膠，在初始加熱階段（25～55 ℃），WPC的′和″均較低，且′＜″；在一定范圍內，隨著溫度的升高，′和″沒有明顯變化；溫度升高至55 ℃時，′明顯升高，且′＞″，凝膠開始形成，該溫度為凝膠溫度，所用時間（33 min）即為凝膠時間（表1）。在恒溫和降溫過程中，′和″持續增加，表明降溫過程能進一步強化WPC的凝膠網絡結構。Xiao Yaqing和Li Quanyang等也發現，乳清蛋白凝膠在冷卻過程中′和″會顯著增加；Pouzot等研究發現球狀蛋白達到凝膠溫度后，′迅速增加，冷卻過程中又升高了2～3 倍。Xia Wenjie等發現大豆分離蛋白凝膠過程中也有類似的′、″變化規律。這可能是熱誘導溫度高于凝膠溫度時，蛋白質分子展開并聚集，形成具有一定空間結構的凝膠網絡，溫度的升高使更多蛋白質分子加入到凝膠網絡中，引起凝膠網絡結構的重排，′和″持續增加；恒溫過程中，越來越多的蛋白質分子參與到蛋白質網絡結構的形成中，凝膠網絡結構進一步增強，′持續升高；降溫過程中，蛋白質分子間及分子內的氫鍵作用力增強，使′進一步增加。另外，降溫過程可以降低蛋白質聚集體的遷移率，有利于進一步完善凝膠結構。

圖3 pH 2、WPC質量濃度150 mg/mL條件下WPC凝膠形成過程中的動態流變曲線Fig.3 Rheological curves of WPC gels with WPC concentration of 150 mg/mL and at pH 2.0

表1 WPC質量濃度和pH值對凝膠時間的影響Table l Effects of WPC concentration and pH on the gel formation time of WPC

對比圖3A和3B，熱誘導溫度不同，WPC溶液的流變曲線略有差異。85 ℃熱誘導時，WPC在升溫過程中已形成凝膠，而60 ℃熱誘導時，到達恒溫階段才形成凝膠。此外，85 ℃熱誘導的凝膠，′可超過70 000 Pa，遠高于60 ℃熱誘導的′（50 000 Pa）；85 ℃熱誘導凝膠的″也高于60 ℃，說明85 ℃熱誘導的凝膠黏彈性更強。Wang Wenqiong等報道70 ℃處理的乳清蛋白凝膠的′高于65 ℃和60 ℃，認為高溫可以增加蛋白凝膠的彈性和黏性。這可能是因為溫度影響蛋白質的變性和展開程度，較高溫度能增強蛋白變性程度和聚集程度，使凝膠網絡結構更加致密，凝膠′更大。

由表1可知，相同熱誘導溫度和pH值時，WPC質量濃度越高，凝膠時間越短。Pouzot等研究發現乳清蛋白和乳球蛋白的凝膠時間均隨蛋白溶液濃度的降低而延長，蛋白溶液濃度過低時難以形成凝膠。Khemakhem等發現蛋白溶液只有達到一定濃度時才能形成凝膠，且濃度越高，膠凝速率越快。這可能是因為蛋白質的肽鏈在加熱過程中展開，而隨著蛋白質濃度的升高，蛋白質肽鏈之間存在折疊、纏繞等現象，膠凝速度快，形成的凝膠結構更加穩定。

根據表1，WPC質量濃度和熱誘導溫度相同時，pH值會影響WPC凝膠時間，pH 4.5時（等電點），凝膠時間最短。Acosta和Young等研究表明，pH值通過影響蛋白質分子電荷分布，改變分子間靜電引力和斥力的平衡，進而影響蛋白質的膠凝速度。這可能是因為在等電點附近，蛋白質分子間相互碰撞的機會增加，形成的氫鍵和疏水相互作用更強，能夠促進凝膠的形成。遠離等電點時，蛋白質分子間靜電排斥作用增加，限制了蛋白的聚集，所以蛋白質凝膠時間延長。

2.4 WPC凝膠化的微流變學性質分析

由宏觀溶膠-凝膠狀態圖（圖2）和動態流變性質結果可知，WPC質量濃度為150 mg/mL、熱誘導溫度為85 ℃時，WPC形成凝膠的pH值范圍最廣。為進一步描述WPC凝膠形成動力學性質，采用不損傷WPC凝膠結構的微流變學方法，探究WPC質量濃度為150 mg/mL、熱誘導溫度為85 ℃時的凝膠特征。

光學微流變技術通過布朗運動中粒子的運動速度和運動范圍反映體系黏度和彈性，具有靈敏度高、受外界干擾小等優點，可以在無損條件下測定凝膠的黏彈特性。粒子的MSD是去相關時間的函數，隨著去相關時間的延長，黏性樣品的MSD呈線性增長，而彈性樣品中的顆粒被限制在網絡結構中，MSD呈非線性增長。

圖4可反映WPC溶液在升溫→恒溫→降溫過程（圖中MSD曲線顏色由藍色漸變為紅色的過程）中逐步形成WPC凝膠的過程。不同pH值條件下的MSD曲線中，WPC粒子首先呈現出斜率較高的藍色線性曲線，隨著加熱的進行，曲線斜率逐漸降低，變為綠色曲線，并逐步形成MSD比較穩定的平臺區。這表明，開始時WPC粒子可以在溶液中自由移動，MSD曲線呈現為高斜率的直線，即WPC粒子在一段較短的去相關性時間內具有很大的MSD變化，WPC粒子運動劇烈；隨著加熱的進行，曲線斜率的降低說明WPC粒子間相互作用增強，溶液黏度升高，WPC粒子的運動受限；平臺區的出現說明在一段較長的去相關性時間內，WPC粒子保持較小的運動變化，即WPC凝膠已經形成。平臺區的高度（MSD值）越小，說明凝膠網格越小，網絡結構越緊密，凝膠彈性越強。平臺區之后，MSD繼續升高意味著WPC粒子能夠擺脫WPC凝膠網絡束縛（出現粒子遷移現象），此時，凝膠粒子平均速度的大小可反映凝膠的宏觀黏度。比較不同pH值下MSD曲線平臺區的出現時間可以發現，pH 4.5時，平臺區出現在加熱40 min 40 s時（圖4中箭頭所示黑色MSD曲線），加熱時間最短，說明pH 4.5時，WPC溶液最容易形成凝膠。

圖4 不同pH值下WPC凝膠化過程的MSD曲線Fig.4 MSD curves of WPC gelation process at different pH values

SLB反映樣品的類固體和類液體行為的占比，位于0～1之間。SLB＞0.5時，類液體行為占主導地位；SLB＜0.5時，類固體行為占主導地位。如表2所示，不同pH值的WPC溶液加熱前的SLB在0.67～0.81之間，呈液態性質，85 ℃加熱后，SLB顯著降至0.19～0.30之間，類固體行為占主導地位，說明形成了WPC凝膠。pH 2.0、4.5時形成的WPC凝膠，其SLB小于pH 7.0、9.0時凝膠的SLB，說明pH 2.0、4.5時有利于形成彈性更強的WPC凝膠。He Jun等研究表明，酸奶形成凝膠后，彈性增強，SLB值降低。

表2 不同pH值下WPC凝膠化的SLB、MVI和EI值Table 2 SLB,MVI,and EI values for WPC gelation process at different pH values

在微流變學中，EI反映粒子在網絡結構中可移動的平均范圍，表征樣品的彈性性能。EI越大，粒子可移動范圍越小，凝膠的彈性越強。MVI對應網絡結構中粒子的平均運動速度，表征零剪切條件下樣品的宏觀黏度。MVI越大，粒子完成一定位移所需時間越長，意味著粒子的遷移率越低，黏度越大。由表2可以看出，不同pH值的WPC溶液經85 ℃熱誘導后，EI與MVI均顯著升高100～10 000 倍，說明加熱處理使WPC分子鏈展開并發生聚集，形成了致密的凝膠網絡，導致粒子間的運動阻力增加。與pH 7.0、9.0相比，WPC溶液在pH 2.0、4.5時形成的WPC凝膠具有更高的EI和MVI，說明WPC溶液在酸性條件下形成的凝膠具有更強的彈性和黏性。He Jun等研究表明，在酸奶加工過程中，形成凝膠結構后，EI和MVI均明顯升高。在WPC等電點附近時，粒子之間的靜電斥力小，蛋白質分子容易聚集，蛋白質網絡結構重排，會引起額外的蛋白質簇并入已形成的凝膠網絡結構中，使EI和MVI升高。

2.5 WPC凝膠的蛋白二級結構分析

如圖5所示，pH 7.0時，未加熱誘導的WPC凝膠在190 nm波長處有一個正峰，是典型的-螺旋結構的特征峰；在208～222 nm范圍內有較寬的負峰吸收帶，表明存在-螺旋、-折疊和無規卷曲等蛋白質二級結構。由表3可知，pH 7.0時，未加熱誘導的WPC凝膠中-螺旋、-折疊、-轉角和無規卷曲等二級結構的相對含量分別為11.3%、44.6%、19.3%和29.5%。

表3 不同制備條件下WPC凝膠的蛋白二級結構的相對含量Table 3 Secondary structure composition of WPC gels prepared under different conditions

圖5 不同制備條件下WPC凝膠的CD圖Fig.5 CD spectra of WPC gels prepared under different conditions

由圖5可知，60 ℃加熱對WPC凝膠的CD圖吸收峰的位置和強度影響較小。但85 ℃加熱時吸收峰強度顯著降低。由表3可知，pH 7.0時，85 ℃熱誘導制備的WPC凝膠的-螺旋含量由11.3%降至9.2%，無規卷曲含量則由29.5%升高至31.1%。這可能是因為加熱會破壞-螺旋結構中的氫鍵，導致-螺旋含量顯著降低；熱誘導溫度超過85 ℃時，蛋白質發生不可逆變性，蛋白質結構迅速展開，無規卷曲結構含量增加。

從圖5還可以看出，pH值對WPC凝膠的CD圖吸收峰強度的影響較大，190 nm處吸收峰在pH 4.5時強度最小，pH 2.0時強度最大，pH 7.0、9.0時強度相近。由表3可知，當WPC溶液的pH值遠離等電點時，-螺旋含量顯著增加，-折疊含量顯著減少。中性pH值條件下85 ℃熱誘導的WPC凝膠的-螺旋含量9.2%，-折疊含量43.6%，無規卷曲含量31.1%。這些結果表明蛋白質分子的展開和聚集與溶液的pH值有關。因此，熱誘導和pH值能引起WPC分子二級結構的展開、重新排列和聚集，影響蛋白質的有序結構（如-螺旋和-折疊等）。

2.6 WPC凝膠的蛋白三級結構分析

色氨酸殘基位于蛋白質初級結構的疏水區域，色氨酸內發色團對其環境的極性有高度敏感性，已被廣泛應用于分析蛋白質的三級結構變化。如圖6所示，環境pH值對WPC內源熒光光譜譜線位置和強度有較大影響。未加熱處理的樣品，WPC溶液在等電點條件下（pH 4.5）的最大熒光強度波長位置（）為329 nm，熒光強度最低，發生熒光猝滅現象；遠離等電點時，熒光強度明顯增強；pH 2.0、9.0時，明顯紅移至332 nm。發生紅移表明環境pH值的改變引起WPC構象的變化，使疏水區域的更多色氨酸殘基暴露于溶劑中。Sun Chanchan等發現pH值由3.5升至8.5時，乳清蛋白由333 nm紅移至339 nm。遠離等電點的酸性或堿性環境可能會引起蛋白質多肽鏈的展開，使更多色氨酸殘基暴露，熒光強度增強；在WPC等電點附近（pH 4.5），蛋白質的聚集引起微環境變化，導致色氨酸基團被“掩蓋”或處于非極性環境中，熒光強度最低。

圖6 不同制備條件下WPC內源熒光光譜Fig.6 Intrinsic fluorescence spectra of WPC prepared under different conditions

由圖6可知，加熱處理也會引起WPC的紅移，且熱誘導溫度越高，紅移現象越明顯，而等電點附近的WPC溶液尤為明顯。在pH 4.5時，經60 ℃和85 ℃熱誘導后，WPC的從329 nm分別升高至333 nm和334 nm。Momen等研究發現熱處理會使乳清蛋白紅移。Klost等發現豌豆蛋白經熱處理后會暴露更多的色氨酸殘基，引起紅移。

不同溫度的熱處理對WPC熒光強度的影響明顯不同，經60 ℃熱處理的WPC熒光強度明顯高于經85 ℃熱處理的，即85 ℃熱處理能引起熒光猝滅。Wang Wenqiong等發現，在堿性條件下加熱乳清蛋白，其熒光強度隨溫度的升高呈現先升高后降低的趨勢。Jiang Shanshan等的研究也表明，乳清蛋白的熒光強度會隨著溫度的升高而增加，但溫度超過90 ℃時，熒光強度反而會降低。這可能是因為熱處理能夠促進乳清蛋白分子的展開，使色氨酸暴露，疏水基團暴露的數量增加，但過高的誘導溫度會使乳清蛋白暴露過多的疏水基團，疏水基團間的相互作用增強，導致分子聚集、疏水基團被掩埋，熒光強度反而降低。

2.7 WPC凝膠的微觀結構分析

如圖7A所示，WPC溶液pH值在遠離等電點時（pH 2.0、7.0、9.0），WPC凝膠表面光滑，結構細膩，呈半透明狀態；但在等電點附近（pH 4.5）時，WPC凝膠表面粗糙、孔洞較多、有明顯的顆粒感，為白色不透明凝膠。因此，蛋白質凝膠的網絡結構與環境pH值有關。Homer等也發現乳清分離蛋白溶液在遠離等電點時（pH 3.0、7.0）形成由細鏈結構聚集體組成的光滑、半透明凝膠；在等電點附近（pH 5.0）形成的凝膠外觀呈白色顆粒狀，質地較為粗糙。

放大6 000 倍觀察WPC凝膠的表面（圖7B）可以發現，pH值遠離等電點條件下形成的WPC凝膠微觀表面光滑，存在細鏈狀聚集體；但在等電點附近，形成的WPC凝膠表面分布有大量尺寸較大的球狀顆粒聚集體，顆粒聚集體堆積成多孔、片層狀微觀表面。Wang Yaosong等發現pH值遠離等電點時，乳清蛋白形成表面光滑的鏈狀凝膠；Langton等發現中性條件下蠶豆蛋白可形成致密、細膩的凝膠結構，而在等電點附近（pH 5.0）形成的凝膠具有顆粒結構。pH值對凝膠結構的影響可能是因為pH值能夠改變，影響分子靜電斥力，從而改變蛋白質的聚集狀態。在等電點附近，接近于零，蛋白質分子靜電斥力最小，分子聚集加劇，容易形成球形顆粒狀凝膠結構，質地粗糙。pH值遠離等電點時，蛋白質分子表面大，靜電斥力增強，蛋白質分子不易聚集，分子鏈容易伸展，有利于分子間相互交聯形成細鏈狀凝膠結構。

圖7 WPC凝膠橫切面照片（A）及掃描電鏡圖（×6 000）（B）Fig.7 Photographs (A) and scanning electron micrographs (×6 000) (B) of WPC gels

2.8 WPC分子間相互作用力分析

如圖8所示，pH值對WPC凝膠懸濁液透光率有很大影響。pH 4.5時，WPC凝膠懸濁液透光率最低，靜置后極易形成肉眼可見的沉淀，說明等電點附近容易形成尺寸較大的聚集體，使WPC凝膠懸濁液濁度升高。pH 2.0、4.5時，熱誘導溫度對WPC凝膠懸濁液透光率影響不明顯，但pH 7.0、9.0時，經85 ℃熱誘導的WPC凝膠懸濁液透光率明顯低于經60 ℃熱誘導，且3 種解離劑的加入并沒有改變這種規律。這可能是因為pH 2.0、4.5時，60 ℃和85 ℃均能誘導形成WPC凝膠，但pH 7.0、9.0時，只有85 ℃才能誘導形成WPC凝膠（圖2）。Shen Xue等也發現當pH值接近乳清蛋白等電點時，凝膠懸濁液濁度增加明顯。Young等則發現乳清蛋白在遠離等電點時形成的凝膠懸濁液可以較長時間保持穩定。這很可能是因為pH值能顯著改變蛋白質分子表面的，從而影響蛋白質顆粒的形成，引起凝膠懸濁液濁度的變化：在等電點時，乳清蛋白分子所帶凈電荷接近于零，靜電排斥作用很弱，蛋白質分子極易聚集而形成沉淀；遠離等電點時，蛋白質分子帶有大量同種電荷，靜電排斥作用強，蛋白質分子不易聚集，這也說明靜電排斥力在蛋白分子聚集體形成方面發揮重要控制作用。

圖8 解離劑對WPC凝膠懸濁液透光率的影響Fig.8 Effect of dissociation agents on light transmittance of WPC gel suspensions

從圖8還可以看出，與對照（不添加解離劑）相比，不同的制備條件（溫度、pH值）下，加入尿素、SDS和DTT等蛋白解離劑后制備的WPC凝膠，其凝膠懸濁液透光率均明顯升高，說明3 種解離劑的加入能破壞維持WPC凝膠穩定的氫鍵、疏水相互作用、二硫鍵作用。3 種相互作用的強度與凝膠制備的熱誘導溫度有關。pH 2.0、85 ℃制備凝膠時，3 種解離劑的加入使凝膠懸濁液透光率分別升高12%、15%和7%，而60 ℃制備時，透光率分別上升16%、18%和9%，即85 ℃熱誘導的凝膠具有更強的抗解離效果，說明溫度的升高可以明顯增強WPC凝膠中的氫鍵、疏水相互作用、二硫鍵作用，使凝膠更加穩定。Alavi等研究表明80 ℃或90 ℃的熱誘導溫度可以使更多蛋白質分子展開，并在疏水相互作用和二硫鍵等作用下發生聚集。Yang Chen等研究也表明，較高的熱誘導溫度能促使更多的疏水基團參與油菜籽蛋白凝膠的形成，使凝膠更加穩定。Young等研究表明，當誘導溫度大于凝膠溫度時，熱處理可以明顯增強乳清蛋白中蛋白質分子間、蛋白質與水分子間的相互作用。這可能因為提高熱誘導溫度會促使乳清蛋白分子鏈展開得更充分，使更多疏水殘基暴露于蛋白質表面，從而增強蛋白質分子間的氫鍵和疏水相互作用。此外，冷卻過程也有利于增強氫鍵和二硫鍵作用。上述結果表明，氫鍵、二硫鍵及疏水相互作用在WPC凝膠的形成過程中起著非常重要的作用。

3 結論

熱誘導溫度和pH值都能影響WPC凝膠的形成，但二者的影響機理不同。與60 ℃相比，熱誘導溫度為85 ℃時，能形成凝膠的WPC溶液質量濃度、pH值范圍更大，所得凝膠的′較高。較高的熱誘導溫度能促使WPC分子充分展開，降低-螺旋含量（pH≥4.5），使無規卷曲含量升高，紅移，促進蛋白分子之間碰撞，從而可能使分子間疏水相互作用、氫鍵與二硫鍵作用增強，形成致密的網絡結構和黏彈性強的WPC凝膠。pH值可能通過改變WPC分子、蛋白分子二級和三級結構的展開影響凝膠網絡結構。在WPC分子等電點（pH 4.5）附近，凈電荷減少，分子間靜電斥力降低，容易聚集并形成粗糙顆粒狀凝膠；遠離等電點時，蛋白質分子表面大，靜電斥力強，分子不易聚集，有利于形成細鏈狀結構的凝膠。這為研究乳清蛋白凝膠體系及其在不同環境中的實際應用提供理論基礎。