不同百香果品種對莖基腐病的抗性鑒定及防御酶活性研究

吳應海李安定張麗敏彭熙蔡國俊張孫健

(1.貴州科學院山地資源研究所，貴州 貴陽 550001；2.貴州科學院生物研究所，貴州 貴陽 550009)

百香果(Passiflora edulia)又名西番蓮、雞蛋果、洋石榴。是西番蓮科(Passifloraceae) 西番蓮屬(Passiflora L.)多年生半木質化藤本植物，原產于南美洲，我國在20世紀80年代開始引入臺灣、福建、廣東等地區種植，近年來作為貴州農業特色優勢產業發展，2020年百香果在貴州推廣面積達到了11666.67hm2，由于連續種植造成很多果園百香果病害頻發，這不僅對百香果產量造成巨大損失，還嚴重制約貴州百香果產業可持續高質量發展。

百香果莖基腐是百香果最主要病害，其病原菌主要是鐮刀菌(Fusarium sp.)，通常病菌以菌絲體在病株或土壤中越冬，翌年隨著氣溫逐步升高菌絲體逐步萌發，發病高峰期為每年5—7月，植株在苗期及成株期均可染病，主要危害部位為植株莖基部。幼苗染病后表現為葉片萎蔫脫落直到死亡，成株染病初期會在莖基部出現褐色病斑，接著病部皮層出現變軟腐爛，進一步皮層與木質部脫落，隨著病斑橫向擴展環繞整個莖稈時，上部枝蔓及葉片出現黃化、萎蔫，直到病斑擴展到根部導致整個植株死亡。在百香果種植過程中遇到高溫高濕、土壤偏酸、重茬、后期果園清理不干凈等情況非常容易感染莖基腐病，這對于最終產量及經濟效益是一個不可忽視的的因素[1-3]。

研究植物抗病性是科學研究熱點，開展植物抗病研究對于作物產量及品質提高具有重要意義,也對植物及環境保護具有重要作用[4]。植物抗病性主要有形態結構抗病及生理生化抗病性，結構抗病主要通過植株特殊形態結構物理性抵御病原菌侵入。生理生化抗病是指植物體內的一些防御酶，其中主要有POD、CAT、SOD、PPO、PAL等防御酶，這些防御酶含量不僅對于植物形態構建具有重要意義，而且對于植物抗性具有重要決定作用[5]。這些酶活性高低直接影響著植物抗病性強弱，因此這些酶活性高低和峰值出現早晚可作為植物抗性水平和篩選抗病植物品種重要參考標準。本研究針對百香果不同品種莖基腐病抗性鑒定試驗具有一定創新性，目前國內研究較少，這對于后期開展百香果莖基腐病預防與治理提供生理生化方面的理論依據，同時為百香果抗病砧木及抗病品種選育奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試百香果品種

本試驗設在貴州科學院山地資源研究所產學研基地試驗站，試驗站位于貴州省平塘縣克度鎮，N106°48′14.23″，E25°43′48.05″，海拔891m。棚內溫度控制在20～25℃，選用黃果品種(“黔黃1號”、“芭樂味黃金果”)；紫果品種(“貴寒1號”、“臺農1號”、“紫香1號”)；綠皮品種(“綠皮荔枝味百香果”)，共6個品種為試驗對象，每個品種選取30株長勢基本一致，苗齡相同植株，采用盆栽14d后開始莖基腐病菌接種試驗(“貴寒1號”原代碼“平塘1號”)。

1.1.2 供試菌種

百香果莖基腐病菌：鐮刀菌(Fusarium sp.)，由福建省農業科學院植物保研究所蘭成忠老師團隊分離、鑒定、保存供試。

1.2 方法

1.2.1 接種感病指數

1.2.1.1 葉片病菌接種

病菌接種葉片和莖基部為活體接種，采用活體針刺接種自然發病法[6]，種植14d后的百香果苗從頂端開始選擇第2～4張成熟葉片作為接種葉片，葉片接種前用無菌脫脂棉蘸取75%酒精反復擦洗幾次，然后用無菌水擦洗3～5次。用滅菌解剖針在百香果葉片上以葉脈為中軸線兩邊各取3個接種點，每個點之間相距約2cm，每個品種接種10株，每株接種2片葉片(1片作實驗組，1片作對照組),用解剖刀在25℃黑暗培養7d的百香果莖基腐病菌落菌絲0.5mm～1cm的菌塊貼于針刺處，用無菌PDA培養基作為接種對照。然后用沾有1%的葡萄糖水的脫脂棉覆于上面并用20cm×22cm的密封袋將整張接種的葉片密封起來，在控溫大棚中(22～25℃)中保濕72h后，逐日記錄菌斑大小。

1.2.1.2 莖基部病菌接種

每一試驗品種選擇10株，在莖基部離地面5cm位置先用沾有75%的酒精脫脂棉反復擦洗，之后用沾有清水的脫脂棉擦洗干凈，并用已滅菌接種針在莖上環扎4孔，取25℃黑暗培養7d的百香果莖基腐病菌落菌絲0.5mm～1cm的菌塊貼于針刺處，用無菌PDA培養基作為接種對照。然后用沾有1%葡萄糖水的脫脂棉包裹困扎在上面。之后每隔7d觀察每1株的發病情況，并作記錄。

1.2.2 感病評價

葉片接種后每周調查記錄病斑擴展情況，采用“十字交叉法”測量病斑直徑。感病指數[7-10]計算公式：

病害程度的分級根據病斑擴展情況確定，分級標準：病級Ⅰ，感病程度為病斑無擴展；病級Ⅱ，感病程度為病斑1～3mm擴展；病級Ⅲ，感病程度為病斑3.1～6.0mm擴展；病級Ⅳ，感病程度為病斑6.1～9.0mm擴展；病級Ⅴ，感病程度為病斑9.1mm以上擴展。根據病斑指數計算結果，將抗病品種等級進行劃分：感病指數1～35為高抗品種；感病指數36～45為中抗品種；感病指數在45以上為高感品種。

1.2.3 生長指標的測定

在接種病菌21d后進行取樣，參照褚群和趙加欣等方法[11]測量不同處理株高、莖粗、根系鮮重、地上部分鮮重、根體積、根系干重、地上部分干重。

1.2.4 取材及樣品處理

選擇莖基部接種病菌植株作為試驗取材對象，自嫩芽以下完全成熟葉片分別于接種0d、7d、14d、21d取樣，設置3次重復，每個重復3株。將相同處理葉片放入有冰袋的樣品箱中，標記后迅速帶回實驗室放置于-20℃冰箱中保存，用于防御酶活性測定。

1.2.5 測定的項目及方法

過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性測定均由北京索萊寶科技有限公司提供的檢測試劑盒，試劑盒編號分別為BC0090、BC0200、BC0170、BC0190、BC0210。

1.3 數據分析

試驗數據采用WPS Office軟件、SPASS軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 接種結果

接種尖孢鐮刀菌后10d測量菌斑大小，并取樣拍照，從圖1可以看出,6個百香果品種均不同程度感病，但感病最嚴重的是“綠皮荔枝味百香果”，見圖1f，感病最輕的是“黔黃1號”，見圖1a。

圖1 百香果不同品種接種病菌后的病斑生長情況

如表1所示，供試的6個百香果品種接種鐮刀菌后，感病程度有很大差別，其中“綠皮荔枝味百香果”、“紫香1號”感病較重，病斑擴展長度較大，病斑分別為4.35mm、4.24mm，感病指數分別為59.72、56.53，為高感品種;其次是“臺農1號”與“貴寒1號”，病斑為長度分別為3.45mm、3.23mm，病情指數分別為45.83、40.28，為中抗品種；“黔黃1號”與“芭樂味黃金果”病斑較小，病斑長度分別為2.15mm、2.43mm，感病指數分別為23.61、30.89，為高抗品種。感病指數最高是“綠皮荔枝味百香果”，最低是“黔黃1號”，而且兩者之間病斑長度差異顯著，對接種感病后葉片病原再分離，獲得的病原菌與接種病原一致，對照處理葉片未發病。

表1 不同百香果品種接種病菌后感病結果

2.2 不同百香果品種接種莖基腐病菌對地上部分及地下部分的影響

如表2所示，對6種不同品種百香果莖基部接種鐮刀菌后21d，分別對株高、莖粗、根系鮮重、根系干重、地上部分鮮重、根系體積、地上部分干重進行統計分析發現，實驗組各項考察指標均低于對照組，這說明接種鐮刀菌確實影響百香果的生長。黃果品種各項測試數據實驗組與對照組影響最小，其次是紫果品種，綠皮品種影響最大。

表2 不同百香果品種接種鐮刀菌后各項指標變化

2.3 不同百香果品種接種莖基腐病菌后POD活性變化

過氧化物酶廣泛存在于植物體中，是活性較高的一種酶，在植物生長發育過程中其活性不斷發生變化，一般老化組織中活性較高，幼嫩組織中活性較弱，是植物體內重要的活性氧清除劑。由圖2可知，接種后各百香果品種POD酶活性都出現了先上升后下降趨勢，黃果品種酶活性最高，酶活性分別是3.53U·g-1、2.93U·g-1，而且酶活性峰值出現較早，在接種病菌7d出現了峰值，其他百香果試驗品種在接種14d出現峰值。

2.4 不同百香果品種接種莖基腐病菌后CAT活性變化

過氧化氫是生物代謝過程中產生的代謝廢物，其大量的累積能夠對機體細胞造成嚴重的損害，為了避免這種損害，過氧化氫必須被快速地轉化為其他無害或毒性較小的物質，而過氧化氫酶就是常常被細胞用來催化過氧化氫分解的工具。當生物體細胞被病原體感染時，過氧化氫酶活性則升高來分解微生物，從而提高機體抗病性[12]。如圖3所示，百香果品種接種病菌后CAT酶活性逐漸上升，其中黃果種酶活性較高，酶活性分別為2.65U·g-1、2.01U·g-1，并且在接種病菌7d后達到峰值，而其他的品種則在14d達到峰值。

2.5 不同百香果品種接種莖基腐病菌后SOD活性變化

超氧化物歧化酶(SOD)是一種含金屬的抗氧化酶，在活性氧清除反應過程中第1個發揮作用,在抗氧化酶類中處于核心地位,能將超氧物陰離子自由基(O2-)快速歧化為過氧化氫(H2O2)和分子氧。SOD是植物重要抗逆性指標之一，在保護細胞免受氧損傷過程中具有十分重要作用[13]。由圖4可知，在接種病菌后，酶活性逐漸增加，黃果品種酶活性較高，酶活性迅速升高，在接種7d后達到峰值，其他品種則也是14d到達峰值。

圖2 接種病菌后不同百香果品種葉片POD活性變化

圖3 接種莖基腐病菌后不同百香果品種葉片CAT活性變化

圖4 接種莖基腐病菌后不同百香果品種葉SOD活性變化

2.6 不同百香果品種接種莖基腐病菌后PPO活性變化

多酚氧化酶是一種廣泛存在于植物各組織氧化酶，其是一種含銅離子膜蛋白結合酶，多酚氧化酶通過催化木質素及醌類化合物形成，構成保護性屏蔽而使細胞免受病菌侵害，也可以通過形成醌類物質直接發揮抗病作用[14,15]。由圖5可知，接種病菌后黃果品種明顯高于其他品種，所有品種都是在接種莖基腐病菌14d后酶活性達到最大值，“黔黃1號”及“芭樂味黃金果”酶活性最大，酶活性分別是3.13U·g-1、2.93U·g-1，兩者間酶活性差異顯著。“紫香1號”酶活性最小，酶活性為0.97U·g-1。

2.7 不同百香果品種接種莖基腐病菌后PAL活性變化

苯丙氨酸解氨酶(PAL)廣泛存在于植物中，其為植物體次生代謝的關鍵酶及限速酶，在植物體內苯丙烷類物質代謝中起到關鍵酶作用，苯丙烷類代謝進一步形成咖啡酸、綠原酸、類黃酮和木質素等多種抗菌物質的主要途徑，病原菌侵染和病原菌毒素處理都能誘導苯丙氨酸解氨酶活性增強，且酶活增強與抗病性成正相關[16-18]。如圖6所示，總體上說，黃果品種的苯丙氨酸解氨酶活性高于紫果品種，最低是“綠皮荔枝味百香果”。接種莖基腐病菌后所有品種苯丙氨酸解氨酶均上升，并在14d達到最大值。

圖5 接種莖基腐病菌后不同百香果品種葉PPO活性變化

圖6 接種莖基腐病菌后不同百香果品種葉片PAL活性變化

3 結論與討論

在本試驗分別通過對不同百香果品種葉片及莖基部接種莖基腐病菌后，不同百香果品種間菌斑長度出現顯著性差異，菌斑較小的為黃果品種“黔黃1號”、“芭樂味黃金果”，其次為紫果品種“貴寒1號”、“臺農1號”、“紫香1號”，菌斑最大的為綠果品種“綠皮荔枝味百香果”。感病指數最高的是“綠皮荔枝味百香果”，最低的是“黔黃1號”。與此同時，對6種不同品種百香果莖基部接種鐮刀菌后21d，分別對株高、莖粗、根系鮮重、根系干重、地上部分鮮重、根系體積、地上部分干重進行統計分析發現，試驗組各項考察指標均低于對照組，這說明接種莖基腐病菌對百香果的生長發育確實造成一定影響。接種后0d、7d、14d、21d的葉片取樣，對接種POD、CAT、SOD、PPO、PAL活性測定發現，抗性較強的黃果品種POD、CAT、SOD酶活性普遍比其它供試品種高，且峰值出現比其他紫果種和綠果種早。百香果不同品種對莖基腐病的抗性規律：黃果品種>紫果品種>綠皮品種；抗性越強的品種其5種防御酶活性普遍較高，且POD、CAT、SOD 3種酶活性出現峰值時間越早。