食木白蟻腸道降解木質素及環境內分泌干擾物細菌的篩選與特性研究

尚華蓉李成林朱道辰季榮孫建中

(1.江蘇大學環境與安全工程學院，江蘇 鎮江 212013；2.南京大學污染控制與資源化國家重點實驗室，江蘇 南京 210046)

食木白蟻是一種取食木質纖維素昆蟲，能夠在24h 內轉化木質纖維素中90%以上的纖維素并能同時降解半纖維素和木質素[1]。木質素由于其結構復雜，很難被微生物降解，一直以來被認為是木質纖維素利用的最大障礙[2]。近年來，食木白蟻高效降解木質素的能力引起了研究人員的極大熱情和興趣，并開展了大量研究。Butler等分別以天然和人工的木質素喂養白蟻，證明了白蟻能夠消化木質素[3]。此外，木質素降解菌可能同時具有降解EEDs的能力，因此可以從白蟻腸道中篩選環境內分泌干擾物(EEDs)降解菌，為環境生態修復提供技術支持。

本文以木質素及EEDs為底物，從4種食木白蟻腸道內篩選出了33株共13個屬的細菌，并比較了不同食木白蟻腸道內木質素及EEDs降解細菌的構成，證實了白蟻腸道細菌參與了木質素及EEDs的降解，為進一步探明食木白蟻對木質素的降解機制提供了更多的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

黃胸散白蟻、黑胸散白蟻和圓唇散白蟻采集于鎮江南山景區；臺灣乳白蟻由蘇州白蟻防治中心提供。本研究所用木質素及衍生化芳香化合物購自Sigma Aldrich公司，EEDs：壬基酚(NP)、雙酚A(BPA)、雙酚F(BPF)、雙酚S(BPS)和四溴雙酚A(TBBPA)均由南京大學污染控制與資源化研究國家重點實驗室提供。

1.2 木質素及衍生化芳香化合物降解細菌的篩選

在顯微鏡下用鑷子抽取4種低等食木白蟻的腸道各30條，隨之放入裝有1mL 0.4%無菌NaCl溶液的1.5mL離心管中；然后用高溫滅菌后的勻漿器分別將4種低等食木白蟻腸道研磨至均勻懸浮狀；用100uL移液器吸取80uL腸道勻漿懸浮液至M9液體培養基中于30℃ 220r·min-1振蕩培養；待菌液出現渾濁后，轉接到新培養基中，重復此操作3次；最后將菌液在LB固體平板富集并挑取單菌落，最終獲得可降解相應木質素及衍生化芳香化合物的菌種。

1.3 16S rDNA序列測定和系統發育樹的構建

分離到的細菌總DNA用Wizard@基因組DNA純化試劑盒提取，16S rDNA產物擴增參考之前方法[4]。PCR產物委托上海生工生物工程有限公司測序。對測序得到的核苷酸序列，在NCBI上進行Blast操作，通過序列比對確定菌屬，并采用MEGA 5.05分析軟件構建菌種系統發育樹。

1.4 篩選細菌碳源利用分析

分別以木質素、衍生化芳香化合物或者EEDs為唯一碳源，在MM63固體平板上接種8種細菌，根據菌種在平板上的生長特征(如菌株數量、菌落大小)，比較8種細菌的生長狀況。

2 結果和分析

2.1木質素及衍生化芳香化合物降解細菌的篩選

表1 不同白蟻腸道中篩選出的可降解或利用木質素及其衍生化芳香化合物的細菌屬

低等食木白蟻腸道內的木質素及衍生化芳香化合物降解細菌的篩選結果如表2所示。以木質素及衍生化芳香化合物為底物，本研究從4種低等食木白蟻腸道內共篩出了13種菌屬，包括無色桿菌屬、伯克氏菌屬、假單胞桿菌屬、特布爾西氏菌屬、細桿菌屬、潘多拉菌屬、雷弗森菌屬、阪崎腸桿菌屬、蒼白桿菌屬、伊麗莎白菌屬、腸桿菌屬、不動桿菌屬、噬染料菌屬。

2.2 木質素及衍生化芳香化合物降解細菌在低等食木白蟻腸道的構成

臺灣乳白蟻腸道中篩出了8種菌屬，而黃胸散白蟻腸道內篩出了5種菌屬,黑胸散白蟻腸道內篩出了7種菌屬,圓唇散白蟻腸道中篩出了5種菌屬，見表1。從表1中可知，散白蟻和乳白蟻腸道內主要菌屬構成不同,散白蟻腸道內存在著大量可降解木質素及衍生化芳香化合物的伯克氏菌屬，而在臺灣乳白蟻腸道中只篩選出了1種可降解3,4,5-三甲氧基苯甲醛的伯克氏菌屬。在臺灣乳白蟻腸道內可降解木質素及衍生化芳香化合物的菌屬是細桿菌屬，而散白蟻腸道內則較少細桿菌屬。

此外，除了伯克氏菌屬在3種散白蟻中都存在以外，3種散白蟻腸道內主要菌屬構成也有所不同。黃胸散白蟻腸道中，存在著一種假單胞桿菌屬，可降解苯甲酸、香草酸、阿魏酸及木質素。無色桿菌屬則主要存在于黑胸散白蟻腸道內，可降解3,4,5-三甲氧基苯甲醛、3,5-二甲氧基-4-羥基苯乙酸、香草酸、阿魏酸、3,4-二甲氧基苯丙酸，黃胸散白蟻腸道內也少量存在可降解上述化合物的無色桿菌屬。圓唇散白蟻腸道內存在著2種特有的可降解木質素及衍生化芳香化合物的菌屬—伊麗莎白菌屬、腸桿菌屬，其中，伊麗莎白菌屬可降解3,5-二甲氧基-4-羥基苯乙酸、苯甲酸、香草酸、3,4-二甲氧基苯丙酸和木質素，而腸桿菌屬能降解苯甲酸、香草酸及木質素。

從表1中還可以看出，低等白蟻腸道內雖然存在著大量可降解木質素及衍生化芳香化合物的共生微生物，但卻不能有效地降解苯酚類有機化合物，如苯酚、2,6-二甲氧基苯酚。而可降解的香草醛的菌屬也僅有伯克氏菌屬(存在于黃胸散白蟻、黑胸散白蟻腸道內)。

2.3 木質素及衍生化芳香化合物降解細菌的特性研究

2.3.1 細菌利用木質素及衍生化芳香化合物的生長狀況

從表2中可知(碳源編號與表1中木質素及其類似化合物編號一致)，這8種木質素及衍生化芳香化合物降解細菌在一定程度上可有效利用木質素以及6種芳香族化合物，但對于2,6-二甲氧基苯酚、香草醛及苯酚卻不能有效利用；菌株YC105C相比其他細菌更能有效地利用木質素及衍生化芳香化合物；通過Blast序列比對發現YC105C菌株與腸桿菌屬的菌株相似度為99%，這表明菌株YC105C為腸桿菌屬。

2.3.2 木質素降解細菌利用EEDs的生長狀況

研究數據表明，低等白蟻腸道內篩選的木質素降解細菌可有效利用NP、BPA、BPF、BPS、TBBPA 5種EEDs作為唯一碳源來生長，見表3。從表3中可知，8種木質素降解細菌均可高效利用NP、TBBPA，而只有少部分菌種可利用NP、BPF、BPS作為唯一碳源來生長，其中菌株Hu109A可高效利用5種EEDs。通過Blast序列比對確定菌株Hu109A為假單胞桿菌屬；利用MEGA 5.05分析軟件NJ法構建了Hu109A的系統發育樹，見圖1，發現菌株Hu109A與Pesunomonas guariconensis PCAVU11T的16S rDNA序列相似性為98%，確定菌種Hu109A與P.g PCAVU11T同種。

表3 木質素降解細菌在EEDs上的生長狀況

圖1 以16S rRNA序列為基礎的Pseudomonas sp.Hu109A

3 討論

低等食木白蟻腸道內存在著大量可降解木質素及衍生化芳香化合物的共生細菌。本研究以木質素及衍生化芳香化合物為唯一碳源從4種食木白蟻腸道內篩選出共13個屬的33株細菌，其中細桿菌屬、無色桿菌屬、特布爾西氏菌屬、雷弗森菌屬、潘多拉菌屬、伊麗莎白菌屬、噬染料菌屬、蒼白桿菌屬、不動桿菌屬是首次從低等食木白蟻中篩選鑒定的腸道共生細菌[5]，而細桿菌屬、無色桿菌屬、特布爾西氏菌屬、雷弗森菌屬、潘多拉菌屬、伊麗莎白菌屬、噬染料菌屬、蒼白桿菌屬、不動桿菌屬、假單胞桿菌屬、阪崎腸桿菌屬是首次從低等食木白蟻腸道內篩選出的可降解利用木質素及衍生化芳香化合物的菌屬。

木質素及衍生化芳香化合物降解細菌在散白蟻和乳白蟻以及不同散白蟻腸道內的構成有所不同。散白蟻腸道內存在著大量可降解木質素及衍生化芳香化合物的伯克氏菌屬，而臺灣乳白蟻腸道內可降解木質素的菌屬是細桿菌屬，而圓唇散白蟻腸道內可降解木質素及衍生化芳香化合物的特有菌屬則是伊麗莎白菌屬、腸桿菌屬，這可能是由于食物影響到木質素及衍生化芳香化合物降解細菌在白蟻腸道內的種類和分布[6]；此外，低等食木白蟻腸道共生細菌不能有效利用苯酚、2,6-二甲氧基苯酚，這可能是由于白蟻腸道細菌利用木質素及衍生化芳香化合物的機制有所不同。

通過比較8種不同屬的細菌在木質素及衍生化芳香化合物上的生長狀況，本研究復篩出1株可高效利用木質素及衍生化芳香化合物的腸桿菌Enterobacter sp.YC105C，而腸桿菌屬也被眾多研究證明可高效降解木質素及衍生化芳香化合物[7]；假單胞桿菌Pseudomonas sp.Hu109A是首次從黃胸散白蟻腸道內分離鑒定出高效利用NP、BPA、BPF、BPS、TBBPA的假單胞桿菌，也有從水體環境中篩選到可降解EEDs壬基酚、雙酚A的假單胞桿菌，表明假單胞桿菌屬是一類可高效降解利用EEDs的微生物[8]。

通過食木白蟻腸道共生細菌篩選及其特性研究，本研究初步掌握了4種食木白蟻腸道內共生細菌的構成，并獲得了可高效利用木質素及衍生化芳香化合物和EEDs的細菌，這為白蟻腸道降解木質素的機制以及對EEDs的去除提供了更多的參考依據，同時對木質纖維素高效利用以及EEDs的生物治理具有重要的參考價值。