高效液相色譜-質譜法測定脆肉鯇中大環內酯類藥物的殘留

李盛安何國成陳楠劉正華黎小鵬

(1.中山市食品藥品檢驗所，廣東 中山 528437；2.中山市農產品質量安全檢驗所，廣東 中山 528437；3.中山市三鄉鎮農產品質量安全檢測站，廣東 中山 528463；4.中山市小欖鎮農業服務中心，廣東 中山 528415)

大環內酯類抗生素(macrolide antibiotics，MALs)是一類重要的中譜抗菌化合物，養殖戶將其作為治療藥物使用，廣泛應用于畜禽、水產養殖業領域。MALs抗生素對于革蘭氏陽性菌、支原體以及部分革蘭氏陰性菌有良好的抑制和殺滅作用[1]；由于缺少科學用藥知識，抗生素及其代謝物將殘留蓄積在動物組織和器官內，如果人們長期食用殘留有MALs抗生素的畜禽或水產等，可造成前庭和耳蝸神經的損害，導致眩暈和聽力減退，嚴重的會造成肝、腎損害[2]。水產養殖水體中殘留的MALs抗生素不僅影響水生動物生長，還會隨養殖尾水排放進入下游流域繼續對下游水生動物及水環境產生影響。

目前，國內已有科研人員對動物源性食品開展MALs抗生素的殘留檢測研究工作，大量文獻對畜禽中MALs抗生素探討與研究，而對水產領域的研究相對較少。常見的水產中MALs抗生素檢測方法有高效液相色譜法[3]和液相色譜串聯質譜法。魚肉含有蛋白質、脂肪等各種大分子營養成分，樣品基質較為復雜。由于檢測器的局限性可能會影響色譜峰的保留時間及峰型，MALs抗生素殘留采用色譜法配合紫外檢測器檢測無法準確的定性定量。

早在20世紀80年代初，廣東省中山市水產養殖戶就成功培育出了脆肉鯇，經過40a有余的技術摸索及經驗積累，已掌握一套成熟的養殖推廣技術。目前，脆肉鯇在中山市養殖規模近2000hm2，產品銷往國內近30個城市及港澳地區，脆肉鯇加工做成的美食深受人們喜愛。中山脆肉鯇現成為我國國家地理標志產品，每年為養殖戶增收超過2億元，脆肉鯇已成為中山市發展現代農業主要支柱產業之一。我國《食品安全國家標準 食品中獸藥最大殘留限量規定》(GB 31650-2019)規定魚(皮加肉)中紅霉素(erythyomycin)殘留限量為200μg·kg-1，而其它MALs抗生素林可霉素(lincomycin)、竹桃霉素(oleadomycin)、替米考星(tilmicosin)、泰樂菌素(tylosin)、克拉霉素(clindamycin)、螺旋霉素(spiramycin)、吉他霉素(kitasamysin)、交沙霉素(josamycin)并未作出明確規定。由于各種MALs抗生素的分子結構特征及藥物性質相似，在預防治療水產疾病有異曲同工的作用。可能存在不法養殖戶使用大劑量的其它MALs抗生素而逃避監管。因此，在中山市開展脆肉鯇中多種MALs抗生素殘留檢測具有重要的意義。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

乙腈、甲醇(色譜純，色譜科公司)；甲酸(色譜純，上海安譜實驗科技股份有限公司)；PRIME HLB固相萃取柱(3mL，60mg，沃特世公司)、0.2μm尼龍針式過濾器(天津市津騰實驗設備有限公司)。

電子天平(Precisa公司)；搖床，IKA KS 501(德國IKA集團公司)；離心機Sigma 3-18KS(德國Sigma離心機有限公司)；A10超純水純化系統(Millipore公司)；超高效液相色譜-串聯質譜儀UHPLC-MS/MS(1290-6495)(安捷倫科技有限公司)。

林可霉素、竹桃霉素、紅霉素、替米考星、泰樂菌素、克拉霉素、螺旋霉素、吉他霉素、交沙霉素混合標準品為天津阿爾塔科技有限公司。

1.2 色譜質譜條件

色譜柱：Poroshell 120 EC-C18(2.1mm×100mm,2.7μm)；進樣量：5μL；柱溫：40℃；流動相：A為0.1%的甲酸水溶液，B為甲醇溶液，流速為0.4mL·min-1；分離9種MALs抗生素的流動相梯度洗脫條件見表1。

表1 9種MALs抗生素的流動相洗脫梯度

電離方式：噴射流電噴霧電離AJSESI+；干燥氣溫度：200℃；干燥氣流速：17L·min-1；霧化器壓力：40psi；毛細管出口電壓：380V；鞘氣溫度：350℃；鞘氣流量：11L·min-1。監測模式：多反應監測(MRM)采集方式；各抗生素組分離子對及碎裂電壓、碰撞能量及保留時間見表2，9種MALs抗生素多反應監測(MRM)色譜圖見圖1。

1.3 定性與定量

定性，檢測時在同樣的條件下，樣品溶液中色譜峰的保留時間應與混合標準溶液的保留時間一致，容許偏差在±5%以內，樣品溶液中的離子豐度比應與濃度接近的標準溶液的一致，容許偏差符合GB 31660.1-2019要求。定量方法采用內標法定量。

表2 9種MALs抗生素測定的色譜質譜測定條件參數

1.4 樣品提取和凈化

脆肉鯇魚肉攪碎后稱取魚肉樣品10g于50mL具塞離心管中，加入適量替米考星D3內標工作液。加10mL乙腈水(v∶v/8∶2)，擰好蓋子后放置搖床以300r·min-1震蕩混勻20min，以4500r·min-1離心5min。將上清液轉移直接過PRIME HLB 固相萃取柱(3cc，60mg)，無需潤洗，以約1滴·s-1速度收集，棄去最開始的3～5滴濾液然后收集。準確吸取5.0mL濾液，在40℃水浴氮吹至近干，加入1mL甲醇加水(v∶v/1∶1)溶液溶解，過0.2μm濾膜，供液相色譜串聯質譜聯用儀分析測定。同時，做樣品空白試驗。

2 結果與討論

2.1 魚肉前處理提取方法的選擇

考慮到魚肉中含有大量的蛋白質及脂肪等大分子，在提取MALs抗生素時干擾物質較多。實驗對比乙腈、乙酸乙酯、1.0%甲酸甲醇、乙腈水(v∶v/8∶2)溶液4種提取液，分析上述4種提取液的加標回收率，乙腈水(v∶v/8∶2)溶液提取效果相對優于其他提取液。最終本文采用了乙腈水(v∶v/8∶2)溶液為提取液。

2.2 線性回歸方程及檢出限

使用基質配制標準溶液建立標準曲線對樣品進行外標法定量，可以有效消除樣品基質對抗生素組分的干擾。用不含MALs抗生素的魚肉空白基質溶液稀釋配制標準品，配制濃度分別為1.0μg·L-1、5.0μg·L-1、10.0μg·L-1、20.0μg·L-1、50.0μg·L-1、100.0μg·L-1的系列MALs基質混合標準溶液，加入適量內標工作液，上機待測。以各抗生素組分與替米考星D3內標定量離子色譜峰面積比為縱坐標，相應混標溶液與內標的濃度比為橫坐標計算編制標準曲線，以各抗生素組分的特征離子色譜峰10倍信噪比(S/N>10)為方法定量限，線性回歸方程、相關系數r2及各組分定量限見表3。9種MALs抗生素在1～100μg·L-1范圍內線性回歸方程呈良好的線性關系，相關系數r2均大于0.999，9種MALs抗生素的定量限為1.0μg·kg-1，能滿足日常脆肉鯇水產品中9種MALs抗生素殘留監測的需要。

圖1 9種MALs抗生素特征離子質量色譜圖

表3 9種MALs抗生素的線性回歸方程、相關系數及檢出限

2.3 方法回收率和精密度

稱取不含MALs抗生素的魚肉于50mL具塞離心管中，添加1ng·mg-1、2ng·mg-1、10ng·mg-1的9種MALs抗生素進行回收率實驗，添加MALs抗生素混合標準溶液后擰緊蓋子4℃放置過夜，每個濃度同時進行6個樣品的平行實驗。按照前處理方法分析測試。結果表明，9種MALs抗生素的加標回收率在79.8%～110%，相對標準偏差在4.53%～17.9%，方法具有較好的精密度和回收率。

2.4 實際樣品的測定

采用本文建立的檢測方法對中山市脆肉鯇養殖魚塘中36個魚肉樣品(其中小欖鎮26個、西區5個、港口鎮5個)進行測定，9種MALs抗生素均未檢出。

表4 魚肉中9種MALs抗生素的平均加標回收率與精密度

3 結論

本文建立了高效液相色譜串聯質譜法測定魚肉中多種MALs抗生素殘留的監測方法。該方法具有分析時間短、操作簡單、定性準確高及檢出限低等優點。標準《食品安全國家標準 水產品中大環內酯類藥物殘留量的測定 液相色譜-串聯質譜法》(GB 31660.1-2019)包括9種大環內酯類藥物檢測方法，但標準的分析時間較長。本文對前處理提取液進行優化，選擇合適的色譜柱將9種MALs抗生素各組分分離，并優化了質譜測定條件，能在7min的檢測時間內有效分離9種MALs抗生素，大大縮短了分析時間，提高了檢測效率，能滿足日常大批量監測的需要。