循環腫瘤DNA檢測在胃癌診療中的應用現狀

王 芮， 李朝燕， 趙愛光

（上海中醫藥大學附屬龍華醫院，上海 200032）

胃癌的發病率居常見惡性腫瘤的第4位，近年來呈逐年上升的趨勢[1]，已成為世界范圍內因腫瘤致死的第2大疾病[2]。我國是胃癌的高發地區[3]，但由于胃鏡檢查的有創性及早期篩查的不普及，我國早期胃癌檢出率僅為10%[4]，約有40%的患者在被確診時已處于晚期或已發生轉移。癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、糖類抗原（carbohydrate antigen，CA）125、CA19-9、CA72-4等血液腫瘤標志物診斷胃癌的敏感性和特異性均不高，臨床應用受限。循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）由壞死或凋亡的腫瘤細胞釋放到血液中，或由腫瘤細胞直接分泌，也可由外泌體釋放。ctDNA攜帶與腫瘤相關的遺傳信息，在胃癌的早期診斷、疾病進展和耐藥監測、腫瘤復發和微小病灶評估方面具有指導意義。為此，本文對ctDNA的生物學特征和檢測方法，及其在胃癌中的臨床價值進行綜述。

1 ctDNA的生物學特征和檢測方法

1.1 生物學特征

c t D N A是一種無細胞狀態的胞外游離DNA，由單鏈DNA、雙鏈DNA或單雙鏈混合DNA構成，存在于血液、腦脊液等體液中，是腫瘤細胞、原發腫瘤組織、轉移灶通過壞死、凋亡或直接分泌的方式被釋放到外周血中的循環游離DNA（circulating free DNA，cfDNA），ctDNA是cfDNA中攜帶腫瘤特有突變的小部分DNA，這些游離的片段攜帶腫瘤信息[5]。ctDNA存在于腫瘤患者的血液中，其檢出率與腫瘤分期和體積成正比，而cfDNA的升高還可見于良性病變、炎癥性疾病或創傷等情況。有研究結果顯示，ctDNA片段的大小、結構有差異，因細胞凋亡產生的DNA片段多為70～200 bp，而細胞壞死產生的DNA片段較長，為200～21 000 bp。ctDNA在血液中可被快速清除，半衰期通常為15 min～2 h，因此可進行實時監測[6]。血液中的ctDNA主要通過循環酶、腎臟排泄，被肝和脾吸收后，經巨噬細胞降解等途徑降解。ctDNA與蛋白復合物、胞外囊泡和血清蛋白的結合可能會影響其清除率，不同細胞攝取ctDNA的速率也可能會影響其清除率[7-8]。ctDNA攜帶腫瘤特異性基因特征和表觀遺傳學特征，如基因的突變、插入、缺失，染色體重排，拷貝數變異和甲基化改變等，因此ctDNA有成為腫瘤生物標志物的潛力。

1.2 檢測方法

ctDNA僅占cfDNA的0.01%，含量極低，因此需要高敏感的檢測方法。目前常用的檢測方法為二代測序（next generation sequencing，NGS）和聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）。NGS采用邊合成邊測序的方法實現對未知基因及突變的篩查，特點為高通量、高精度和高特異性，可在多個基因中檢測到多個位點的突變，提供更加全面的基因組學信息，進一步提高了ctDNA的檢測效率。ZHOU等[9]采用NGS檢測結直腸癌患者ctDNA的單核苷酸變異數（single-nucleotide variation，SNV），證實該法可反映腫瘤異質性、評估術后腫瘤負荷，可用于追蹤原發和轉移性病灶。用于ctDNA檢測的常用PCR方法為數字PCR。該法可對已知的靶基因及突變進行定量檢測，測序精度較高，其衍生出的微滴式數字PCR可精確計算出靶分子的拷貝數和濃度[10]。目前，已有許多基于微滴式數字PCR的商品化檢測系統，如Raindrop digital PCR（美國RainDance Technologies公司）、QX200 Droplet Digital System（美國伯樂公司）和Naica System（法國Stilla Technologies公司）[11]。此外，BEAMing技術也是較常用的PCR技術，其將數字化PCR與流式技術相結合，利用磁珠與微乳滴結合的原理，對ctDNA進行絕對定量檢測。另外，由于血液中的ctDNA半衰期較短（15 min～2 h），需要快速處理，因此檢測樣本首選血漿，以避免基因組DNA的 污染[12-13]。

2 ctDNA在胃癌診斷中的應用

多數胃原位癌經根治性手術后可被治愈，但一旦發生轉移，即使有手術指征，預后也普遍較差。因此，腫瘤研究的重要目標之一是盡早識別腫瘤，以實施治療。ctDNA作為血液學指標，可在胃癌診斷方面發揮一定的作用。

COHEN等[14]研發出一個名為CancerSEEK的檢測方法，即將ctDNA與血液中的蛋白指標結合起來，以實現在腫瘤轉移前診斷，并定位原發灶，提高根治性手術的治愈率；結果顯示，CancerSEEK對Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期腫瘤診斷的中位敏感性分別是43%、73%、78%，受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線提示在62%的受試者中，該方法的特異性＞99%，該法可增加診斷敏感性，同時不會降低特異性。LI等[15]采用ctDNA測序篩選出胃癌的高頻突變基因KMT2D，體外實驗證實該基因可能是一種促進胃癌細胞增殖的癌基因，可初步用于胃癌的診斷。有Meta分析結果顯示，ctDNA診斷胃癌的合并敏感性[95%可信區間（confidence interval，CI）]和合并特異性（95%CI）分別為62%（59%～65%）、95%（93%～96%），因此特定ctDNA基因突變類型與胃癌瘤體增大及疾病進展等不良事件的發生有關[16]。

表觀遺傳學改變常發生在腫瘤初期，甲基化是表觀遺傳學的重要組成部分，因此可通過ctDNA甲基化檢測進行腫瘤診斷。LING等[17]的研究結果顯示，ctDNA XAF1甲基化與胃癌密切相關，或可用于胃癌的診斷。有學者對液體活檢技術在胃癌應用方面的文獻進行了研究，發現有大量證據支持ctDNA可作為胃癌初步診斷的生物標志物，其診斷價值優于循環腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTC）[18]。ctDNA用于早期腫瘤診斷的挑戰之一是其檢測的敏感性，因為無癥狀個體的ctDNA水平通常較低，因此需要使用大量的血液樣本，或使用高敏感的檢測方法，如微滴式數字PCR和NGS[19]。目前，ctDNA在胃癌診斷方面的研究仍處于探索階段，需要更多的研究證實其有效性。另外，相關檢測技術也有待進一步改進。

3 ctDNA在胃癌患者靶向治療、療效監測、耐藥機制中的作用

胃癌存在很大的異質性，提取的部分組織樣本不能反映整個腫瘤的病理組織和基因信息，且原發腫瘤的基因概況與轉移灶有可能不一致。在腫瘤治療的不同階段，需要反復檢測相關基因，以了解耐藥的分子因素和可適用的新治療靶點。ctDNA檢測有助于胃癌的縱向監測和分析，以實現個體化治療方案的定制和管理。

3.1 ctDNA在胃癌患者靶向治療篩選和療效監測中的作用

人類表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER-2）是一種跨膜的絡氨酸激酶受體，有6%～23%的胃癌患者過表達HER-2，曲妥珠單抗治療HER-2陽性胃癌患者的有效性已被證實[20]。篩查HER-2水平的傳統方法是采用病理學方法對獲取的胃癌組織樣本進行檢測。但由于胃癌本身的異質性及取材部位的差異，無法確保檢測結果的準確性，可能會漏掉部分存在曲妥珠單抗治療指征的患者。ctDNA能克服腫瘤異質性的影響，對腫瘤異質性狀態進行監測和評估。SHODA等[21]使用微滴式數字PCR檢測胃癌患者ctDNA中HER-2拷貝數的變化，以RPPH1為參考基因，將RPPH1與HER-2的比值稱為HER-2率，結果顯示，隨著胃癌的進展或復發，HER-2率持續升高，ctDNA可篩選出HER-2陰性但在復發后逆轉的胃癌患者。WANG等[22]收集了78例胃癌患者的組織樣本和配對的血液樣本，檢測了HER-2的拷貝數和突變數，結果顯示，血液樣本與組織樣本具有較高的一致性 （P=0.000 39），ctDNA可用于檢測血液中HER-2基因的SNV和拷貝數。PECTASIDES等[23]的研究結果顯示，原發性胃食管腫瘤組織與轉移灶配對樣本中的基因突變差異很大，他們進一步對基因測序結果存在差異的患者進行ctDNA檢測，發現轉移灶中的靶基因突變與ctDNA的一致率達87.5%，因此建議將ctDNA測序作為選擇分子靶向藥物治療的標志物。由此可見，采用ctDNA對胃癌患者進行靶向治療的篩選是可行的，臨床可根據每個胃癌患者的不同情況，在治療進程中使用ctDNA評估患者不同時間段的基因變異水平，以不斷完善治療方案。

LIU等[24]的研究結果顯示，利用組織樣本測序與采用血液樣本進行微滴式數字PCR檢測得到的HER-2擴增一致率為81.4%；他們對12例行FOLFOX+曲妥珠單抗治療的胃癌術后患者隨訪1年，每2個月檢測1次HER-2拷貝數狀態，發現經過2個月的治療后，HER-2率顯著降低（P＜0.000 1），而當胃癌發生進展時，HER-2率較未進展時增高2.3～4.1倍，12例胃癌患者的中位無進展生存時間（progressionfree survival，PFS）為9.8個月。由此可見，采用微滴式數字PCR檢測胃癌患者不同臨床進程中的血漿HER-2率，可反映疾病進展和治療效果。AGUILAR-MAHECHA等[25]通過監測1例HER-2陽性胃癌患者ctDNA水平的HER-2拷貝數和PIK3CA突變，發現HER-2拷貝數與藥物反應和疾病進展的聯系優于CEA，建議將ctDNA檢測作為監測HER-2陽性患者治療反應的方法之一。還有學者研究了ctDNA在預測胃癌患者對免疫治療不良反應中的作用，結果顯示，接受免疫治療后血漿ctDNA陽性患者的中位PFS為7.4個月，顯著長于血漿ctDNA陰性的患者（4.9個月）（P=0.025）；從ctDNA中發現CEBPA、FGFR4、MET、KMT2D基因突變的患者發生免疫相關不良反應的可能性更大（P=0.09），因此ctDNA可用來監測免疫治療的效果[26]。雖然有較多研究證實ctDNA可用于指導治療和療效監測，但仍需要大樣本量研究來證實其有效性。

3.2 ctDNA在闡述耐藥機制中的作用

液體活檢可被用來分析由原發腫瘤異質性引起的曲妥珠耐藥，并解釋因新的分子突變而導致的耐藥。WANG等[27]通過檢測胃癌患者ctDNA，發現了32個與曲妥珠耐藥相關的突變基因，并提出可用于預測疾病進展的腫瘤分子負荷指數（molecular tumor burden index，mTBI）；他們將mTBI分為3個不同的級別，由低到高依次為相關的基因突變、激活的基因或通路、突變基因出現擴增；揭示了胃癌患者對曲妥珠單抗的耐藥機制，其中EGFR、MET的SNV與曲妥珠單抗耐藥密切相關。SHAHJEHAN等[28]采用ctDNA基因型檢測來監測HER-2陽性胃癌患者對曲妥珠單抗的耐藥性，結果顯示，有76.5%的患者存在多種耐藥機制，這些患者在接受曲妥珠單抗治療時PFS較短。DU等[29]采用NGS對胃癌患者的ctDNA進行測序，結果顯示，存在MET擴增的胃癌患者對克唑替尼的耐藥機制包括MET擴增和MET的多重二次突變，這也是患者病情惡化的原因。ZHANG等[30]的研究結果表明，基于ctDNA檢測得到的ERBB2特定位點突變（V659D和L7555S）可能會導致胃癌患者對派洛替尼獲得性耐藥，但該結果仍需進一步驗證。腫瘤患者病情的快速進展可能是由于獲得性耐藥突變和預先存在的腫瘤分子異質性導致的。腫瘤患者對抗腫瘤藥物的耐藥機制是復雜且多樣的，因此全面分析分子特征對于腫瘤患者治療策略的制定極為重要。ctDNA檢測有助于闡明腫瘤患者對抗腫瘤藥物的耐藥機制。

4 ctDNA對胃癌根治術預后的評估

在經根治術治療后，仍有20%～50%的胃癌患者可能會發生局部復發或遠隔轉移，因此尋找一個有效的預測因子來識別復發高危人群非常重要。ctDNA可用于追蹤胃癌根治術后微小殘余病灶，預測復發轉移。有研究結果顯示，基線ctDNA水平及ctDNA中基因突變數的增加與胃癌進展期患者不良預后和多位點轉移有關，ctDNA或可用于評估胃癌患者的治療反應[22]。KIM等[31]通過動態監測19例胃癌根治術患者術后12個月內的血液ctDNA水平，發現術后12個月內ctDNA陽性與胃癌復發相關（P=0.029），且預示胃癌復發的中位時間較臨床復發縮短了4.5個月，術前ctDNA陽性與胃癌復發無關。有Meta分析結果顯示，ctDNA與胃癌患者較短的總生存期和PFS密切相關，提示出現一定量的ctDNA預示著預后不良[16]。LI等[32]的研究結果表明，通過ctDNA檢測發現TP53突變和MET基因擴增可用于預測胃癌進展期患者的不良預后。

5 ctDNA檢測的不足和應用展望

雖然有較多研究證實ctDNA可在胃癌的早期篩查和診斷、靶向藥物選擇、療效和復發監測、預后評估等方面發揮作用，但ctDNA檢測的局限性仍不容忽視：（1）ctDNA檢測目前主要依賴于深度NGS，成本較高；（2）ctDNA在外周血中的豐度較低，不同檢測平臺的敏感性和特異性存在較大差異，缺乏統一的判斷標準，不同實驗室之間檢測結果的可比性較差，結果的準確性、可靠性和再現性是不可忽視的問題，需要專門的技術支持；（3）目前尚無臨界值來區分高濃度和低濃度，血液樣本保存不當容易導致ctDNA降解，因此需要建立一套標準化的檢測流程；從預分析階段開始，各處理步驟，包括血漿體積、儲存溫度、采血至血漿分離的時間間隔、離心方案和純化方法都有可能影響最終的檢測結果[33]。

液體活檢是未來腫瘤研究的重要領域之一，但仍缺乏前瞻性、大樣本量的研究，且腫瘤不同分型之間存在固有的異質性。目前有關胃癌的研究仍較少，這可能與胃癌發生、發展中復雜的多階段、多因素過程，較大的瘤內異質性，涉及大量腫瘤相關基因結構改變與表達異常有關。本研究總結了胃癌中基于ctDNA檢測發現的有價值的分子標志物及其作用[13，34-36]，具體結果見表1。通過ctDNA識別腫瘤基因和表觀遺傳學的變化，并將其應用到胃癌的診斷、治療、療效監測及預后評估中，會使胃癌的個體化治療邁上一個新臺階。另外，除評估腫瘤組織樣本檢測與液體活檢的一致性外，還需要針對不同亞型的腫瘤單獨研究ctDNA的價值和可行性，以更好了解其優勢與局限。

表1 ctDNA識別胃癌分子標志物的相關研究概覽