益氣活血中藥組分對慢性腦缺血模型小鼠認知功能的影響及機制Δ

韓富華，劉劍剛，孫林娟，李南南，官 杰，詹 敏，5，陳文潔，5（.中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院腦病科，北京 0009；2.北京中醫(yī)藥大學臨床醫(yī)學院，北京 00029；3.中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院心血管病中心，北京 0009；.青島市海慈醫(yī)療集團內分泌科，山東 青島 266033；5.中國中醫(yī)科學院研究生院，北京00700）

慢性腦缺血（chronic cerebral ischemia，CCI）又稱慢性腦低灌注，是一種由多種原因導致腦血流長期灌注不足進而引發(fā)的慢性腦功能障礙綜合征，早期表現為認知功能受損，隨后可發(fā)展為持久性或進展性的認知及神經功能障礙[1]，是血管性認知功能障礙（vascular cognitive impairment，VCI）的重要危險因素[2]。神經血管單元（neurovascular unit，NVU）是由神經元、血腦屏障、星形膠質細胞及細胞外基質組成的復合體，可發(fā)揮復雜的網絡協同作用，共同維持神經元微環(huán)境的穩(wěn)定[3]。NVU理論將NVU作為神經系統結構和功能的基本單位進行整體研究，把以往對單一神經元的保護擴展為對NVU 中各組成的全面保護[4]，這一研究策略與中藥多靶點、多環(huán)節(jié)、多維度全面保護和整體調節(jié)的作用特點相吻合。探究CCI 狀態(tài)下腦內NVU 的病變情況，并基于此調節(jié)和促進NVU 功能與結構的恢復，對改善CCI 導致的認知功能障礙具有重要意義。

既往研究表明，益氣活血中藥組分（人參總皂苷、銀杏總酮酯、西紅花總苷）能夠透過血腦屏障，可改善VCI患者的認知功能、神經元活動和腦灌注損傷[5]；同時，又可調節(jié)多發(fā)梗死性癡呆大鼠腦內與學習記憶相關的神經遞質水平，改善其認知功能[6]。然而目前該中藥組分對CCI 所致認知功能障礙的作用及機制尚不清楚。本研究基于NVU理論，從動物學習記憶能力、NVU超微形態(tài)結構和相關蛋白[血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、血管生成素1（angiopoietin 1，Ang1）、堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、α7 煙堿型乙酰膽堿受體（α7 nicotinic acetylcholine receptor，α7 nAChRs）]表達等角度入手，探討益氣活血中藥組分對CCI模型小鼠認知功能障礙的影響及作用機制，以期為臨床防治VCI 提供科學依據。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括BT87-3型體內血栓形成測定儀（包頭市昆侖生物化學應用技術開發(fā)研究所）、1049002 型跳臺儀（北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責任公司）、H-7500 型透射電鏡（日本Hitachi公司）、Fresco17-1型低溫冷凍離心機[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]、Tanon 1600型凝膠成像系統（上海天能科技有限公司）、ABI 7500 型熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）儀（美國ABI公司）、Multisksn MK3 型全自動酶標儀（芬蘭Thermo Labsystems公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

益氣活血中藥組分[人參總皂苷（純度≥90%）、銀杏總酮酯（純度≥90%）、西紅花總苷（純度≥90%）混合物，質量比5∶7∶1，批號090914]由神威藥業(yè)集團有限公司提供；阿司匹林腸溶片（批號018170704，規(guī)格100 mg/片）購自石藥集團歐意藥業(yè)有限公司；兔VEGF多克隆抗體（批號GTX50153）購自美國GeneTex 公司；兔α7 nAChRs多克隆抗體（批號ab216485）購自英國Abcam公司；ECL Western blot 底物試劑盒（批號WBKLS0500）購自美國Millipore 公司；大鼠β-肌動蛋白（β-actin）單克隆抗體（批號YM3028）購自美國Immunoway公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔免疫球蛋白G 二抗（H+L）和辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠免疫球蛋白G二抗（H+L）（批號分別為S004、S001）均購自天德悅（北京）生物科技有限責任公司；TRNzol 總RNA 提取試劑（批號DP405-02）購自天根生化科技（北京）有限公司；VEGF、Ang1、bFGF酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（批號分別為20180519A、20180620A、20180625A）均購自北京欣博盛生物科技有限公司；其余試劑均為分析純或實驗室常用規(guī)格，水為純凈水。

1.3 實驗動物

SPF 級雄性C57BL/6J 健康小鼠64 只，8 周齡，體質量為18～20 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，動物生產許可證號為SCXK（京）2019-0008。所有小鼠均飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院醫(yī)學實驗中心屏障級動物房（室溫23～25 ℃，相對濕度50%～70%）內，并自由攝食和飲水。本實驗方案遵循科技部《關于善待實驗動物的指導性意見》的動物倫理要求，經中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核批準（批準號2018XLC012-2）。

2 方法

2.1 CCI模型的建立

所有小鼠適應性飼養(yǎng)7 d 后，隨機分為假手術組（n＝16）和造模組（n＝48）。造模組小鼠術前禁食12 h，腹腔麻醉，仰臥固定后行頸部備皮消毒，剪開頸部皮膚，暴露雙側頸總動脈（長度約1 cm），并在血管下墊玻璃紙以保護周圍組織。將體內血栓形成測定儀的刺激電極、溫度感受器鉤于血管和玻璃紙之間，采用80 μA的溫控電流刺激動脈血管7 min，若血管遠端溫度突然下降則表明血管內血栓形成，即CCI 模型復制成功[7]。然后縫合小鼠傷口，保溫飼養(yǎng)，術后連續(xù)3 d肌內注射青霉素鈉20萬單位/d，以預防感染。取造模24 h后成功存活的小鼠（造模成功率100%）進行后續(xù)實驗。假手術組小鼠按上述方法操作，但不通電。

2.2 分組與給藥

將造模成功的CCI模型小鼠隨機分為模型組、阿司匹林組（陽性對照，10 mg/kg）、中藥組（益氣活血中藥組分，33 mg/kg），每組16只。除模型組和假手術組小鼠灌胃水外，其余各組小鼠灌胃相應藥液，每天1 次，連續(xù)8周。阿司匹林組和中藥組的給藥劑量均為臨床等效劑量[8-9]，且前期實驗已經證實該劑量是能引起（生物）等效反應的相對藥物劑量。

2.3 小鼠學習記憶能力的檢測

采用跳臺實驗檢測各組小鼠的學習記憶能力。實驗前，將小鼠放入實驗箱內，適應環(huán)境5 min并進行學習測試；24 h 后，進行記憶能力測試，將小鼠放于平臺上，記錄從放上平臺至第1次跳下平臺所需的時間（即跳臺潛伏期）和5 min內跳下平臺的次數（即跳臺錯誤次數），以此作為學習記憶能力的評價指標。

2.4 小鼠腦組織樣本的處理

跳臺實驗結束后，所有小鼠禁食12 h，于次日麻醉、處死后快速取出完整腦組織，用預冷的生理鹽水沖洗干凈。每組隨機取5只小鼠的左側腦組織，剝離大腦皮層和海馬組織，分別置于4%中性多聚甲醛溶液中保存；剩余小鼠的腦組織以錫紙包裹并保存于液氮中，置于-80 ℃冰箱中保存。

2.5 小鼠大腦皮層和海馬組織中NVU超微形態(tài)結構的觀察

取“2.4”項下小鼠的大腦皮層和海馬組織，分別用0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液沖洗3 次，加入1%鋨酸溶液于4 ℃下染色2 h，切塊，脫水；然后放入100%樹脂中，常規(guī)包埋，切片（50 nm），于透射電鏡下觀察各組小鼠大腦皮層和海馬組織中NVU 的超微形態(tài)結構，并隨機選取10個視野拍照。

2.6 小鼠腦組織中VEGF 和α7 nAChRs 蛋白表達的檢測

采用Western blot法進行檢測。每組隨機選取“2.4”項下凍存的5只小鼠的腦組織，經裂解、勻漿、靜置后，于4 ℃下以13 000 r/min 離心20 min，取上清液，測定蛋白濃度并于100 ℃下變性。取變性蛋白樣品，進行電泳分離并轉移至聚偏二氟乙烯膜上，封閉后，分別加入VEGF、α7 nAChRs、β-actin 抗體（以含3%牛血清白蛋白的TBST 緩沖液稀釋，稀釋比例分別為1∶500、1∶300、1∶5 000），室溫孵育10 min，4 ℃過夜；加入相應二抗（稀釋比例1：10 000），室溫孵育1.5 h；用TBST 緩沖液洗膜6次，每次3 min，隨后加ECL試劑反應3～5 min，膠片曝光，顯影2 min，定影。使用Total Lab Quant V11.5 版圖像軟件計算灰度值，以目標蛋白與內參（β-actin）的灰度值比值為目標蛋白的表達水平。

2.7 小鼠腦組織中VEGF 和α7 nAChRs mRNA 表達的檢測

采用實時熒光定量PCR 法進行檢測。每組隨機選取“2.4”項下凍存的5 只小鼠的腦組織，采用TRNzol 總RNA 提取試劑提取樣本腦組織的總RNA，測定RNA 濃度和純度后進行cDNA 反轉錄。以所得cDNA 為模板，進行PCR 擴增。反應體系如下：cDNA 模板適量（由1 μg mRNA反轉錄所得），2×Master Mix 10 μL，10 μmol/L的上/下游引物各0.5 μL，加水至總體積為18 μL。PCR反應程序如下：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸40 s，共40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法，以β-actin為內參，計算目標基因的表達水平。各基因引物均由英杰生工生物技術（北京）有限公司設計、合成，引物序列和產物大小見表1。

表1 目標基因的引物序列和產物大小

2.8 小鼠腦組織中VEGF、Ang1、bFGF含量的檢測

每組隨機選取“2.4”項下凍存的5只小鼠的腦組織，嚴格按照ELISA 試劑盒說明書操作，使用酶標儀于450 nm波長處檢測腦組織中VEGF、Ang1、bFGF的含量。

2.9 統計學方法

采用SPSS 25.0軟件進行統計分析。所有數據均用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗、Student-Newman-Keuls 檢驗或Tamhane’sT2檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 益氣活血中藥組分對模型小鼠學習記憶能力的影響

與假手術組比較，模型組小鼠跳臺錯誤次數顯著增多（P＜0.05），跳臺潛伏期顯著縮短（P＜0.05）。與模型組比較，阿司匹林組和中藥組小鼠跳臺錯誤次數顯著減少（P＜0.05），中藥組小鼠跳臺潛伏期顯著延長（P＜0.05）。結果見表2。

表2 益氣活血中藥組分對CCI模型小鼠學習記憶能力的影響（±s，n＝16）

表2 益氣活血中藥組分對CCI模型小鼠學習記憶能力的影響（±s，n＝16）

a：與假手術組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05

組別假手術組模型組阿司匹林組中藥組跳臺錯誤次數1.27±0.16 2.20±0.37a 1.32±0.33b 1.22±0.45b跳臺潛伏期/s 226.45±53.12 179.23±55.29a 217.45±64.35 226.76±66.23b

3.2 益氣活血中藥組分對模型小鼠大腦皮層及海馬組織中NVU超微形態(tài)結構的影響

假手術組小鼠大腦皮層細胞膜完整，胞漿內線粒體、細胞核形態(tài)和分布基本正常。與假手術組比較，模型組小鼠大腦皮層內線粒體嵴斷裂，微血管內皮細胞周圍水腫，血管壁增生，血管內皮細胞和基底膜正常結構消失，內皮細胞、基底膜和膠質細胞之間的間隙增寬。與模型組比較，各給藥組小鼠細胞內線粒體、內皮細胞和基底膜結構修復，血管內皮細胞周圍水腫減輕。結果見圖1。

圖1 益氣活血中藥組分對CCI 模型小鼠大腦皮層中NVU超微形態(tài)結構影響的顯微圖（×20 000）

假手術組海馬組織細胞膜完整，核仁形態(tài)正常，線粒體數量較多且結構基本正常，偶見內質網、高爾基體。與假手術組比較，模型組小鼠海馬組織神經元內細胞器減少，胞質固縮，線粒體數量減少，部分線粒體膜破裂，線粒體嵴模糊并有斷裂現象，基質顆粒減少。與模型組比較，各給藥組小鼠海馬組織神經元內細胞器數量增多，線粒體結構明顯改善，線粒體膜總體清晰，線粒體嵴增多。結果見圖2。

3.3 益氣活血中藥組分對小鼠腦組織中VEGF 和α7 nAChRs蛋白及mRNA表達的影響

圖2 益氣活血中藥組分對CCI 模型小鼠海馬組織中NVU超微形態(tài)結構影響的顯微圖（×20 000）

與假手術組比較，模型組小鼠腦組織中VEGF蛋白及mRNA 的 表達水平均顯著升高（P＜0.05），α7 nAChRs 蛋白及mRNA 的表達水平均顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，中藥組小鼠腦組織中VEGF 和α7 nAChRs 蛋白及mRNA 的表達水平均顯著升高（P＜0.05）；阿司匹林組小鼠腦組織中VEGF蛋白及mRNA的表達水平均顯著降低（P＜0.05）。結果見圖3、圖4。

圖3 益氣活血中藥組分對CCI 模型小鼠腦組織中VEGF、α7 nAChRs 蛋白表達影響的電泳圖和柱狀圖（n＝5）

圖4 益氣活血中藥組分對CCI 模型小鼠腦組織中VEGF、α7 nAChRs mRNA 表達影響的柱狀圖（n＝5）

3.4 益氣活血中藥組分對小鼠腦組織中VEGF、Ang1和bFGF含量的影響

與假手術組比較，模型組小鼠腦組織中VEGF的含量顯著升高（P＜0.05）；bFGF、Ang1 含量差異均無統計學意義（P＞0.05）。與模型組比較，阿司匹林組和中藥組小鼠腦組織中Ang1、bFGF 的含量均顯著升高（P＜0.05），中藥組小鼠腦組織中VEGF的含量顯著升高（P＜0.05）。結果見表3。

表3 益氣活血中藥組分對CCI 模型小鼠腦組織中VEGF、Ang1、bFGF 含量的影響（±s，n＝5,ng/mg）

表3 益氣活血中藥組分對CCI 模型小鼠腦組織中VEGF、Ang1、bFGF 含量的影響（±s，n＝5,ng/mg）

a：與假手術組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05

組別假手術組模型組阿司匹林組中藥組VEGF 9.59±1.23 12.36±2.42a 10.36±2.26 14.38±1.54b Ang1 1.58±0.49 1.49±0.16 1.92±0.55b 2.88±0.70b bFGF 6.35±2.06 6.56±0.54 8.67±2.48b 9.63±2.53b

4 討論

CCI 作為一種腦整體水平血液供應減少的病理狀態(tài)，不僅是多種缺血性腦血管疾病的發(fā)病原因，也是VCI的重要致病因素[10]。本研究采用溫控電流刺激小鼠雙側頸總動脈，損傷血管內皮細胞，促使血小板黏附聚集，造成大腦低灌注，可較好地模擬患者前循環(huán)（頸內動脈系統）缺血導致CCI 的病理狀態(tài)[11]。因本研究所用CCI模型與血小板聚集致頸總動脈血栓栓塞有關，結合《慢性腦缺血中西醫(yī)結合診療專家共識》的推薦（對于血栓形成導致的CCI，臨床應重視阿司匹林抗血小板聚集治療）[12]，本研究以阿司匹林作為陽性對照藥物。本研究結果顯示，模型組小鼠學習記憶能力較假手術組明顯減退，與既往文獻研究的發(fā)現一致[13]。

NVU理論既與中醫(yī)“整體觀”的思想一致，又強調了血管在神經結構和功能保護中的重要地位。王大鵬等[14]研究發(fā)現，CCI 發(fā)生時，NVU 的結構和功能發(fā)生了顯著改變，可見神經元凋亡、微血管完整性受損、血腦屏障功能失調等。本研究觀察到的小鼠腦組織中NVU超微形態(tài)結構的異常改變與上述研究基本一致；同時，該病理變化伴有小鼠學習記憶能力減退。在給予益氣活血中藥組分干預后，小鼠腦組織病理改變和學習記憶能力均有恢復。這提示CCI致NVU超微形態(tài)結構改變可能是CCI導致認知功能受損的病理基礎，且益氣活血中藥組分對這種改變有一定的改善作用。

VEGF 作為NVU 的主要標志蛋白之一，可促進NVU重塑，對缺血大腦的NVU具有特殊的保護作用[15]。Ang1 與NVU 密切相關，當腦缺血發(fā)生時，Ang1 能促進微血管生成，維持血腦屏障的完整性，抑制神經元凋亡，促進神經功能的恢復[16]。bFGF 廣泛分布于中樞神經系統內，不僅能營養(yǎng)和保護神經元，還能促進微血管的再生，誘導側支循環(huán)的建立[17]。α7 nAChRs 與記憶能力密切相關，激活后可減輕缺血腦組織的炎癥反應，抑制細胞凋亡，發(fā)揮神經保護作用[18]。本研究結果顯示，與假手術組比較，模型組小鼠腦組織中VEGF蛋白和mRNA的表達均顯著升高，α7 nAChRs蛋白和mRNA的表達均顯著降低，表明CCI狀態(tài)可影響腦內VEGF的表達，調控腦組織內血管內皮細胞增殖和微血管再生，同時可影響腦內與記憶認知功能密切相關的α7 nAChRs的表達，影響神經元興奮性和神經遞質的傳遞，最終直接損傷小鼠認知功能。在給予益氣活血中藥組分干預后，小鼠腦組織 中VEGF、α7 nAChRs 蛋 白 和mRNA 的 表 達 以 及VEGF、Ang1、bFGF的含量均顯著升高，提示該中藥組分改善CCI 所致認知功能障礙的機制可能與調控腦內與NVU及記憶功能密切相關蛋白的表達有關。

與急性腦血管疾病相比，CCI的可干預時間窗更長，早期診治并有效逆轉CCI 進展對防治VCI 具有重要意義[19]。本研究采用益氣活血中藥組分以臨床等效劑量干預CCI 模型小鼠，結果發(fā)現，該中藥組分能夠顯著改善CCI 模型小鼠的學習記憶能力，促使腦內與NVU 及記 憶 功 能 密 切 相 關 的 蛋 白VEGF、Ang1、bFGF、α7 nAChRs 的含量或表達顯著升高，此舉可促進腦組織中血管內皮細胞增殖和微血管再生，有利于腦血管側支循環(huán)的建立，保護血腦屏障，恢復受損的NVU，增強神經元興奮性和神經遞質的傳遞，從而改善CCI導致的認知功能障礙。

綜上所述，益氣活血中藥組分能夠改善CCI所致的小鼠認知功能障礙，其機制可能是通過保護腦內NVU，恢復受損NVU的超微形態(tài)結構，調控腦內與NVU及記憶功能密切相關蛋白（VEGF、Ang1、bFGF、α7 nAChRs）的表達，進而改善認知功能。