柴胡陷胸湯含藥血清對高脂血清致人臍靜脈內皮細胞損傷的影響及機制Δ

王建湘，廖 楊，易 瓊，陳新宇（.湖南中醫藥大學第一附屬醫院重癥醫學科，長沙 40007；.湖南中醫藥大學研究生院，長沙 4008；3.湖南中醫藥大學第一附屬醫院心血管內科，長沙 40007）

冠心病心絞痛是一種臨床常見疾病，由動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）和冠狀動脈功能改變（痙攣）引起，其發病率和病死率呈逐年上升趨勢，嚴重危害人民生命健康[1-2]。柴胡陷胸湯由小柴胡湯和小陷胸湯二方加減而成，組方藥材包括柴胡、法半夏、黃芩、黃連、瓜蔞、木香、九香蟲、丹參、甘草。該方可減輕冠心病心絞痛患者疼痛發作次數、程度，并縮短疼痛持續時間[3]，但其作用機制尚不明確。

血管內皮功能障礙與冠心病心絞痛的發生、發展密切相關，炎癥和血脂異常則是導致該疾病進展的重要因素[4-5]。據報道，冠心病心絞痛患者存在明顯的血脂高、血管損傷和炎癥因子表達異常等癥狀[6-7]，且Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）/核因子κB（nuclear factorκB，NF-κB）通路被激活[8]；而抑制TLR4/NF-κB 炎癥通路的過度活化可減輕血管炎癥和AS，并改善血脂水平[9]。有研究指出，柴胡陷胸湯中的多種中藥及其主要成分均具有降血脂、抗炎、保護血管內皮細胞的作用，并可抑制TLR4/NF-κB 炎癥通路的活化[10-12]，但該方對冠心病心絞痛的保護作用是否與改善血管內皮功能障礙、抑制炎癥反應有關尚未見報道。

中藥血清藥理研究方法是近年來倍受學界關注的中藥體外藥理實驗研究方法，以含藥血清進行體外實驗可排除中藥復方及粗提物成分、電解性能、滲透壓、酸堿度等因素的影響，并與藥物在體內發揮藥理學效應的真實過程較為接近，故可準確、真實地反映中藥的整體作用及潛在機制。基于此，本研究擬采用高脂血清誘導內皮細胞損傷，探究柴胡陷胸湯含藥血清對血管內皮細胞損傷的影響，旨在為闡明其治療冠心病心絞痛的作用機制提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括Modular P800 型全自動生化分析儀（瑞士Roche公司），HERAcell 240i型CO2細胞培養箱（美國Thermo Fisher Scientific公司），iMark680型多功能酶標儀、蛋白轉膜裝置（電泳儀、轉膜槽）、Quantity One-v 4.6.2型凝膠圖像分析軟件（美國Bio-Rad公司），ABI Prism?7300 型熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）儀（美國ABI公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

柴胡、法半夏、黃芩、黃連、瓜蔞、木香、九香蟲、丹參、甘草藥材均購自北京同仁堂制藥有限公司，由湖南中醫藥大學第一附屬醫院藥品質量控制小組鑒定均為真品。

MTT試劑盒（批號C0009S）購自上海碧云天生物科技有限公司；人腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）、內皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）、一氧化氮（nitric oxide，NO）、內皮素1（endothelin-1，ET-1）酶聯免疫吸附測定試劑盒（批號分別為ml077385、ml028583、ml025095、ml063651、ml025101）均購自上海酶聯生物科技有限公司；Trizol 試劑購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；兔源TLR4、NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65（p-NF-κB p65）、β-肌動蛋白（β-actin）抗體和辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔免疫球蛋白G二抗（批號分別為ab13556、ab16502、ab76302、ab8227、ab205718）均購自英國Abcam 公司；兔源NF-κB 抑制因子α（nuclear factor κB inhibitor α，IκBα）、磷酸化IκBα（p-IκBα）抗體（批號分別為A19714、AP0614）均購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；細胞間黏附分子1（intercelluar adhesion molecule-1，ICAM-1）、轉化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）引物均由廣州銳博生物科技有限公司設計、合成（引物序列與產物大小見表1）。其余試劑均為分析純，水為雙蒸水。

表1 ICAM-1等引物序列和產物大小

1.3 實驗動物與細胞

12 只SPF 級雄性新西蘭兔，6 月齡，體質量3.0～3.2 kg，購自山東艾萊克生物科技有限公司，實驗動物生產許可證號為SCXK（魯）2019-0006；24 只雄性SD 大鼠，7～8 周齡，體質量（210±10）g，購自濟南朋悅動物繁育有限公司，實驗動物生產許可證號為SCXK（魯）2019-0003。所有實驗動物均飼養在（21±1）℃、每12 h 晝夜交替的動物房內。動物實驗方案經醫院倫理委員會批準（批件號IACUC-G14002）。人臍靜脈內皮細胞ECV304（貨號CC-Y1151）購自上海雅吉生物科技有限公司。

2 方法

2.1 柴胡陷胸湯的制備

分別稱取組方藥材柴胡10 g、法半夏10 g、黃芩10 g、黃連4 g、瓜蔞10 g、木香6 g、九香蟲6 g、丹參15 g、甘草6 g，加8倍量的水充分浸泡30 min，煎煮1 h×2次，過濾，合并2 次提取液，煎煮濃縮得柴胡陷胸湯藥液（每1 mL相當于生藥2.0 g）。

2.2 正常血清和高脂血清的制備

將12只新西蘭兔隨機分為正常組和高脂血癥組，每組6 只。參考相關文獻方法[13]，正常組兔給予普通飼料喂養，高脂血癥組兔給予1%高脂飼料（含膽固醇1 g、豬油5 g、蛋黃粉15 g，其余為普通飼料）喂養，每天約100 g，連續喂養12周。第13周，各組兔經麻醉后，于腹主動脈采血40 mL，使用全自動生化分析儀檢測其血清中三酰甘油（triacylglycerol，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）和高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）水平，若TC水平高于正常組3 倍則表示高脂血癥模型復制成功[14]。檢測結果顯示，正常組兔血清中TG、TC、LDL、HDL 水平 分 別 為（1.25±0.13）、（1.67±0.21）、（1.85±0.13）（1.34±0.15）mmol/L，高脂血癥組兔上述指標分別為（2.48±0.19）、（7.14±0.28）、（5.93±0.16）、（0.65±0.11）mmol/L。可見，高脂血癥組兔血清TC 水平約為正常組的4.3 倍，表明高脂血癥模型復制成功。收集兔血清于-80 ℃冰箱中保存，備用。

2.3 柴胡陷胸湯含藥血清的制備

將24 只大鼠隨機分為空白組和柴胡陷胸湯低、中、高劑量組，每組6只。按照人（體質量70 kg）與大鼠體表面積換算公式，以人等效劑量的6.3 倍換算得柴胡陷胸湯中劑量為6.94 g/kg（以生藥量計，下同），同時設置該方低、高劑量分別為3.47、13.88 g/kg。各組大鼠每天早、晚灌胃相應劑量的藥液1次，空白組灌胃等量生理鹽水，連續給藥7 d。末次給藥1 h后，大鼠經戊巴比妥鈉麻醉后，于腹主動脈取血，分離血清，于56 ℃水浴滅活30 min，再于-80 ℃冰箱中保存，備用。

2.4 細胞分組與處理

將ECV304細胞接種于DMEM培養基中，分為對照組、模型組和柴胡陷胸湯低、中、高濃度組，每組設3個復孔。在預實驗結果的基礎上，對照組細胞用含20%正常兔血清的DMEM 培養基培養，其余各組細胞用含20%高脂兔血清的DMEM 培養基培養；24 h 后，對照組和模型組細胞用含20%正常大鼠血清的DMEM培養基繼續培養24 h，柴胡陷胸湯低、中、高濃度組細胞用含20%含藥大鼠血清的DMEM培養基繼續培養24 h。

2.5 細胞增殖能力的檢測

采用MTT 法進行檢測。將ECV304 細胞以5 000個/孔接種在96 孔板中，按照“2.3”項下方法分組、處理、培養。24 h 后，每孔加入5 mg/mL 的MTT 溶液10 μL，繼續孵育4 h；然后，棄去上清液，每孔加入二甲基亞砜150 μL，使用酶標儀在490 nm波長處檢測各孔的光密度（optical density，OD）值。以培養基為空白孔，按下式計算細胞增殖率：細胞增殖率＝（實驗組OD 值-空白孔OD值）/（對照組OD值-空白孔OD值）×100%。

2.6 細胞中炎癥因子和血管內皮功能指標的檢測

采用酶聯免疫吸附測定法進行檢測。收集“2.5”項下各組細胞的上清液，按相應試劑盒說明書操作，使用酶標儀檢測各組細胞上清液中炎癥因子（TNF-α、IL-6）和血管內皮功能指標（eNOS、NO、ET-1）水平。

2.7 細胞中ICAM-1、TGF-β1 mRNA表達的檢測

采用熒光定量PCR法進行檢測。收集“2.5”項下各組細胞，采用Trizol 試劑提取其總RNA，并反轉錄為cDNA，以cDNA 為模板進行PCR 擴增。反應體系（20 μL）包含：SYBR Green Mix（10 μL）、無菌雙蒸水（7.4 μL）、上游引物（0.8 μL）、下游引物（0.8 μL）和cDNA 模板（1.0 μL）。反應條件如下：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40個循環。以GAPDH 為內參，采用2-ΔΔCt法計算目標mRNA 表達水平，以各組細胞中ICAM-1、TGF-β1mRNA 的表達水平與對照組的比值作為評價結果。

2.8 細胞中TLR4/NF-κB通路相關蛋白表達的檢測

采用Western blot法進行檢測。收集“2.5”項下各組細胞，采用RIPA 裂解液提取其總蛋白，測定濃度后，加熱變性。取變性蛋白，經電泳分離后轉移至聚偏二氟乙烯膜上，用5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入兔源TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65、IκBα、p-IκBα、β-actin一抗（除β-actin 的稀釋比例為1∶2 000 外，其余均為1∶1 000），4 ℃孵育過夜；洗滌3 次后，加入二抗（稀釋比例為1∶5 000），室溫孵育1 h；洗滌后，使用化學發光試劑顯影，并采用Image J V1.8.0軟件分析各條帶的灰度值，以β-actin 為內參，計算目標蛋白的相對表達量，并計算p-NF-κB p65/NF-κB p65比值。

2.9 統計學分析

采用GraphPad Prism 8.0 軟件對數據進行統計分析。實驗數據以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 各組細胞增殖能力

對照組、模型組和柴胡陷胸湯低、中、高濃度組細胞增殖率分別為100.00%、（234.25±13.63）%、（168.84±11.44）%、（153.83±10.57）%、（117.02±12.61）%（n＝3）。與對照組比較，模型組細胞增殖率顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，柴胡陷胸湯低、中、高濃度組細胞增殖率均顯著降低（P＜0.05），且柴胡陷胸湯高濃度組細胞增殖率顯著低于柴胡陷胸湯低、中濃度組（P＜0.05）。

3.2 各組細胞上清液中炎癥因子水平

與對照組比較，模型組細胞上清液中TNF-α、IL-6水平均顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，柴胡陷胸湯低、中、高濃度組細胞上清液中TNF-α、IL-6水平均顯著降低（P＜0.05）；此外，柴胡陷胸湯高濃度組上述指標均顯著低于柴胡陷胸湯低、中濃度組，且中劑量組IL-6顯著低于低劑量組（P＜0.05）。結果見表2。

表2 各組細胞上清液中TNF-α、IL-6 水平的檢測結果（±s，n＝3，pg/mL）

表2 各組細胞上清液中TNF-α、IL-6 水平的檢測結果（±s，n＝3，pg/mL）

a：與對照組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與柴胡陷胸湯低濃度組比較，P＜0.05；d：與柴胡陷胸湯中濃度組比較，P＜0.05

組別對照組模型組柴胡陷胸湯低濃度組柴胡陷胸湯中濃度組柴胡陷胸湯高濃度組TNF-α 0.52±0.08 1.97±0.16a 1.55±0.14b 1.27±0.15b 0.84±0.12bcd IL-6 0.66±0.11 2.42±0.17a 1.87±0.15b 1.35±0.12bc 0.98±0.10bcd

3.3 各組細胞上清液中血管內皮功能指標水平

與對照組比較，模型組細胞上清液中ET-1水平顯著升高，eNOS、NO 水平均顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，柴胡陷胸湯低、中、高濃度組細胞上清液中ET-1水平均顯著降低，eNOS、NO 水平均顯著升高（P＜0.05），且柴胡陷胸湯高濃度組上述指標均顯著優于柴胡陷胸湯低、中濃度組（P＜0.05）。結果見表3。

表3 各組細胞上清液中eNOS、NO、ET-1 水平的檢測結果（±s，n＝3）

表3 各組細胞上清液中eNOS、NO、ET-1 水平的檢測結果（±s，n＝3）

a：與對照組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與柴胡陷胸湯低濃度組比較，P＜0.05；d：與柴胡陷胸湯中濃度組比較，P＜0.05

組別對照組模型組柴胡陷胸湯低劑量組柴胡陷胸湯中劑量組柴胡陷胸湯高劑量組eNOS/（ng/mL）4.79±0.45 2.03±0.26a 2.96±0.27b 3.25±0.31b 4.17±0.34bcd NO/（μmol/L）57.29±3.84 21.78±2.31a 33.23±3.62b 38.15±5.64b 49.88±4.58bcd ET-1/（ng/L）8.74±1.15 25.56±2.26a 20.02±2.05b 18.47±1.78b 12.74±1.69bcd

3.4 各組細胞中ICAM-1、TGF-β1 mRNA表達

與對照組比較，模型組細胞中ICAM-1 mRNA 的表達水平顯著升高，TGF-β1mRNA 的表達水平顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，柴胡陷胸湯低、中、高濃度組細胞中ICAM-1 mRNA的表達水平均顯著降低，TGF-β1mRNA的表達水平均顯著升高（P＜0.05）；此外，柴胡陷胸湯高濃度組上述指標均顯著優于柴胡陷胸湯低、中濃度組，且中劑量組TGF-β1顯著高于低劑量組（P＜0.05）。結果見表4。

表4 各組細胞中ICAM-1、TGF-β1 mRNA表達水平的檢測結果（±s，n＝3）

表4 各組細胞中ICAM-1、TGF-β1 mRNA表達水平的檢測結果（±s，n＝3）

a：與對照組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與柴胡陷胸湯低濃度組比較，P＜0.05；d：與柴胡陷胸湯中濃度組比較，P＜0.05

組別對照組模型組柴胡陷胸湯低濃度組柴胡陷胸湯中濃度組柴胡陷胸湯高濃度組ICAM-1 1.00 3.85±0.57a 2.62±0.31b 2.33±0.35b 1.37±0.21bcd TGF-β1 1.00 0.32±0.05a 0.50±0.06b 0.68±0.08bc 0.89±0.09bcd

3.5 各組細胞中TLR4/NF-κB通路相關蛋白表達

與對照組比較，模型組細胞中IκBα 蛋白的相對表達量顯著降低，TLR4、p-IκBα 蛋白的相對表達量和p-NF-κB p65/NF-κB p65比值均顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，柴胡陷胸湯低、中、高濃度組細胞中IκBα蛋白的相對表達量均顯著升高，TLR4、p-IκBα蛋白的相對表達量和p-NF-κB p65/NF-κB p65 比值均顯著降低（P＜0.05），且柴胡陷胸湯高濃度組上述指標均顯著優于柴胡陷胸湯低、中濃度組（P＜0.05）。結果見圖1、表5。

圖1 各組細胞中TLR4/NF-κB通路相關蛋白表達的電泳圖

表5 各組細胞中TLR4/NF-κB通路相關蛋白表達的檢測結果（±s，n＝3）

表5 各組細胞中TLR4/NF-κB通路相關蛋白表達的檢測結果（±s，n＝3）

a：與對照組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與柴胡陷胸湯低濃度組比較，P＜0.05；d：與柴胡陷胸湯中濃度組比較，P＜0.05

組別對照組模型組柴胡陷胸湯低濃度組柴胡陷胸湯中濃度組柴胡陷胸湯高濃度組TLR4 0.43±0.07 1.28±0.08a 0.92±0.09b 0.76±0.08b 0.54±0.06bcd p-NF-κB p65/NF-κB p65 0.66±0.06 1.32±0.09a 1.07±0.08b 0.93±0.05b 0.73±0.07bcd IκBα 0.85±0.07 0.40±0.06a 0.58±0.06b 0.62±0.05b 0.79±0.07bcd p-IκBα 0.10±0.01 0.83±0.09a 0.47±0.06b 0.35±0.05b 0.20±0.03bcd

4 討論

冠心病心絞痛屬于中醫“胸痹”“心悸”范疇，基本病機為氣滯、血瘀、痰濁。雖病位在心，但與肝密切相關。肝主疏泄，肝氣郁結可導致氣滯，繼而引發血瘀和痰濁，阻滯心脈，最終誘發胸痹心痛。因此，冠心病心絞痛的治療應以疏肝理氣化痰為主[3]。柴胡陷胸湯中柴胡疏肝解郁、調達肝氣，法半夏辛開散結、化痰消痞，共為君藥；丹參活血祛瘀、除煩安神，為臣藥；黃芩、黃連清瀉肝郁之火，瓜蔞清熱化痰、寬胸散結，木香、九香蟲均為行氣止痛之要藥，并能疏解肝氣之郁滯，共為佐藥；甘草補益心氣，調和諸藥，作為使藥入方。諸藥合用，共奏疏肝理氣化痰、寬胸活血止痛之功。藥理研究顯示，柴胡皂苷可降低高脂血癥大鼠血液中TG、TC、LDL 水平[10]；在高脂血癥大鼠中，半夏與黃連配伍具有降血脂、下調NF-κB 表達的作用[11]；黃連素可抑制NF-κB 通路，降低血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 水平，增加NO 水平，保護冠心病模型大鼠的血管內皮細胞[12]。以上研究表明，柴胡陷胸湯對冠心病心絞痛的改善作用可能與降血脂、抗炎、保護血管內皮細胞有關。

據報道，冠心病患者的血清可促進人臍靜脈血管內皮細胞增殖，這可能是由于血清中含有與促進血管內皮細胞生長相關的蛋白組分，可促進血管側支循環的建立，并恢復組織血流[15]。本研究結果顯示，柴胡陷胸湯含藥血清可抑制高脂血清誘導的ECV304 細胞的增殖，與上述研究的結果并不一致。筆者推測造成這種現象的原因是柴胡陷胸湯為中藥復方，所含成分多樣，其中部分成分可能具有抑制內皮細胞增殖的作用，至于具體原因和柴胡陷胸湯對血管內皮細胞增殖的抑制作用是否與其防治冠心病心絞痛的機制有關尚有待進一步研究。

內皮功能障礙是AS形成和冠心病心絞痛發病的第一步[16]。在冠狀動脈血栓形成時，內皮細胞會分泌大量ET-1，后者可加重心肌缺血損傷[17]。NO 主要是由內皮源性eNOS催化合成的血管舒張活性因子。當血管受到損傷時，eNOS 表達減少，從而導致NO 合成減少[18]。ICAM-1的過量表達會使白細胞與內皮黏附，促進AS的進展[19]。TGF-β 是血管修復過程中的主要協調者，對穩定頸動脈易損斑塊和延緩AS起到積極作用[20]。在本研究中，筆者使用高脂血清誘導內皮細胞損傷，結果顯示，內皮細胞中eNOS、NO、TGF-β1分泌減少，ET-1 和ICAM-1分泌增加，說明內皮細胞功能出現異常；給予柴胡陷胸湯干預后，上述指標的改變被顯著逆轉，提示柴胡陷胸湯可改善內皮細胞功能異常。

在冠心病的形成、發展過程中始終都有各種炎癥細胞和炎癥因子的參與[7]。異常的內皮功能可增加炎癥因子TNF-α、IL-6 的釋放。TLR4 可促使NF-κB/IκBα 復合物的解離，使IκBα磷酸化并降解，促進NF-κB進入胞核活化，調節促炎性細胞因子的表達。在本研究中，柴胡陷胸湯可降低高脂血清誘導的內皮細胞中TNF-α、IL-6水平和TLR4 表達，抑制IκBα 磷酸化降解和NF-κB p65活化，提示柴胡陷胸湯對內皮細胞損傷的保護作用可能與降低炎癥因子水平和抑制TLR4/NF-κB通路有關。綜上所述，柴胡陷胸湯可改善高脂血清誘導的血管內皮細胞損傷，其作用機制可能與降低炎癥因子水平、抑制TRL4/NF-κB通路活化有關。本研究為冠心病心絞痛的治療及柴胡陷胸湯的應用提供了實驗依據，但由于體內外環境存在差異，該方能否在體內發揮同樣的作用，還有待進一步研究。