復方麝香雪蓮柳酯貼膏中4種揮發性成分含量測定方法的建立Δ

周 鋼，單蓮蓮，馬方圓，柴冰陽，雷慧蘭，陶 虹#a，嚴 華[.新疆維吾爾自治區藥品檢驗研究院，烏魯木齊 830054；2.國家藥品監督管理局中藥（維藥）質量控制重點實驗室，烏魯木齊 830054；3.中國食品藥品檢定研究院，北京 00050]

復方麝香雪蓮柳酯貼膏是新疆天山紅藥業有限公司的獨家品種，其現行質量標準收載于《國家藥品標準·化學藥品地方標準上升國家標準（第14冊）》，標準號為WS-10001-（HD-1365）-2003[1]。該藥由天山雪蓮14 000 g、鹿銜草1 500 g、人工麝香30 g、干姜2 000 g、肉桂500 g、牛膝2 000 g、防風500 g、阿魏根2 000 g、白芷500 g、紅花7 000 g、山柰500 g、薄荷腦1 000 g、生草烏1 500 g、樟腦（合成）4 000 g、天仙子1 500 g、冰片2 000 g、川芎1 500 g、水楊酸甲酯1 500 g、秦艽1 500 g、顛茄流浸膏2 000 g、蕓香浸膏1 250 g 共21 種藥材/提取物/成分組成。臨床實踐證實，復方麝香雪蓮柳酯貼膏在治療風濕、消炎鎮痛等方面具有較好的效果[2-4]。然而，由于其現行質量標準存在若干問題，故至今仍未能正常生產、銷售：其一，樟腦、薄荷腦、冰片、水楊酸甲酯為制劑中的主要揮發性藥材/成分，但現行標準“含量測定”項未見相關揮發性物質的定量檢測，給其長期儲存造成風險[5]；其二，其現行標準采用水蒸氣蒸餾法制備供試品溶液，再以氣相色譜（gas chromatography，GC）法測定制劑中冰片的含量，但研究者在實際操作中發現，該提取方法效率低，定量檢測指標單一，無法全面反映及控制該制劑的質量[6-7]；其三，其現行標準規定冰片的限度為每片不得低于1.5 mg，按7 cm×10 cm/片、5 cm×7 cm/片2種規格分別換算工藝轉換率約為5.4%、11.0%，限度偏低。為此，本研究擬優化供試品溶液的前處理方法，并采用GC法同時測定制劑中樟腦、薄荷腦、冰片（以異龍腦、龍腦總和計）和水楊酸甲酯4種揮發性成分的含量，旨在為提高該制劑的質量穩定性、均一性和完善其質量標準提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括GC-2010Plus 型GC 儀（日本Shimadzu公司），AE240型電子天平、XPR2型百萬分之一電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]，Milli-Q Advantage A10 型超純水儀（美國Millipore 公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

10 批復方麝香雪蓮柳酯貼膏均由新疆天山紅藥業有限公司提供，批號分別為20092501、20101901、20120701、20122801、20170801、21032201、21032801（規格1：7 cm×10 cm/片）和21032201、21032501、21032801（規格2：5 cm×7 cm/片）。

天山雪蓮飲片（批號19070403）、鹿銜草飲片（批號19042401）、人工麝香飲片（批號2019YR056）、干姜飲片（批號19011501）、肉桂飲片（批號19042103）、牛膝飲片（批號19120706）、防風飲片（批號19041001）、阿魏根飲片（批號19042902）、白芷飲片（批號19020601）、紅花飲片（批號19030902）、山柰飲片（批號19030903）、生草烏飲片（批號19043001）、天仙子飲片（批號19050101）、川芎飲片（批號19042901）、秦艽飲片（批號19041101）、顛茄流浸膏（批號190101）、蕓香浸膏（批號20200901）、樟腦（合成，批號2002010）、薄荷腦（批號1902019）、冰片（合成，批號1903001）、水楊酸甲酯（批號1801001）均由新疆天山紅藥業有限公司提供，經石河子大學藥學院龐克堅教授鑒定，各中藥飲片均為真品，蕓香浸膏符合中華人民共和國輕工行業標準QB/T 4427-2012，其余藥材/提取物/成分均符合2020年版《中國藥典》相關要求。

樟腦對照品（批號110747-202011，純度98.8%）、薄荷腦對照品（批號110728-201707，純度99.8%）、冰片對照品[批號110743-201706，純度97.6%（以異龍腦、龍腦總和計）]、水楊酸甲酯對照品（批號110707-201815，純度100.0%）均購自中國食品藥品檢定研究院；乙酸乙酯（分析純）購自國藥集團化學試劑有限公司，硅藻土購自德國Merck公司，超純水為實驗室自制。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為Shimadzu SH-Rtx-Wax 毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.32 μm）；柱溫為140 ℃；檢測器為火焰離子化檢測器，檢測器溫度為200 ℃；載氣（氮氣）流速為2.0 mL/min，吹掃氣（氮氣）流速為30 mL/min；進樣口溫度為200 ℃；分流比為20∶1，進樣量為1.0 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 分別精密稱取樟腦、薄荷腦、冰片、水楊酸甲酯對照品23.316、21.203、23.106、21.909 mg，置20 mL量瓶中，加乙酸乙酯溶解并定容，搖勻，即得單一對照品貯備液。精密量取各貯備液1 mL，置同一25 mL量瓶中，加乙酸乙酯稀釋至刻度，搖勻，即得每1 mL 含樟腦0.046 07 mg、薄荷腦0.042 32 mg、冰片0.045 10 mg、水楊酸甲酯0.043 82 mg 的混合對照品溶液，冷藏，備用。

2.2.2 供試品溶液 取復方麝香雪蓮柳酯貼膏4 片（規格1）或8片（規格2），除去蓋襯，加硅藻土至膏面之間不互相粘連，移至三角瓶中，精密加入乙酸乙酯200 mL，稱定質量，回流提取40 min，至膏面與襯布脫離，立即冷卻，待液體澄清后再次稱定質量，用乙酸乙酯補足減失的質量，搖勻，取上清液5 mL，置25 mL 量瓶中，加乙酸乙酯稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 陰性對照溶液 按處方量稱取相應藥材/提取物/成分，參照“2.2.2”項下方法，從“移至三角瓶中”起同法操作，制備同時缺樟腦、薄荷腦、冰片、水楊酸甲酯的陰性對照溶液。

2.3 系統適用性試驗

取空白溶劑（乙酸乙酯）和“2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各適量，分別按“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。結果顯示，在供試品溶液色譜圖中，存在與樟腦、薄荷腦、冰片（異龍腦+龍腦）、水楊酸甲酯對照品保留時間一致的色譜峰，且空白溶劑、陰性對照溶液均無干擾。結果見圖1（空白溶劑圖略）。

2.4 線性范圍考察

取“2.2.1”項下各單一對照品貯備液0.25、0.50、1.00、2.00、5.00 mL，分別置25 mL量瓶中，加乙酸乙酯稀釋至刻度，搖勻，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積。以待測成分的峰面積為縱坐標（Y）、質量濃度為橫坐標（X）進行線性回歸，得樟腦的回歸方程為Y＝737 077X-774.1（r＝0.999 9），薄荷腦的回歸方程為Y＝700 168X-1 165.9（r＝0.999 9），冰片的回歸方程為Y＝874 990X-284.9（r＝0.999 9），水楊酸甲酯的回歸方程為Y＝457 940X-994.1（r＝0.999 9）；上述成分檢測質量濃度的線性范圍分別為11.5～230.4、10.6～211.6、11.3～225.5、11.0～219.1 μg/mL。

圖1 樟腦等4種揮發性成分定量分析的GC圖

2.5 精密度試驗

取“2.2.2”項下同一供試品溶液（批號20092501）適量，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6 次，記錄峰面積。結果顯示，樟腦、薄荷腦、冰片、水楊酸甲酯峰面積的RSD分別為0.5%、0.6%、3.0%、1.9%（n＝6），表明方法精密度良好。

2.6 重復性試驗

取同一批次復方麝香雪蓮柳酯貼膏樣品（批號20092501），按“2.2.2”項下方法平行制備供試品溶液6份，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按外標法計算含量。結果顯示，樟腦、薄荷腦、冰片、水楊酸甲酯含量的RSD分別為2.8%、2.3%、3.5%、2.5%（n＝6），表明方法重復性良好。

2.7 穩定性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液（批號20092501）適量，分別于23 ℃下密閉放置0、2、4、6、8、12、24、48 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果顯示，樟腦、薄荷腦、冰片、水楊酸甲酯峰面積的RSD 分別為2.1%、2.3%、1.8%、1.4%（n＝8），表明供試品溶液在上述條件下放置48 h內穩定性良好。

2.8 加樣回收率試驗

取已知含量的復方麝香雪蓮柳酯貼膏樣品（批號20092501）2片，共9份，除去蓋襯，加硅藻土至膏面之間不互相粘連，移至三角瓶中，分別精密加入相當于已知量80%、100%、120%的樟腦、薄荷腦、冰片、水楊酸甲酯對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表1。

表1 樟腦等4種揮發性成分定量分析的加樣回收率試驗結果（n＝9）

2.9 耐用性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液（批號20092501）適量，分別以Agilent DB-WAX UI（30 m×0.25 mm，0.53 μm）、Shimadzu SH-Rtx-Wax（30 m×0.25 mm，0.32 μm）、Thermo TG-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）為色譜柱，其余按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按外標法計算含量。結果顯示，供試品溶液中樟腦、薄荷腦、冰片、水楊酸甲酯含量的RSD分別為2.0%、1.8%、1.9%、1.8%（n＝6），表明該方法在不同色譜柱上的耐用性良好。同時，改變柱溫分別至100、140、180 ℃，其余按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果顯示，供試品溶液中各待測成分色譜峰的保留時間分別與樟腦、薄荷腦、冰片、水楊酸甲酯對照品色譜峰一致，各待測成分色譜峰的理論板數、分離度、拖尾因子均符合2020 年版《中國藥典》（四部）“氣相色譜法系統適用性”的要求[8]。

2.10 樣品測定結果

分別取10批復方麝香雪蓮柳酯貼膏樣品4片（規格1）或8片（規格2），按“2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按外標法計算含量，結果見表2。

表2 10批樣品的檢測結果

3 討論

3.1 提取方法及條件的選擇

復方麝香雪蓮柳酯貼膏的制備過程如下：將天山雪蓮、紅花、肉桂、防風、白芷、山柰、生草烏、天仙子、川芎、秦艽、鹿銜草、干姜、牛膝、阿魏根粉碎成粗粉，用90%乙醇作為溶劑進行滲濾，收集滲濾液，制成相對密度為1.25～1.30的流浸膏；按處方量稱取其余各味藥材/提取物/成分，加入適量基質（由橡膠、松香等制成），制成涂料并涂布于500 m2的醫用彈性布上，切段，蓋襯，即得。該藥處方含有新疆優勢藥材紅花、天山雪蓮和維吾爾族常用藥材阿魏根，工藝中有粉碎、滲漉、濃縮等過程，是典型的中藥民族藥復方制劑。該貼膏的現行標準要求檢測冰片的含量，其樣品處理方式為：取樣10片，加水150 mL，連接揮發油測定裝置，加乙酸乙酯5 mL至刻度，加熱回流3 h，接收隨水蒸氣蒸餾而出的含冰片的乙酸乙酯層，該組分經脫水、稀釋后進樣分析。此提取方法操作煩瑣且費時。同時，本課題組前期研究發現，上述方法所得色譜圖中冰片的色譜峰峰形雖較好且無雜質干擾，但無法從橡膠膏貼中充分提取出揮發性成分，原因可能為橡膠等基質成分（含橡膠、松香、石蠟、氧化鋅等）復雜[9-10]，其包裹揮發性成分后形成疏水層，使得水蒸氣無法進入膏貼內部，導致冰片檢測結果偏低。針對上述情況，本研究采用乙酸乙酯回流提取，使膏面逐漸與襯布脫離，使揮發性成分充分溶解到溶劑中；雖然大多數雜質也可溶于乙酸乙酯，但通過稀釋后基本能排除復雜基質對檢測的影響，同時也能保證樟腦、薄荷腦、冰片、水楊酸甲酯得到充分提取。

本課題組前期研究發現，與超聲提取相比，加熱回流能有效破壞膏面，提取效果更好，故選擇加熱回流。在溶劑選擇方面，甲醇、乙醇加熱回流提取30 min 均不能完全破壞膏面，且溶出的雜質會影響后續分析；采用環己烷、二氯甲烷為提取溶劑，橡膠大量溶解于溶劑中，形成混懸液，無法進行后續檢測，故未選擇上述溶劑；以乙酸乙酯為提取溶劑并按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，能得到較為滿意的分離、檢測效果。

3.2 GC條件的選擇

當進樣口溫度為160 ℃時，所得色譜峰易出現肩峰，分析原因為復雜基質會對待測成分的峰形產生影響；當進樣口溫度升至200 ℃后，上述情況消失。當分流比為20∶1時，可在保證待測成分被準確檢測的同時，除去大多數基質成分對儀器本身及色譜柱的影響。本課題組還比較了Thermo TG-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）、Shimadzu SH-Rtx-Wax（30 m×0.25 mm，0.32 μm）和Agilent DB-WAX UI（30 m×0.25 mm，0.53 μm）的分離效果，結果顯示，三者分離度、理論板數、拖尾因子均符合2020年版《中國藥典》（四部）的相關要求[8]，提示該分析方法的耐用性較好，可適用于不同固定相類型、不同粒徑的毛細管色譜柱。值得注意的是，橡膠等復雜基質可吸附于進樣口的石英玻璃纖維上，從而對待測成分的分離造成影響，但上述影響可通過定期更換該部件解決；同時，筆者在研究過程中統計發現，連續進樣40次，待測成分的色譜峰峰形并未明顯變差。

3.3 樣品檢測結果分析

現行標準規定，復方麝香雪蓮柳酯貼膏中冰片不得低于1.5 mg/片，即便按規格2 計算，工業轉化率也僅為11.0%，限度偏低，應予以修訂。筆者通過比較發現，本方法測得的冰片含量比原標準方法測得的冰片含量提高了近1倍。

根據處方量計算得樟腦、薄荷腦、冰片和水楊酸甲酯的投料量分別約為56、14、28、21 mg/片，按新建方法測得規格1 貼膏中上述成分的實測值分別約為18、5、10、7 mg/片，規格2貼膏因膏貼面積減半，各成分含量也隨之減半?？梢?，各成分含量檢測值約占投料量的30%，這主要與橡膠膏貼的熱壓法生產工藝有關，即制膏與涂膏過程有諸多加熱環節，容易造成揮發性成分大量損失[11]，使得各成分檢測值較投料量低。

3.4 檢測方法的完善

本研究采用外標法同時測定了復方麝香雪蓮柳酯貼膏中樟腦、薄荷腦、冰片、水楊酸甲酯的含量，彌補了現行質量標準僅定量分析冰片的不足；方法學考察結果顯示，本研究所建GC法簡單、靈敏、準確，可用于該制劑中多種揮發性成分的定量分析，有利于更全面地對其質量進行控制與評價。

綜上所述，本研究優化了復方麝香雪蓮柳酯貼膏中揮發性成分的前處理方法，建立了測定復方麝香雪蓮柳酯貼膏中4 種揮發性成分含量的GC 法，可更為全面地反映該制劑的質量，為其后續質量標準的修訂提供參考。