基于指紋圖譜及化學模式識別的歸芪通脈合劑質量評價Δ

王韻旨，郭 麗，吳作敏，寧 萌，應真真，金少舉，于曉濤，王 瑞#（.漯河市第一人民醫院藥學部/河南省中藥制劑與加工中醫藥重點實驗室/河南省中藥制劑現代化技術研發與臨床應用工程研究中心，河南漯河46000；.漯河醫學高等專科學校藥學系，河南漯河 4600）

歸芪通脈合劑由黃芪、當歸、川芎、紅花、赤芍、黨參、桃仁、白術、陳皮、茯苓、甘草、地龍、僵蠶、蜈蚣14味中藥組成，由經典名方“補陽還五湯”加減而成，全方以活血行氣藥為主，輔以通經活絡之品，具有活血通絡、行氣化瘀的功效，主要用于缺血性腦卒中恢復期氣虛血瘀證的臨床治療，對手足不遂、肢體麻木、舌強語蹇等癥狀的緩解效果較好[1]。

本課題組前期對歸芪通脈合劑的提取工藝進行了優化，并建立了黃芪甲苷和羥甲基紅花黃色素A的含量測定方法[1]。該藥的現行質量標準除對制劑性狀、裝量、密度、pH值和微生物限度進行規定外，僅要求采用薄層色譜法對制劑中的黨參、赤芍和黃芪進行定性鑒別[2]，且尚未見歸芪通脈合劑質量控制的相關研究報道。由于中藥復方制劑療效的發揮是多種化學成分共同作用的結果，故藥材的薄層鑒別和單個或數個成分的含量測定無法充分反映歸芪通脈合劑的整體質量[3]。

指紋圖譜結合化學模式識別可實現對中藥飲片及其制劑整體質量的全面分析。中藥指紋圖譜技術能較充分地提取中藥及其復方制劑色譜圖中的化學成分信息，具有信息量大，專屬性、整體性和模糊性強的特點，是目前中藥制劑分析的常用方法之一[4]。化學模式識別技術可分為兩類：一類是無監督的分析方法，包括層次聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）和主成分分析（principle component analysis，PCA）等；另一類是有監督的分析方法，包括偏最小二乘法-判別分析和正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal partial least squarediscriminate analysis，OPLS-DA），上述方法可通過對指紋圖譜中的多維數據信息進行分類、降維等處理，篩選出其中的質量差異標志物，從而客觀、系統、全面地分析中藥及其復方制劑的整體質量，并為其質量控制提供依據[5]。基于此，本研究擬建立歸芪通脈合劑的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，同時結合化學模式識別技術全面、系統地評價該藥的質量，旨在為后續的質量控制、藥效學和作用機制研究提供參考，為相關中藥新藥的開發提供依據。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有LC-20AD 型HPLC 儀、AUW-120D 型十萬分之一電子天平（日本Shimadzu 公司），5810R 型低溫高速離心機（德國Eppendorf 公司），Milli-Q型超純水儀（美國Millipore公司），KQ-600DE型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

芍藥苷對照品（批號110736-201842，純度97.4%）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品（批號111920-201606，純度97.6%）、甘草苷對照品（批號111610-201607，純度93.1%）、甘草酸銨對照品（批號110731-201720，純度97.7%）均購自中國食品藥品檢定研究院；羥基紅花黃色素A 對照品（批號MUST-19082111，純度98.1%）、芍藥內酯苷對照品（批號MUST-19041601，純度99.1%）、橙皮苷對照品（批號MUST-19030701，純度98.5%）均購自成都曼思特生物科技有限公司；蕓香柚皮苷對照品（批號DST200519-098，純度99.2%）購自成都德思特生物技術有限公司；甲醇、乙腈、磷酸均為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

13 批歸芪通脈合劑[編號S1～S13，批號分別為20210512、20210620、20210725、20210808、20210826、20210924、20211005、20211028、20211205、20211219、20220108、20220117、20220223，規格100 mL（每1 mL相當于飲片總量0.85 g）]均由漯河市第一人民醫院制劑室提供。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜條件參考相關文獻[1]：以Gemini Phenomenex C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，以乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B）為流動相進行梯度洗脫（0～5 min，15%A→20%A；5～30 min，20%A；30～53 min，20%A→80%A；53～58 min，80%A→15%A）；流速為0.8 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測波長為230 nm；進樣量為5 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 取羥基紅花黃色素A、芍藥內酯苷、芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、甘草苷、甘草酸銨、蕓香柚皮苷、橙皮苷對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解，得到上述各成分質量濃度分別為524.89、406.47、30.19、81.98、170.37、121.15、318.43、60.06 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 精密吸取歸芪通脈合劑樣品2.5 mL，用甲醇定容至10 mL 量瓶中，超聲（功率120 W，頻率40 kHz）提取30 min，靜置后取上清液1.5 mL，置于離心管中，以14 000 r/min 離心10 min，取上清液，經0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.3 HPLC指紋圖譜的建立

2.3.1 精密度試驗 精密吸取“2.2.2”項下編號為S4 的供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續測定6 次，以蕓香柚皮苷為參照峰，計算各共有峰的相對峰面積和相對保留時間。結果顯示，各共有峰相對峰面積的RSD 為0.21%～2.53%（n＝6），相對保留時間的RSD為0.02%～0.28%（n＝6），表明方法精密度良好。

2.3.2 穩定性試驗 精密吸取“2.2.2”項下編號為S4 的供試品溶液，分別于室溫下放置0、3、6、12、18、24 h時按“2.1”項下色譜條件測定，以蕓香柚皮苷為參照峰，計算各共有峰的相對峰面積和相對保留時間。結果顯示，各共有峰相對峰面積的RSD 為0.22%～3.24%（n＝6），相對保留時間的RSD 為0.02%～0.76%（n＝6），表明樣品溶液在室溫下放置24 h內穩定性良好。

2.3.3 重復性試驗 精密吸取“2.2.2”項下編號為S4 的供試品溶液6 份，按“2.1”項下色譜條件測定，以蕓香柚皮苷為參照峰，計算各共有峰的相對峰面積和相對保留時間。結果顯示，各共有峰相對峰面積的RSD 為0.13%～3.13%（n＝6），相對保留時間的RSD為0.05%～1.12%（n＝6），表明方法重復性良好。

2.3.4 HPLC指紋圖譜的建立 精密吸取按“2.2.2”項下方法配制的各批歸芪通脈合劑供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，將所得圖譜數據導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012 版）》，以色譜峰數量及峰面積均較穩定的S4樣品為參照，采用中位數法，設置時間窗寬度為0.2 min，經多點校正后進行色譜峰匹配、疊加，得到疊加指紋圖譜和對照指紋圖譜（R）[6]。結果顯示，13批樣品共有19個共有峰，詳見圖1。

圖1 13批歸芪通脈合劑樣品的HPLC疊加指紋圖譜和對照指紋圖譜

2.3.5 共有峰的指認 將編號為S4 的供試品溶液與混合對照品溶液的色譜圖進行疊加對比后，共指認了8個共有峰，分別為7號峰（羥基紅花黃色素A）、8號峰（芍藥內酯苷）、9 號峰（芍藥苷）、10 號峰（毛蕊異黃酮葡萄糖苷）、12 號峰（甘草苷）、14 號峰（甘草酸銨）、16 號峰（蕓香柚皮苷）、19號峰（橙皮苷）。結果見圖2。

圖2 歸芪通脈合劑指紋圖譜共有峰指認的HPLC圖

2.3.6 相似度評價 應用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012 版）》對13 批歸芪通脈合劑樣品的圖譜進行相似度評價。結果顯示，13批樣品圖譜與對照指紋圖譜的相似度分別為0.983、0.989、0.961、0.990、0.987、0.983、0.988、0.976、0.928、0.986、0.980、0.989、0.985，表明13批歸芪通脈合劑的化學成分一致性較好，整體質量相對穩定。因蕓香柚皮苷的分離度較好、峰面積較大、峰形和保留時間穩定，故選擇蕓香柚皮苷為參照峰，得到13 批樣品19 個共有峰相對保留時間的RSD 為0.05%～1.94%，說明各批樣品共有峰的保留時間較為穩定；19 個共有峰相對峰面積的RSD 為6.30%～35.33%，表明部分成分含量可能存在較大差異。

2.4 HCA

以19 個共有峰峰面積為變量，使用SPSS 25.0 軟件進行標準化處理，采用Ward 法以平方歐氏距離為測度進行HCA[7]。結果（圖3）顯示，當平方歐氏距離為15時，13 批樣品可分為3 類，其中S5、S9、S11～S13 為一類，S4、S8為一類；S1～S3、S6～S7、S10為一類，提示不同批次歸芪通脈合劑樣品的化學成分存在差異，推測可能與其原飲片來源差異有關。

圖3 13批歸芪通脈合劑樣品的HCA樹狀圖

2.5 PCA

以19 個共有峰峰面積為變量，使用SPSS 25.0 軟件進行PCA。結果（表1）顯示，以特征值大于1為標準，篩選得到7個主成分，其累計方差貢獻率達到92.115%，表明這7 個主成分可以反映13 批歸芪通脈合劑原始色譜圖中的大部分信息[8]。旋轉因子載荷系數能綜合反映各成分對不同主成分的影響，其絕對值越大則成分對主成分的影響越大[9]。結果顯示，主成分1 中，16 號峰（蕓香柚皮苷）、12號峰（甘草苷）和11號峰的因子載荷系數較大，分別為0.948、0.927、0.745，說明其對制劑質量的影響較大；9號峰（芍藥苷）是影響主成分2的主要因子（因子載荷系數為0.835）；14號峰（甘草酸銨）和7號峰（羥基紅花黃色素A）是對主成分3影響較大的特征向量（因子載荷系數分別為0.888、0.757）；17 號峰和19 號峰（橙皮苷）是主成分4 的主要決定因子（因子載荷系數分別為0.842、0.696）；主成分5 中，18 號峰和2 號峰的因子載荷系數較大，分別為0.874、0.832；主成分6主要反映了6號峰和4號峰的信息（因子載荷系數分別為0.933、0.774）；主成分7 主要反映了5 號峰的信息（因子載荷系數為0.776）。

表1 歸芪通脈合劑PCA特征值及方差貢獻率

2.6 OPLS-DA

為更好地分析樣品之間的差異，本研究根據PCA、HCA 結果，以19 個共有峰峰面積為變量，使用SIMCA 14.1軟件對13批歸芪通脈合劑樣品進行OPLS-DA。結果顯示，模型X矩陣的解釋能力參數（RX2）、模型的穩定性參數（RY2）和模型的預測能力參數（Q2）分別為0.763、0.942、0.816，均大于0.5，表明建立的模型擬合較好，具有較高的穩定性和預測性[10]，可用于分析不同批次歸芪通脈合劑樣品之間的質量差異。OPLS-DA 得分圖（圖4）顯示，13批樣品可分為3類，與HCA結果一致。

圖4 13批歸芪通脈合劑樣品的OPLS-DA得分圖

在OPLS-DA 載荷圖中，各色譜峰投影點離原點越遠，表明其代表的變量權重值越大[11]。由該載荷圖（圖5）可知，16、9、12、14、11、1、7 號峰對應成分具有較大的貢獻。

圖5 13批歸芪通脈合劑樣品的OPLS-DA載荷圖

變量重要性投影（variable importance in the projection，VIP）值越大，表示對應成分對樣品的分類貢獻越大。本研究以VIP 值＞1 為標準[12]，篩選影響歸芪通脈合劑質量的差異標志物。結果（圖6）顯示，共篩選得到6 個對樣品質量影響較大的共有峰，依次為16 號峰（蕓香柚皮苷）、9號峰（芍藥苷）、12號峰（甘草苷）、14號峰（甘草酸銨）、11號峰、1號峰。

圖6 歸芪通脈合劑各共有峰的VIP值

3 討論

3.1 提取條件的考察

本課題組前期考察了不同提取溶劑（75%甲醇、50%甲醇、25%甲醇、水）和超聲提取時間（15、30、45 min）對供試品溶液色譜峰數量和響應強度的影響。結果顯示，以75%甲醇為溶劑超聲提取30 min時，所得供試品溶液色譜圖中色譜峰的數量較多且響應較強，故選擇75%甲醇為提取溶劑，超聲提取時間為30 min。

3.2 色譜條件的優化

本課題組前期對流動相（乙腈-0.1%甲酸溶液、乙腈-0.05%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.2%磷酸溶液）、柱溫（25、30、35 ℃）、流速（0.8、1.0、1.2 mL/min）、洗脫程序進行了優化。結果顯示，當選擇流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液、柱溫為30 ℃、流速為0.8 mL/min并進行梯度洗脫時，所得色譜圖的基線較平穩，色譜峰數量較多，色譜峰分離度和峰形較好。同時，本課題組使用二極管陣列檢測器在190～800 nm波長下對歸芪通脈合劑供試品溶液進行了掃描，通過對比不同檢測波長下各色譜圖中的色譜峰數量、色譜峰響應強度和基線穩定性發現，在230 nm波長處采集的色譜圖基線較平穩，色譜信息較豐富，色譜峰峰面積較大，故確定檢測波長為230 nm。

3.3 指紋圖譜結果分析

為排除個別超常數據對結果的影響，本研究在建立13 批歸芪通脈合劑樣品的HPLC 指紋圖譜時選擇了中位數法，使得到的對照指紋圖譜更具代表性[13]。13批樣品與對照指紋圖譜的相似度為0.928～0.990，表明歸芪通脈合劑的制備工藝穩定性較好；但樣品中部分成分色譜峰相對峰面積的RSD較大，這可能與樣品原飲片來源不同有關；另外，從歸芪通脈合劑樣品中識別出8種化學成分，分別來自處方中的黃芪、紅花、赤芍、甘草和陳皮[1]。

3.4 化學模式識別結果分析

指紋圖譜分析結果可在一定程度上反映出各批次樣品化學成分組成的相似性和含量的高低，為進一步提取指紋圖譜中的有效信息，本研究采用化學模式識別技術對共有峰的峰面積進行了分析[14]。HCA結果顯示，13批歸芪通脈合劑樣品可分為3類，其中S5、S9、S11～S13為一類，S4、S8 為一類，S1～S3、S6～S7、S10 為一類，這可能與原飲片采收地點和時間不同有關。利用PCA 進行降維分析，篩選得到7個導致13批樣品分類差異的主成分，由旋轉因子載荷矩陣可知，8個已知成分中有6個成分與該制劑質量差異有關。OPLS-DA 結果顯示，蕓香柚皮苷（16號峰）、芍藥苷（9號峰）、甘草苷（12號峰）、甘草酸銨（14 號峰）和11、1 號峰對應成分的VIP 值均大于1，表明這6 個成分是影響樣品質量的差異標志物。有研究表明，芍藥苷可通過激活腦卒中大鼠體內的環磷酸腺苷/蛋白激酶A/環磷酸腺苷反應元件結合蛋白通路來發揮改善神經功能的作用[15]；蕓香柚皮苷具有較強的抗氧化和抗炎活性，能減輕腦缺血/再灌注損傷，具有神經保護作用[16]；甘草苷可通過抑制細胞間黏附因子1 的表達和降低髓過氧化物酶的活性來減輕腦缺血/再灌注誘發的炎癥反應[17]；甘草酸銨是活性成分甘草酸的單銨鹽，能通過減少腦缺血/再灌注損傷過程中丙二醛的生成而抑制腦神經細胞的凋亡[18]。可見，6 個差異標志物中的4個已知成分對缺血性腦卒中均有改善作用，其中芍藥苷和蕓香柚皮苷分別為處方中赤芍和陳皮的主要活性成分，甘草酸銨和甘草苷為處方中甘草的主要活性成分，因此建議嚴格把關制劑中赤芍、甘草和陳皮飲片的質量，并在現有的歸芪通脈合劑質量標準中增加芍藥苷、甘草酸銨、甘草苷和蕓香柚皮苷的含量測定項。

由于歸芪通脈合劑的化學成分復雜，且部分紫外吸收較弱的化合物（如黃芪甲苷）難以通過二極管陣列檢測器進行測定[19]，因此在后續研究中，可在分離純化的基礎上結合質譜和核磁共振等技術確認未知成分的結構，使用多種技術手段對樣品中的化學成分進行更為全面的分析。

綜上所述，本研究建立了歸芪通脈合劑的HPLC 指紋圖譜，結合化學模式識別分析可用于評價歸芪通脈合劑的整體質量；蕓香柚皮苷等6個成分是影響該制劑質量的差異標志物。