仙靈骨葆藥渣與刺梨渣共同堆肥對白菜揮發(fā)性物質(zhì)的影響

張 琳， 謝 姣， 郭婭婭， 張 巍， 劉 錫

(貴州農(nóng)業(yè)職業(yè)學院， 貴陽 551400)

白菜(Brassicacampestrisssp.chinensis Makino)是一種多葉蔬菜，屬于十字花科蕓薹屬蕓薹種白菜亞種的一個變種[1-2]。鮮菜中含有蛋白質(zhì)、碳水化合物、纖維素、維生素和礦物質(zhì)，營養(yǎng)豐富，在國內(nèi)外普遍栽培[3-4]。白菜受廣大消費者青睞的重要原因是其具有獨特甜味、口感以及豐富的礦物質(zhì)和維生素[5]。

中藥渣是中藥提取后的副產(chǎn)物，中國不同制藥企業(yè)每年的中藥渣產(chǎn)量約為3 500萬t[6]。然而，中藥渣被視為工業(yè)廢物，主要通過堆放、掩埋或焚燒的方式丟棄[8]，或者通過高能耗的熱裂解或氣化等方式將中藥渣轉(zhuǎn)變?yōu)槿剂蠚鈁7]，不僅造成環(huán)境污染，還造成資源浪費。仙靈骨葆藥渣是國藥集團同濟堂(貴州)制藥有限公司的拳頭產(chǎn)品“仙靈骨葆膠囊”的中藥副產(chǎn)物，每年排放量巨大。刺梨為薔薇科多年生落葉灌木繅絲花的果實，又稱送春歸、刺莓果、茨梨、木梨子，是一種稀有的果實，是滋補健身的營養(yǎng)珍果[9]。在我國貴州、陜西、甘肅、江西、福建、廣西、湖北、四川、云南等地均有分布[10]，在種植規(guī)模上，2020年僅貴州省刺梨種植面積約達13.3 hm2，鮮果產(chǎn)量達10萬t。目前，對刺梨的提取利用主要是通過物理榨汁，刺梨果渣是刺梨經(jīng)物理榨汁后產(chǎn)生的廢棄物，一般榨汁后直接丟棄，沒有得到高效利用[11]。目前有機肥施用后對蔬菜的揮發(fā)性物質(zhì)研究較少，鑒于此，本研究采用仙靈骨葆藥渣與刺梨果渣共同堆肥獲得(命名為YC)作為白菜栽培的基肥，研究施用后對白菜中揮發(fā)性物質(zhì)的影響，為進一步利用仙靈骨葆藥渣與刺梨果渣制備有機肥提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1試驗材料

供試白菜種子購買于河北金盛優(yōu)品農(nóng)業(yè)科技有限公司。仙靈骨葆藥渣為國藥集團同濟堂(貴州)制藥有限公司提供，刺梨果渣由貴州貴定敏子食品有限公司提供。兩者共同堆肥腐熟后的有機肥(YC)理化性狀為: 有機質(zhì)、氮、P2O5、K2O含量分別為48.1%、1.62%、2.61%、0.60%，總孔隙度51.2%，容重0.503 g/cm3，pH值5.85，電導率(EC值)5.73 mS/cm；供試土壤采自大田。

1.1.2儀 器

HP 6890/5975 CGC/MS聯(lián)用儀(美國安捷倫公司)，色譜柱為AgilentHP-FFAP(30 m×0.25 mm×0.25 μm)彈性石英毛細管柱。

1.2 方 法

1.2.1實驗設計

試驗設2個處理，其中一個為對照(CT)，另一個為施YC組(G)，施量為風干土質(zhì)量的1%，每個處理重復 4次，每個重復10株。每盆裝入風干過篩后的土壤1.5 kg，每盆中植放入3粒白菜種子。在試驗期間，每天按時澆水，澆水量150 mL/盆，天氣炎熱時適當增加水量，此外，定期處理雜草，以保持白菜的正常生長。待白菜生長70 d，每個重復取具有代表性白菜3株，用于氣相色譜-質(zhì)譜分析。

1.2.2GC-MS條件[12]

色譜條件：載氣為高純He(99.999%)；柱前壓7.06 psi，載氣流量1.0 mL/min，不分流，溶劑延遲時間：1 min。程序升溫：初始溫度40 ℃(保留2 min)，以3 ℃/min升溫至160 ℃，再以6 ℃/min升溫至220 ℃，運行時間：52 min；汽化室溫度230 ℃。質(zhì)譜條件：離子源為EI源；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子能量70 eV；發(fā)射電流34.6 μA；倍增器電壓2 365 V；接口溫度240 ℃；質(zhì)量范圍29～500 amu。

1.2.3樣品提取[13]

將3株白菜樣品混勻后搗碎，取3.0 g置于25 mL固相微萃取儀采樣瓶中，插入裝有2 cm～50/30 μm DVB/CAR/PDMSStableFlex纖維頭的手動進樣器，在65 ℃的平板加熱條件下頂空萃取60 min后，移出萃取頭并立即插入氣相色譜儀進樣口(溫度250 ℃)中，熱解析進樣。

1.2.4分析方法

定性分析：對總離子流圖中的各峰經(jīng)質(zhì)譜計算機數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索及核對Nist 17和Wiley 275標準質(zhì)譜圖，確定白菜揮發(fā)性物質(zhì)的化學成分；定量分析：用峰面積歸一化法測定了各化學成分的相對質(zhì)量分數(shù)[14]。為了進一步分析兩組白菜揮發(fā)性物質(zhì)的差，用微生態(tài)生科云平臺(https://www.bioincloud.tech)中的軟件包對兩組白菜中的揮發(fā)性物質(zhì)進行主成分分析(PCA)與正交偏最小二乘法(OPLS-DA)分析，PCA分析是通過降維將多個指標轉(zhuǎn)化為少數(shù)指標，經(jīng)過降維處理后，消除多個指標間的相關性，使彼此之間具有獨立性[15]；OPLS-DA是在偏最小二乘判(PLS-DA)基礎上發(fā)展的一種處理高維數(shù)據(jù)的判別分析算法。根據(jù)OPLS-DA模型，計算各代謝物VIP得分和p值(VIP>1，p<0.05)，得到差異代謝物。

2 結(jié) 果

2.1 揮發(fā)性物質(zhì)測定結(jié)果

兩組白菜中共篩選出66個化合物(見表1)，能夠相對定性的化合物有49種，分別為醇類12種、醛類5種、酮類4種、烴類10種、酯類8種，雜環(huán)類4種、芳香類4種、酸類1種、醚類1種，未定性17種。

表1 揮發(fā)性物質(zhì)含量

揮發(fā)性物質(zhì)在蔬菜口感上扮演著特定角色，從圖1可知，白菜中主要含醇類、酯類、烴類、醛類、酮類、酸類、醚類、芳香類及雜環(huán)類。其中醇類物質(zhì)含量最高，樣品G 1、G 2、G 3、G、CT 1、CT 2、CT 3、CT 4醇類含量分別為74.47%、80.17%、72.99%、71.67%、55.54%、53.46%、58.88%、61.25%。

圖1 揮發(fā)性物質(zhì)百分比堆積柱形圖

2.2 揮發(fā)性物質(zhì)的多變量分析

PCA分析是將多維數(shù)據(jù)進行有效的降維，用于研究的多元統(tǒng)計分析方法。如圖2所示，無監(jiān)督的PCA圖顯示兩個主成分的貢獻率達到62.71%(PC 1，42.18%；PC 2，20.53%)，PCA得分圖的重疊程度反映了樣本代謝物的相近程度，從圖2可知，對照組和實驗組中的代謝物很好分離，說明YC對白菜中代揮發(fā)性物質(zhì)影響較大。進一步采用OPLS-DA分析發(fā)現(xiàn)，OPLS-DA曲線也顯示出類似的趨勢(圖3)。

圖2 兩組白菜揮發(fā)性物質(zhì)主成分分析(PCA)

圖3 兩組白菜揮發(fā)性物質(zhì)的OPLS-DA圖

為了更好比較YC對白菜中揮發(fā)性物質(zhì)的變化，對白菜中含量排名前20揮發(fā)性物質(zhì)的相對含量做出熱圖(圖4)。通過比較熱圖顏色強度變化可以明顯地看到不同代揮發(fā)性物質(zhì)含量明顯變化。圖4中接近紅色表示代謝物含量上調(diào)，接近綠色表示代謝物含量下調(diào)，施用YC后，白菜中代謝物T 12、T 17、T 15、T 20、T 27、T 19含量上調(diào)，上調(diào)的代謝物中除了T 27為烴類物質(zhì)外，其他幾個代謝物均為醇類物質(zhì)。

圖4 白菜中含量排名前20的代謝物熱圖

根據(jù)OPLS-DA數(shù)據(jù)計算所有檢測到的代謝物的VIP得分和p值(VIP>1，p<0.05)，如圖5所示。CT組與G組中差異揮發(fā)性物質(zhì)有15種，分別為T 1、T 7、T 10、T 11、T 17、T 22、T 23、T 36、T 42、T 44、T 45、T 46、T 48、T 57、T 64，即2-己烯醛、6,10-二甲基,-5,9-十一碳二烯-2-酮、甲硫醇、乙醇、1-正己醇、1-壬醇、1,4-戊二烯、硫氰酸甲酯、3-己烯甲基丁酸酯、甲氧基苯肟、1，3-二甲基苯、苯丙氰、己-3-烯基-2-甲基-2-烯酸、T 57、T 64。

圖5 差異代謝物重要性圖

3 結(jié)論與討論

揮發(fā)性化合物對最終香氣的影響取決于其在食品原料中的相對濃度和化合物的氣味閾值，如果揮發(fā)性化合物的濃度大于其氣味閾值，那么它將被認為是最終香氣的貢獻者[16-17]。根據(jù)報道，蔬菜的揮發(fā)性物質(zhì)很多，主要為醇類、醛類、酮類、酸類、酯類等，且因作物品種、環(huán)境因素、成熟度、加工方法等因素不同，揮發(fā)性成分含量也產(chǎn)生差異[18-20]。醇類和酯類常作為主香劑和輔助劑使用，是一種廣泛使用的香料[21]，本試驗的測定結(jié)果為醇類含量最高，其中以3-己烯-1-醇為主，酯類含量其次，所以醇類和酯類可能對白菜風味具有重要貢獻，吳春燕等[1]也發(fā)現(xiàn)，3-己烯-1-醇為白菜主要的風味物質(zhì)之一，與本研究結(jié)果一致。但吳春燕等[1]發(fā)現(xiàn)，白菜中醛類相對含量最高，約占30%，與本研究結(jié)果差異較大，這可能與白菜品種、成熟度、生長環(huán)境等不同有關。

施用YC后，白菜中醇類物質(zhì)含量表現(xiàn)上調(diào)趨勢，但沒有檢測到2-己烯醛、6,10-二甲基,5,9-十一碳二烯-2-酮、3,3-二甲基-環(huán)丁烯、二甲基二硫化物、甲氧基苯肟等物質(zhì)，推測可能是YC通過調(diào)節(jié)白菜香味物質(zhì)合成途徑中關鍵酶活性以及關鍵酶基因表達，從而影響白菜中揮發(fā)性物質(zhì)的合成。

筆者對施用YC后白菜的揮發(fā)性成分進行了初步研究，結(jié)果表明，相同品種在相同采收期和相同測定條件下，施用YC后對白菜揮發(fā)性成分有較大影響。在PCA及OPLS-DA模型中將兩組白菜揮發(fā)性物質(zhì)分為兩類，進一步基于OPLS-DA模型獲取了兩組間的差異性揮發(fā)性物質(zhì)，從總的揮發(fā)性物質(zhì)中篩選出15種差異物質(zhì)(VIP>1，p<0.05)，分別為2-己烯醛、6,10-二甲基,-5,9-十一碳二烯-2-酮、甲硫醇、乙醇、1-正己醇、1-壬醇、1,4-戊二烯、硫氰酸甲酯、3-己烯甲基丁酸酯、甲氧基苯肟、1，3-二甲基苯、苯丙氰、己-3-烯基-2-甲基-2-烯酸、T 57、T 64。

研究仙靈骨葆藥渣與刺梨渣共同堆肥用于白菜栽培提供了一定的參考數(shù)據(jù)。但關于其中的影響揮發(fā)性差異變化的關鍵基因以及關鍵酶活性未做相應的研究。因此，在后續(xù)研究中應當對揮發(fā)性物質(zhì)的調(diào)節(jié)機制進行分析，為挖掘白菜香氣基因資源、栽培高品質(zhì)白菜提供理論基礎。