莖尖脫毒技術的優化研究
——以草莓、丹參、魔芋為例

韋獻雅， 謝尚春， 歐陽麗瑩， 潘 霞

(成都農業科技職業學院， 四川 成都 611130)

莖尖脫毒技術是無性繁殖作物提純復壯的主要技術手段，其原理是病毒在植物體內分布不均一，越接近生長點(0.1～1.5 mm區域)，病毒濃度越稀。因此，有可能采用小的莖尖離體培養而脫除植物病毒。傳統莖尖脫毒的主要流程是：在大田中采回要脫毒作物的芽(1～2 cm)，常規消毒，在超凈工作臺上把莖芽置于解剖鏡下(8～40倍)，用解剖針將葉片和葉原基剝掉,用解剖刀片將分生組織切下來，然后將其接種到培養基上，將接種好的莖尖置于25 ℃左右的溫度下，每天在 2 000～3 000 lx的光照條件下培養16 h，3～6個月形成再生苗，進行病毒檢測，不帶毒的再生苗即為脫毒苗[1]。

無性繁殖作物草莓、丹參、魔芋、藍莓、馬鈴薯等種植面積大、經濟效益高，是扶貧和農業產業結構調整的主導作物，優質脫毒種苗種薯的應用與推廣對產業發展至關重要。

目前這些作物面臨病毒病種類多、危害嚴重、種性退化快、種苗(薯)質量差等問題。常規莖尖脫毒技術效率低，脫毒不徹底，因此需要對莖尖脫毒技術進行優化，形成高效的莖尖脫毒技術。本研究優化了草莓、丹參和魔芋的莖尖脫毒技術，為無性繁殖特色作物產業發展升級提供技術支撐。

1 材料和方法

1.1 供試材料

草莓匍匐莖、丹參活體植株、魔芋萌芽的塊莖。

1.2 實驗方法

1.2.1優株熱處理莖尖脫毒技術(以草莓為例)

優株熱處理莖尖脫毒技術流程[2-3]：

1)選材并熱處理：選用生產上主栽優良品種的優良草莓單株，選擇果形好、分蘗強、產量高、抗性好的植株作莖尖剝離材料。放置在光照培養箱中長光照高溫熱處理培育一周(36～38 ℃，16 h光照；8 h黑暗，30～32 ℃)(圖1)。

圖1 草莓優株熱處理

2)培養基制備：培養基使用MS+6-BA 0.5 mg/L+ NAA0.05 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L，pH 5.8，熬制好后分裝入瓶。

3)滅菌：在0.12 MPa/cm2壓力下滅菌20～23 min，冷卻備用。

4)莖尖剝離接種：將入選材料(草莓匍匐莖芽尖)放入紗布袋，放1～2滴洗潔精，用自來水沖洗1 h，倒掉水在超凈工作臺用75%酒精中浸20～30 s，再用2%次氯酸鈉溶液消毒10～15 min，取出用無菌水沖洗3～5次，用滅菌濾紙吸干材料表面水分，在體視解剖鏡下用手術刀等工具輕、準、快速地剝去幼葉(圖2)，切取帶2～4個葉原基(1.0～1.5 mm)的生長點，放入培養基的培養瓶中，每瓶放1個生長點。注明品種，莖尖號，接種日期。

圖2 草莓優株熱處理莖尖剝離

5)培養條件：日溫21～25 ℃，夜溫15～18 ℃，光照時數12～14 h/d，光照強度2 000～3 000 lx。

6)病毒檢測：酶聯免疫法，主要檢測草莓斑駁病SMOV、草莓鑲脈病毒SVBV、草莓皺縮病毒SCRV、草莓輕型黃邊病毒SMYEV，合格的脫毒苗用于繼代培養。

脫毒再生苗生根移栽，繁育脫毒種苗，將脫毒種苗栽種大田繁育果實，同時種植傳統繁育的種苗繁育果實，記錄數據進行分析。

1.2.2二次剝離莖尖脫毒技術(以丹參為例)

二次莖尖剝離脫毒技術流程[4-6]：

1)選材和第一次莖尖培養：選用生產上主栽品種丹參的優良單株(產量高、藥效含量高、抗性好)作莖尖剝離材料。

2)培養基的制備：培養基使用MS +蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L，pH=5.8，熬制好后分裝入管瓶。

3)滅菌：在0.12 MPa/cm2壓力下滅菌20～23 min，冷卻備用。

4)莖尖剝離接種：將1～2 cm的芽尖放入紗布袋，放入1～2滴洗潔精，用自來水沖洗1 h后，倒掉水拿到超凈工作臺在75%酒精中浸20～30 s，再用2%次氯酸鈉溶液消毒10～15 min，取出用無菌水沖洗3～5次，用滅菌濾紙吸干材料表面水分，接種在培養基上培養。

5)丹參組培苗長到3～4 cm，在超凈工作臺中用體視解剖鏡、手術刀等工具輕、準、快速地剝去幼葉，切取帶1～2個葉原基(0.2～0.5 mm)的生長點(圖3)，放入培養基的試管或培養瓶中，每管(瓶)放1個生長點。注明品種，莖尖號，接種日期。統計成活率。

圖3 丹參二次莖尖剝離

6)培養條件：日溫21～25 ℃，夜溫15～18 ℃，光照時數12～14 h/d，光照強度2 000～3 000 lx。

7)病毒檢測方法：直接觀察法，由于目前丹參還沒有試劑盒能檢測病毒，篩選的方法采用優株正向選擇，淘汰帶有病毒病癥的劣株。因此剝離莖尖時一定要剝離0.2～0.5 mm，脫毒效果在實驗室階段通過組培苗的健康程度判斷篩選，栽種后通過田間農藝性狀判斷脫毒效果進行篩選。

1.2.3抗褐化莖尖脫毒技術(以魔芋為例)

抗褐化莖尖脫毒技術流程[7-8]：

1)選材：選用優良塊莖(個頭大、無病害、外觀漂亮)作莖尖剝離材料。

2)培養基的制備：培養基使用MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L，pH=5.8，培養基中分別加入1%檸檬酸、0.3%活性炭、1%抗壞血酸、0.01 PVP，熬制好后分裝入瓶。同時配制500 mL 1%檸檬酸同時滅菌。

3)滅菌：在0.12 MPa/cm2壓力下滅菌20～23 min，冷卻備用。

4)莖尖剝離接種：將入選材料放入紗布袋，用自來水沖洗1 h后，倒掉水拿到超凈工作臺在75%酒精中浸20～30 s，再用0.1%升汞液消毒6～8 min(或用2%次氯酸鈉溶液消毒10～15 min)，取出用無菌水沖洗3～5次，用滅菌濾紙吸干材料表面水分，在體視解剖鏡下用手術刀等工具輕、準、快速地剝去外層鱗片，切取帶1～2個葉原基(0.2～0.5 mm)的生長點，放入培養基的培養瓶中，每瓶放1個生長點。注明品種、莖尖號、接種日期。

5)培養條件：日溫21～25 ℃，夜溫15～18 ℃，光照時數14 h/d，光照強度3 000 lx。

6)病毒檢測：直接觀察法。由于目前魔芋還沒有試劑盒能檢測病毒，因此剝離莖尖時一定要剝離0.2～0.5 mm，實驗室階段通過組培苗的健康程度做出判斷，栽種后通過田間農藝性狀判斷脫毒效果。

2 結果與分析

2.1 草莓優株熱處理莖尖剝離技術

利用草莓優株熱處理莖尖脫毒技術在脫毒成功率、脫毒植株基因完整性、脫毒苗后代的表現等方面都優于傳統常規脫毒技術，剝離莖尖1.0～1.5 mm時，新技術脫毒成功率為83%，傳統方法的脫毒成功率為50%左右，可見新方法在鈍化病毒、提高脫毒成功率上有著重要作用(表1)。通過剝離不同莖尖大小，熱處理后1.0～1.5 mm，傳統方法0.2～0.5 mm，結果發現莖尖1.0～1.5 mm剝離莖尖后代變異率只有3.3%，而傳統莖尖剝離變異率為33%，由此可見，由于草莓作物本身的特性，需要結合熱處理剝離1.0～1.5 mm以上莖尖能有效保證品種特性(表2，圖4,圖5)。

表1 莖尖脫毒成功率比較

表2 脫毒植株基因完整性比較

圖4 草莓脫毒組培苗

圖5 草莓脫毒移栽苗

2.2 丹參二次剝離莖尖脫毒技術

丹參組培苗由于品種本身的原因玻璃化非常嚴重，直接用野外材料消毒進行莖尖脫毒，莖尖很容易直接玻璃化。與其他作物比如馬鈴薯、草莓等不同，丹參莖尖外沒有葉片包裹，裸露的莖尖直接接觸消毒液，很容易被消毒液傷害，剝離下來的莖尖成活率只有10%，而先用較大的莖尖或者葉片獲得組培苗后再用無菌組培苗進行二次剝離，莖尖成活率85%以上(表3)，莖尖成活率增加7倍。

表3 不同剝離技術莖尖成活率比較

2.3 魔芋抗褐化莖尖脫毒技術

從表4可以看出，4種抗褐化藥劑1%檸檬酸效果最佳，褐化率為20%，其次是0.3%活性炭、1%抗壞血酸、0.01% PVP，褐化指數也是檸檬酸最低，褐化指數越低，成苗速度越快。因此1%檸檬酸在魔芋莖尖脫毒抗褐化上有著明顯效果。從表5可以看出，莖尖剝離過程全程浸泡在無菌1%檸檬酸溶液中，抗褐化效果有明顯增加，抗褐化率降低4倍，為5%(圖7,圖8)。

表4 4種抗褐化藥劑對魔芋莖尖抗褐化效果的影響(常規剝離)

圖6 丹參脫毒組培苗

表5 2種不同莖尖剝離方法對莖尖抗褐化效果的影響

圖7 魔芋脫毒組培苗

圖8 魔芋脫毒組培生根苗

3 討 論

植物莖尖脫毒技術在無性繁殖作物提純復壯中效果明顯，但是傳統莖尖脫毒技術在某些作物脫毒后再生苗變異率高、莖尖玻璃化、莖尖褐化等存在技術缺陷。針對四川特色作物莖尖脫毒關鍵技術缺乏自主性和特色，行業標準不健全，雖然引進國外莖尖脫毒技術，但是沒有結合四川省生產、生態特點和特色作物品種實際條件，很好地消化吸收利用和再創新，未能形成具有自主知識產權和適應四川特色作物的簡化高效精準脫毒核心技術，脫毒繁育技術效率低、繁殖慢、數量少、成本高、推廣難，急需解決。

在優良品種群體中，選擇優良單株，放置在光照培養箱中進行長光照高溫熱處理培育一周，結合光溫熱處理使草莓莖尖在病毒鈍化條件下莖尖頂部體積培育增大，莖尖剝離時盡量剝最大莖尖部分(1.0～1.5 mm)，比傳統莖尖剝離方法長度增加兩倍以上，脫毒后保證草莓優良品種典型的生物學特性，獲得遺傳基礎一致的優良后代，提高草莓商品品質和效益[9]。

四川省中藥材傳統種植長期采用藥農自留種，種性混雜退化嚴重，產量和品質都受到很大影響。由于采用傳統方法培育的丹參組培苗玻璃化程度高，如果像其他作物一樣直接選用野外材料進行莖尖脫毒，莖尖會直接玻璃化，不能獲得有效脫毒植株，因此在丹參種苗繁育上應用脫毒技術必須首先解決莖尖玻璃化的難題。同時，在丹參莖尖脫毒技術規程和培養基配方等方面都需要結合特色作物生產實踐探索創新。針對丹參莖尖玻璃化的難題，創新了丹參二次剝離莖尖脫毒新技術。其技術關鍵是：在丹參大田種植群體中選擇壯苗優株，第一次進行芽尖(1～2 cm)剝離，開展離體培育獲得無菌組培苗，再從中選擇優良組培苗進行莖尖剝離(0.2～0.5 mm)脫毒，在專設培養基中開展組織培養，大量擴繁優質脫毒苗。新方法能有效獲得脫毒植株，提高莖尖成活率，增加脫毒效果。

褐化是魔芋莖尖脫毒成活率低的主要問題，以前研究者對魔芋抗褐化做了大量研究[10]，但主要集中在常規抗褐化劑(活性炭、抗壞血酸、PVP等)上，剝離方法也是使用原有在空氣中剝離，本實驗使用了抗褐化劑1%檸檬酸并且將莖尖浸泡在1%檸檬酸溶液中進行剝離的新方法，能很好解決褐化問題。研究表明，檸檬酸在抗褐化上效果明顯,這與檸檬酸本身的理化性質有關。