響應面優化微波-壓熱法制備馬蹄抗性淀粉的工藝研究

劉云芬，郭珍紅，殷菲朧，廖玲燕，宋慕波，帥良*

（1.賀州學院食品與生物工程學院/食品科學與工程技術研究院，廣西 賀州 542899；2.賀州學院廣西康養食品科學與技術重點實驗室，廣西 賀州 542899）

抗性淀粉（resistance starch，RS）是指在健康個體小腸中不能被消化吸收的淀粉及其降解物，但能在大腸中進行發酵從而生成短鏈脂肪酸，具有類似膳食纖維的功能[1-2]。研究表明抗性淀粉對人體生理功能起到獨特的作用，尤其是對人體腸道菌群有重要的調節作用[2]，同時對結腸癌、低血糖癥、膽結石形成有較好的預防作用[3-4]。國內外越來越多的研究人員已經著手于抗性淀粉的形成機理研究，為開發抗性淀粉的制備方法提供了較好的理論基礎?？剐缘矸劭煞譃?類：物理包埋淀粉（RS1）、抗性淀粉（RS2）、回生淀粉（RS3）、化學改性孔洞（RS4）和直鏈淀粉-脂質復合物（RS5）[5-8]。其中抗性淀粉RS1和RS2屬天然抗性淀粉，而RS3在物理、營養及加工性能方面具有較好的穩定性，因此成為研究熱點[6]。目前抗性淀粉的制備原料有豇豆[9]、綠豆[10]、玉米[11-12]、山藥[13]、大米[14-15]、馬鈴薯[16]、黑青稞等[17]，但在以馬蹄為原料的抗性淀粉制備中未出現相關研究。抗性淀粉多采用壓熱法[17]、酶解法[18]、微波法[19]、超聲波－微波－酶解法[14]、濕熱法[10]等方法進行制備。其中壓熱法是制備RS3的常見方法，通過高壓高溫作用使淀粉乳完全糊化，再通過低溫回生，形成有序晶體結構的抗性淀粉[20-21]，此方法簡單易操作、無污染，抗性淀粉具有明顯的凹陷空洞和蜂窩狀結構，直鏈淀粉含量增加[22]，能更有效地促進抗性淀粉的形成[23-24]。同時微波處理能夠促進淀粉顆粒的溶解、糊化，提高RS得率[24]。

馬蹄[Eleocharis dulcis（Burm.f.）Trin]，屬于莎草科馬蹄屬水生植物。馬蹄因其肉質細嫩多汁，富含豐富的碳水化合物、蛋白質、礦物質及酚類等抗菌物質，既可作為果蔬鮮食，又能入藥而深受大眾喜愛，具有廣闊的應用前景[25-27]。馬蹄除鮮食外，還可煮食，并加工成各種產品，有馬蹄粉、馬蹄糕、馬蹄罐頭、馬蹄飲料、馬蹄果醋等。但其深加工程度低，附加值少，因此，研究馬蹄抗性淀粉的制備工藝，對促進馬蹄的深加工和提高其附加價值，提升其綜合利用程度具有很重要的意義。

本試驗采用微波－壓熱法制備馬蹄抗性淀粉，使微波法、壓熱法的優點得到良好結合，并利用響應面試驗進行工藝優化，以期得到最高抗性淀粉得率的方案，為制備馬蹄抗性淀粉產品及其進一步應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬蹄精制淀粉：韶關粵北天然土特產生產基地；耐高溫 α-淀粉酶（20 000 U/mL）、糖化酶（100 000 U/g）：上海源葉生物科技有限公司；檸檬酸、無水乙醇（均為分析純）：天津市致遠化學試劑有限公司；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀（均為分析純）：西隴化工股份有限公司。

1.2 儀器與設備

DHG-9140A電熱恒溫鼓風干燥箱：上海齊欣科學儀器有限公司；JJ224BF電子天平：常熟市雙杰測試儀器廠；G70F-20CN1L-DG（BO）微波爐：廣東格蘭仕微波生活電器制造有限公司；SH2-82A水浴恒溫振蕩器：江蘇金怡儀器科技有限公司；A11 basic實驗室分析研磨機：德國艾卡公司；Gentrifuge 5804 Eppendorf離心機：德國eppendorf公司；FE28-standard梅特勒臺式pH計：德國METTLER TOLEDO公司；SQ510C蒸汽滅菌鍋：重慶雅馬拓科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 馬蹄抗性淀粉的制備

馬蹄抗性淀粉的制備參考劉敏等[16]的方法，略有改動。將馬蹄精制淀粉配制成不同質量分數的淀粉乳，用玻璃棒攪拌均勻后，采用不同的微波時間進行預處理，然后在壓力蒸汽滅菌鍋121℃下熱處理40 min，冷卻至室溫25℃后，在4℃下老化不同的時間后95℃下干燥36 h，用研磨機進行粉碎并過80目篩，得到馬蹄抗性淀粉粗提物。

1.3.2 馬蹄抗性淀粉純化

稱取一定量馬蹄抗性淀粉粗提物于離心管中，按1∶12.5（g/mL）加入pH6的磷酸緩沖液，振蕩均勻后，吸取0.2 mL 20 000 U/mL的耐高溫α-淀粉酶溶液，然后置于95℃的水浴恒溫振蕩器中水浴2 h，取出后冷卻至25℃，用4mol/L檸檬酸溶液調節pH值為4.6～4.8，加入1 mL 100 U/mL的糖化酶溶液（稱取1 g 100 000 U/g的糖化酶溶于水中，定容至1 L），于60℃的水浴恒溫振蕩器中水浴1.5 h，取出后冷卻到25℃，5 000 r/min離心5min，倒出上清液，分別用95%、85%、75%的乙醇溶液洗滌沉淀數次，把沉淀置于濾紙上，恒溫干燥箱中50℃烘干至恒重后稱量，得到馬蹄抗性淀粉[28]，并進行結構表征的測定。

1.3.3 單因素試驗設計

1.3.3.1 淀粉乳濃度對馬蹄抗性淀粉得率的影響

固定保持壓熱溫度121℃、壓熱時間40 min、微波時間40s、老化溫度4℃、老化時間12h，選擇5%、10%、15%、20%、25%5種不同的淀粉乳濃度，考察不同淀粉乳濃度對馬蹄抗性淀粉得率的影響。

1.3.3.2 老化時間對馬蹄抗性淀粉得率的影響

固定保持壓熱溫度121℃、壓熱時間40 min、微波時間40 s、老化溫度4℃、淀粉乳濃度15%，選擇0、12、24、36、48 h 5個不同的老化時間，考察不同老化時間對馬蹄抗性淀粉得率的影響。

1.3.3.3 微波時間對馬蹄抗性淀粉得率的影響

固定保持壓熱溫度121℃、壓熱時間40 min、老化溫度4℃、老化時間12 h、淀粉乳濃度20%，選擇20、40、60、80、100、120 s 6 個不同的微波時間，考察不同微波時間對馬蹄抗性淀粉得率的影響。

1.3.3.4 老化溫度對馬蹄抗性淀粉得率的影響

固定保持壓熱溫度121℃、壓熱時間40 min、老化時間12 h、淀粉乳濃度20%、微波時間 40 s，選擇 4、20、40、60℃4個不同的老化溫度，考察不同老化溫度對馬蹄抗性淀粉得率的影響。

1.3.4 響應面優化試驗設計

以Box－Behnken試驗設計原理為參考，根據單因素試驗得出的試驗結果，最終選擇淀粉乳濃度、老化時間、微波時間作為自變量，抗性淀粉得率為響應值，設計三因素三水平的響應面試驗，優化馬蹄抗性淀粉微波－壓熱法制備的條件。因素水平及編碼設計見表1。

表1 響應面因素及水平設計Table 1 Factors and levels of response surface design

1.4 理化指標測定

1.4.1 持水性

分別稱取馬蹄抗性淀粉和馬蹄淀粉1 g，置于恒質量m0的離心管中，加入10mL去離子水充分溶解，80℃水浴加熱30 min，冷卻到25℃后，13 000 r/min離心10 min，去掉上清液，稱量離心管和沉淀質量，記為m1[29]。持水性的計算公式如下。

式中：m0為離心管的質量，g；m1為離心管和沉淀總質量，g。

1.4.2 溶解度和膨潤度

分別稱取1 g馬蹄淀粉和抗性淀粉，用10 mL蒸餾水溶解，轉移到恒質量m0離心管中，于95℃下加熱30 min，冷卻到 25℃，3 000 r/min離心 10 min，倒出上清液于錐形瓶中，在110℃烘干到恒質量并稱量為m1，并稱量離心管及沉淀物總質量m2，溶解度及膨潤度的計算公式如下[30]。

式中：m0為離心管質量，g；m1為干燥后質量，g；m2為離心管及沉淀物總質量，g。

1.4.3 凍融穩定性

取1 g樣品放入恒質量m0的離心管中，加入蒸餾水，調配成6%的淀粉乳溶液，記錄質量為m1，沸水浴加熱25 min，取出冷卻至25℃，在-20℃下冷凍24 h后取出自然解凍，5 000 r/min離心15 min，倒掉上清液，稱量離心管和沉淀物總質量m2，析水率計算公式如下[30]。析水率與凍融穩定性為反比關系[31]。

1.5 馬蹄抗性淀粉掃描電鏡和紅外光譜分析

掃描電鏡分析參考石海信等[32]的方法，放大2000倍進行觀察。紅外光譜分析參考吳小婷[33]的方法，掃描條件：以空樣品槽（空氣）為背景，掃描次數32，分辨率4.0。

1.6 數據分析

數據結果均以平均值±標準差表示，每個處理設置3個重復。采用SPSS 20軟件進行數據統計分析，用Excel和Origin作圖。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 淀粉乳濃度對馬蹄抗性淀粉得率的影響

淀粉乳濃度對馬蹄抗性淀粉得率的影響見圖1。

圖1 淀粉乳濃度對馬蹄抗性淀粉得率的影響Fig.1 Effect of starch milk concentration on resistant starch from water chestnut yield

由圖1可知，抗性淀粉得率隨著淀粉乳濃度的增加呈現先上升后下降的趨勢，在20%時達到最大值，隨后得率略有下降。結果表明，淀粉乳濃度過高或者過低都不利于抗性淀粉的獲得。當淀粉乳的濃度較低時，淀粉分子離散程度大，接觸距離變大，接觸的概率變小，不易形成有序的結晶序列，從而影響馬蹄抗性淀粉的生成[34]。當淀粉乳濃度較高時，水分較少，黏度增大，不利于分子流動，也不利于淀粉充分糊化，影響到分子的重排列和結晶[35-36]。因此，制備馬蹄抗性淀粉的最佳淀粉乳濃度為20%。

2.1.2 老化時間對馬蹄抗性淀粉得率的影響

老化時間對馬蹄抗性淀粉得率的影響見圖2。

圖2 老化時間對抗性淀粉得率的影響Fig.2 Effect of aging time on resistant starch from water chestnut yield

由圖2可知，在12 h內，馬蹄抗性淀粉得率快速增加，在老化時間為12 h時，馬蹄抗性淀粉得率達到最高，為6.77%，隨后得率下降。結果說明，老化時間過長或者過短，對馬蹄抗性淀粉得率均有不利的影響。淀粉糊化后要經歷分子自動取向、相互靠攏、結晶、重結晶這一系列過程從而形成抗性淀粉[37]。適當延伸老化時間有利于抗性淀粉得率的提高[38]，因此，制備馬蹄抗性淀粉的最佳老化時間為12 h。

2.1.3 微波時間對馬蹄抗性淀粉得率的影響

微波時間對抗性淀粉得率的影響見圖3。

圖3 微波時間對抗性淀粉得率的影響Fig.3 Effect of microwave time onresistant starch from water chestnut yield

由圖3可知，在微波時間為20 s～60 s時，馬蹄抗性淀粉得率呈上升的趨勢；在微波時間為60 s時，馬蹄抗性淀粉得率最高，為6.79%，繼續延長微波加熱時間，得率下降。原因可能是微波時間過短，不能完全破壞淀粉分子內部氫鍵，造成淀粉不能完全糊化，抗性淀粉重新組合少，結晶不完全，影響抗性淀粉的形成[16，39]；而微波時間過長，淀粉分子過度分解，產生大量短鏈分子，這些短鏈分子不利于老化過程中結晶的形成[40]。同時研究發現，微波時間過長，淀粉會降解成葡萄糖和低聚糖[31]，這些變化均不利于抗性淀粉的形成。因此，制備馬蹄抗性淀粉的最佳微波時間為60 s。

2.1.4 老化溫度對于馬蹄抗性淀粉得率的影響

老化溫度對抗性淀粉得率的影響見圖4。

圖4 老化溫度對抗性淀粉得率的影響Fig.4 Effect of aging temperature on resistant starch from water chestnut yield

由圖4可知，在4℃低溫條件下抗性淀粉得率最高，為6.96%。當老化溫度超過20℃時，抗性淀粉得率下降，且維持在較低水平。在老化過程中，低溫更容易促進直鏈淀粉分子的聚合[38]，加速淀粉中晶核和晶體的生長，過高的溫度則會造成淀粉分子不穩定，嚴重抑制晶體的生長。因此，馬蹄抗性淀粉的老化溫度選在4℃較為適宜。

2.2 響應面法優化馬蹄抗性淀粉制備工藝

2.2.1 響應面試驗結果與回歸方程分析

根據單因素試驗結果，用Design-Expert 8.0.6軟件隨機產生Box-Behnken設計試驗方案，對考察因素及其水平進行設計，并測得17次的試驗結果見表2。

表2 響應面試驗設計與結果Table 2 Response surface test design and results

統計軟件對表2數據進行多元回歸擬合，獲得馬蹄抗性淀粉得率（Y）對自變量（A淀粉乳濃度、B老化時間、C微波時間）的二次多項回歸模型方程為Y=17.28+0.83A+0.92B+0.78C+0.13AB－0.028AC－0.017BC－1.38A2－1.18B2－1.35C2。

響應面試驗方差分析見表3。

續表3 響應面試驗方差分析Continue table 3 Variance analysis of response surface test

由表3可知，響應面試驗設計的整體模型差異極顯著（P=0.000 7＜0.01），而失擬項差異不顯著（P=0.050 77＞0.05），表明二次回歸模型與實際情況吻合良好，可以預測制備馬蹄抗性淀粉的條件。根據表中F值可知，3種因素對馬蹄抗性淀粉得率的影響大小為B＞A＞C，即老化時間＞淀粉乳濃度＞微波時間。A、B、C、A2、B2、C2極顯著（P＜0.01）。

響應曲面坡度的陡峭程度反映著隨影響因素的變化，其對應響應值的變化情況。如果坡度相對平緩，表明響應值變化不明顯；如果坡度較陡，表明響應值對于處理條件的變化非常敏感；而等高線的情況則反映出2個因素交互作用的強弱，橢圓形表示2因素的交互作用顯著，圓形則相反[41-42]。響應面和等高線圖見圖5～圖7。

圖5 淀粉乳濃度與老化時間交互作用的響應面與等高線Fig.5 Response surface plot and contour plot of the interaction between starch milk concentration and aging time

圖6 淀粉乳濃度與微波時間交互作用的響應面與等高線Fig.6 Response surface plot and contour plot of the interaction between starch milk concentration and microwave time

圖7 老化時間與微波時間交互作用的響應面與等高線Fig.7 Response surface plot and contour plot of the interaction between aging time and microwave time

如圖5所示，淀粉乳濃度為15%～20%時，隨著老化時間的延長，抗性淀粉得率有所提高，但響應曲面坡度較為平緩。等高線趨近于圓形，表明淀粉乳濃度與老化時間的交互作用不顯著。

如圖6所示，隨著淀粉乳濃度的升高，抗性淀粉得率有所增加，響應面表面較為陡峭，表明淀粉乳濃度對抗性淀粉得率影響較大；而淀粉乳濃度為15%～20%時，微波時間越長，抗性淀粉得率也提高，但響應曲面變化不明顯。淀粉乳濃度與微波時間的交互作用不顯著。

如圖7所示，老化時間在0～20 h內，隨著微波時間的延長，抗性淀粉得率增加較為明顯；當微波時間超過20 h時，得率略有下降，但響應值變化不顯著。老化時間與微波時間的交互作用不顯著。

2.2.2 最佳工藝參數確定與驗證

采用Design－Expert 8.0.6軟件進行分析，得到馬蹄抗性淀粉制備的最佳工藝條件為淀粉乳濃度23.3%、微波時間74s、121℃下壓熱40 min、4℃下老化12.66 h，模型預測的馬蹄抗性淀粉最大預測得率為16.89%?？紤]到實際操作性，調整制備參數為淀粉乳濃度23%、微波時間74s、121℃下壓熱40min、4℃下老化 12 h，取 3次試驗數據的平均值，馬蹄抗性淀粉的得率為16.85%，相對誤差僅為0.23%，驗證響應面模型與實際情況得到良好擬合，其能有效指導制備工藝進行優化。

2.3 理化性質分析

馬蹄原淀粉與抗性淀粉理化性質比較結果見表4。

表4 馬蹄原淀粉與抗性淀粉的理化性質比較Table 4 Comparison of physicochemical properties of resistant starch and primary starch from waterchestnut

由表4可知，馬蹄抗性淀粉的持水性及析水率低于原淀粉，而溶解度和膨潤度優于原淀粉。其中馬蹄原淀粉持水性優于抗性淀粉可能是因為壓熱處理使原淀粉內部的淀粉分子短鏈增多，且馬蹄淀粉分子在糊化后重新聚集成有序結晶，結構致密，水分子不易進入，所以抗性淀粉持水性減弱[15，43]，更利于長時間保存。而馬蹄抗性淀粉的溶解度優于原淀粉，這是由于在抗性淀粉形成過程中，經過脫支化作用，直鏈淀粉從馬蹄淀粉顆粒中游離出來，且支鏈淀粉也在發生降解，使得馬蹄淀粉乳液中增加了直鏈淀粉含量；馬蹄抗性淀粉的膨潤度要優于原淀粉，這是由于馬蹄抗性淀粉經過高溫高壓作用，形成了致密的晶體結構，導致抗性淀粉溶解度較高，不容易吸水膨脹，析水率大反而凍融性較差[43]，而原淀粉析水率大于抗性淀粉，因此原淀粉的凍融穩定性要低于抗性淀粉。

2.4 馬蹄原淀粉與抗性淀粉的結構表征分析

馬蹄原淀粉與抗性淀粉的結構表征分析見圖8。

圖8 馬蹄原淀粉及抗性淀粉掃描電鏡照片（2 000×）Fig.8 Scanning electron microscope photographs of resistant starch and primary starchfrom water chestnut（2 000×）

由圖8可知，電鏡圖中馬蹄原淀粉表現為橢圓或者圓形顆粒狀，表面光滑完整，而抗性淀粉則呈平鋪狀，失去了原本的完整性。其變化原因可能是淀粉經過微波-壓熱處理后，受熱吸水，晶體裂解，從而使直鏈分子進行重排，失去了原本的完整形狀[44]。

圖9為馬蹄原淀粉與抗性淀粉紅外光譜掃描圖。

圖9 馬蹄原淀粉及抗性淀粉紅外光譜掃描圖Fig.9 Infrared spectrum of resistant starch and primary starch from water chestnut

由圖9可知，馬蹄原淀粉和抗性淀粉各主要特征峰基本重合，表明經過微波-壓熱處理制備的抗性淀粉沒有引入新的基團，微波-壓熱處理實為物理改性方法[44]。3 355.22、3 276.16 cm-1為分子間氫鍵 O-H 伸縮振動吸收峰，抗性淀粉在此處的吸收峰變得低而窄，分析可能因為微波-壓熱處理降解淀粉大分子鏈，改變分子間的氫鍵[33]。

3 結論

本研究以馬蹄淀粉為原料，采用微波-壓熱法制備馬蹄抗性淀粉，考察了淀粉乳濃度、微波時間、老化時間和老化溫度對抗性淀粉得率的影響，在此基礎上，通過響應面優化設計，得到最佳工藝條件為淀粉乳濃度23%，微波處理74 s，121℃下壓熱40 min，4℃下老化處理12h，在該工藝條件下，馬蹄抗性淀粉得率為16.85%，與預測值（16.89%）的相對誤差約為0.23%，表明試驗結果可靠。理化性質測定結果表明馬蹄抗性淀粉的溶解度、膨潤度、凍融穩定性均高于原淀粉，而持水性卻低于原淀粉。結構表征發現在電鏡圖中原淀粉顆粒表面光滑、完整；而抗性淀粉呈表面粗糙、片層狀；紅外光譜分析表明原淀粉和抗性淀粉紅外光譜圖基本重合，具有相似的主要特征吸收峰。試驗結果證明通過微波-壓熱法制備馬蹄抗性淀粉是可行的，該法不僅工藝簡單，且得率較高，為工業化生產提供了可靠的理論參考。