賓川葡萄籽原花青素的抗氧化活性研究及飲料制備

張麗明，汪楠，馬雅鴿，楊婧娟，張希，趙聲蘭

（云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南 昆明 650500）

葡萄（Vitis vinifera L.）是一種常見落葉木質(zhì)藤本植物葡萄科葡萄屬的果實(shí)，屬于漿果類水果，其色美、氣香、味道可口，是世界上產(chǎn)量較大的水果[1]之一。在我國，葡萄的種植歷史已有2 000多年，主要產(chǎn)區(qū)包括新疆、寧夏、河北和山東等地[2]。我國葡萄種植面積處于世界第5位，據(jù)報(bào)道每年葡萄產(chǎn)量超1 300萬噸，絕大多數(shù)的葡萄被用于釀酒，極少數(shù)被制作成葡萄干、果汁、餐桌水果[3-5]。云南省賓川縣處于干熱河谷地區(qū)，得天獨(dú)厚的地理環(huán)境使其成為了葡萄種植、栽培優(yōu)良的地區(qū)之一，擁有全國縣級最大葡萄生產(chǎn)基地。葡萄深加工過程中廢棄大量葡萄籽，但葡萄籽中富含有多酚類化合物、油脂、粗纖維等營養(yǎng)成分[1]。賓川葡萄籽資源豐富，多酚類物質(zhì)中原花青素的含量較高，極具開發(fā)價(jià)值。

近年來研究指出葡萄籽原花青素（grape seed proanthocyanidins，GSP）具有抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗氧化應(yīng)激、抗炎、抗腫瘤、抗衰老、降血壓、降血脂等功效[6]。目前，葡萄籽相關(guān)產(chǎn)品有國標(biāo)葡萄籽油、國標(biāo)葡萄籽提取物食品添加劑、葡萄籽粉、壓片糖果等普通食品，370多種保健食品及以葡萄籽粉、葡萄籽提取物、葡萄籽油等為原料的4 900多個(gè)已備案非特化妝品，已有相關(guān)藥品研究，但尚無相關(guān)藥品批文[7]。本文對云南大理賓川縣葡萄籽原花青素提取物進(jìn)行抗氧化活性研究，以該提取物為原料研發(fā)一款葡萄籽原花青素果汁飲料，以實(shí)現(xiàn)葡萄籽資源的充分利用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄籽：云南成滿生物科技有限公司；AB-8樹脂：天津南開化工廠；蘆薈、檸檬酸（食品級）：市售；白砂糖：云南康豐糖業(yè)（集團(tuán)）有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH）：上海源葉生物科技有限公司；2，2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]：北京索萊寶生物科技有限公司；過硫酸鉀：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；水楊酸：上海麥克林生化科技股份有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、冰醋酸：廣東省光華科技股份有限公司；三氯乙酸：天津市大茂化學(xué)試劑廠；抗壞血酸、鐵氰化鉀、三氯化鐵、過氧化氫：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑材料科技有限公司；所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

低速離心機(jī)（SC-3614）：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；紫外可見分光光度計(jì)（L5S）：尤尼克（上海）儀器有限公司；分析天平（GPZ14）：奧豪斯儀器（上海）有限公司；酶標(biāo)儀（INFINITE M200 PRO）：瑞士TECAN公司；打漿機(jī)（TM-767 III）：中山市海盤電器有限公司；高壓均質(zhì)機(jī)（SRH60-70）：上海申鹿均質(zhì)機(jī)有限公司。

1.3 葡萄籽原花青素的提取純化方法

采用超聲醇提法提取原花青素，具體方法：以葡萄籽與50%乙醇溶液按料液比1∶30（g/mL），在超聲溫度50℃、超聲功率331.5 W、超聲輔助提取55 min，提取2次。提取液過濾，合并濾液，減壓濃縮，離心（2 800 r/min，5 min），取上清液凍干制成葡萄籽原花青素提取物。進(jìn)一步采用AB-8樹脂純化葡萄籽原花青素提取物，最佳工藝為上樣液pH4.0、上樣液質(zhì)量濃度6.0 mg/mL、上樣液流速1.0 BV/h、洗脫液體積分?jǐn)?shù)為30%、洗脫體積4 BV。

1.4 葡萄籽原花青素抗氧化活性測定

1.4.1 DPPH自由基、ABTS+自由基清除能力的考察

參照鄒仕昱等[8]的方法，采用紫外分光光度法測定樣品（葡萄籽原花青素溶液和DPPH/ABTS＋工作液）吸光度、樣品本底（葡萄籽原花青素溶液）吸光度。DPPH自由基清除率按下式計(jì)算。

式中：A樣品為樣品和DPPH 的吸光度；A樣品本底為只有樣品時(shí)的吸光度；A空白為只有DPPH的吸光度。

ABTS＋自由基清除率按下式計(jì)算。

式中：A樣品為樣品和 ABTS＋工作液的吸光度；A樣品本底為只有樣品時(shí)的吸光度；A空白為只有ABTS+工作液的吸光度。

1.4.2 羥自由基（·OH）清除能力的考察

參照王少娟等[9]的方法稍作修改，依次分別加入1 mL硫酸鐵、水楊酸乙醇溶液和過氧化氫，37℃下避光反應(yīng)15 min后立即在510 nm處測定吸光度。按下列公式計(jì)算·OH清除率。

式中：A樣品為加入不同濃度的原花青素提取物的吸光度；A樣品本底為等體積的蒸餾水代替過氧化氫的吸光度；A空白為等體積的樣品蒸餾水代替樣品的吸光度。

1.4.3 總還原力測定

參照王家鑌等[10]的方法，采用紫外分光光度法測定。取一定濃度的樣品2 mL及0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH6.6）2 mL和1%鐵氰化鉀溶液1.5 mL，混勻后于50℃水浴20 min，再加入10%三氯乙酸溶液2 mL，混勻后取混合溶液2 mL，加入2 mL蒸餾水、0.4 mL 0.1%三氯化鐵溶液，混勻靜置10 min后于700 nm處測定吸光度。

1.4.4 鐵離子還原/抗氧化能力（ferric ion reducing/antioxidant power，F(xiàn)RAP）測定

參考王定美等[11]的方法，以不同濃度（0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L）的 FeSO4溶液做標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)方程為y=0.638 4x-0.006 3，R2=0.999 5。取0.1 mL不同濃度的稀釋樣液，加入1.9 mL FRAP試劑，混勻后靜置避光10 min，于593 nm處測吸光度。以蒸餾水作為空白，VC為陽性對照進(jìn)行比較分析。

1.5 葡萄籽原花青素果汁飲料的制備

挑選新鮮葡萄洗凈、去蒂，用打漿機(jī)打漿后將葡萄汁倒入干凈容器中備用。將葡萄果汁與原花青素、檸檬酸和白砂糖按照一定比例混均勻后過濾，再進(jìn)行均質(zhì)處理，設(shè)定壓力為20 MPa。將均質(zhì)脫氣后的果汁飲料加熱到90℃進(jìn)行灌裝，巴氏殺菌，即得葡萄籽原花青素果汁飲料，并對其進(jìn)行保溫檢驗(yàn)。

1.5.1 理化指標(biāo)測定

采用pH計(jì)測葡萄籽原花青素果汁飲料的pH值；采用手持糖度計(jì)測定可溶性固形物含量。

1.5.2 微生物指標(biāo)測定

參照GB 4789.2—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測定》[12]，采用平板計(jì)數(shù)法測定菌落總數(shù)；參照GB 4789.3—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)》[13]，采用最大可能數(shù)（most probable number，MPN）計(jì)數(shù)法測定大腸菌群；參照GB 4789.10—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》[14]，采用第一法測定金黃色葡萄球菌。

1.5.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取葡萄汁添加量、原花青素添加量、檸檬酸添加量、白砂糖添加量4個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，每個(gè)因素選取5個(gè)水平，各因素水平分別為葡萄汁添加量10、20、30、40、50 g/100 g，原花青素添加量 0、0.5、1.0、1.5、2.0 g/100g，檸檬酸添加量0.050、0.075、0.100、0.125、0.150 g/100 g，白砂糖添加量 2、4、6、8、10 g/100 g，以感官評分和DPPH·清除率為評價(jià)指標(biāo)，從而確定最適添加量。

1.5.4 響應(yīng)面優(yōu)化葡萄籽原花青素果汁飲料配方

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取原花青素添加量、葡萄汁添加量、檸檬酸添加量3個(gè)因素，以感官評分（權(quán)重0.6）、DPPH·清除率（權(quán)重 0.2）和 FRAP 值（權(quán)重 0.2）為試驗(yàn)的綜合指標(biāo)，采用Design-Expert 8.0.6軟件的Box-Benhnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化GSP果汁飲料的配方，各因素水平編碼見表1。

表1 葡萄籽原花青素果汁飲料響應(yīng)面因素水平Table 1 Response surface factor level of grape seed proanthocyanidins juice beverage

1.5.5 感官評定方法

從色澤、口感、香氣、組織狀態(tài)4個(gè)方面對該飲料進(jìn)行整體感官評價(jià)，滿分為100分，其中色澤、口感均為30分，香氣、組織狀態(tài)均為20分，邀請10名具有專業(yè)水平的人員對成品進(jìn)行感官評價(jià)，感官評定標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 葡萄籽原花青素果汁飲料的感官評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation criteria of grape seed proanthocyanidins juice beverage

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010軟件作圖，應(yīng)用Design-Expert 8.0.6軟件，分別對單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)和響應(yīng)面數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，建立線性回歸方程并判斷模型顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外抗氧化活性測定結(jié)果

GSP的抗氧化能力測定結(jié)果見圖1。

圖1 GSP的抗氧化能力測定Fig.1 Determination of the antioxidant capacity of grape seed proanthocyanidins

由圖1可知，當(dāng)GSP的質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí)，對DPPH自由基清除率達(dá)最大值為94.49%（圖1A）；質(zhì)量濃度為15mg/mL時(shí)，對ABTS+自由基清除率可達(dá)99.42%（如圖1B）。從圖1C可知，賓川葡萄籽原花青素對·OH的清除率相對較低。賓川葡萄籽原花青素具備很強(qiáng)的還原力，當(dāng)質(zhì)量濃度超過5 mg/mL時(shí)總還原能力高于維生素C（見圖1D）。由圖1E可以看出，葡萄籽原花青素濃度為5 mg/mL時(shí)，F(xiàn)RAP值最大，濃度繼續(xù)增加，F(xiàn)RAP值逐漸下降；而對照組VC的FRAP值隨濃度的增加變化不明顯，但均高于葡萄籽原花青素。賓川葡萄籽原花青素在較低濃度時(shí)對DPPH自由基和ABTS+自由基清除率很強(qiáng)，這與郗艷麗等[15]和王偉等[16]的研究結(jié)果一致。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

葡萄汁添加量對葡萄籽原花青素果汁飲料的影響見圖2。

圖2 葡萄汁添加量對葡萄籽原花青素果汁飲料的影響Fig.2 Effect of grape juice addition on grape seed proanthocyanidins juice beverage

由圖2可知，葡萄汁添加量由10 g/100 g增加到40 g/100 g時(shí)，感官評分逐漸增大，當(dāng)為40 g/100 g時(shí)，飲料的色澤、口感評價(jià)均較好，感官評分達(dá)到最大值；而繼續(xù)增加葡萄汁的添加量，顏色變暗，整體味道不佳。這說明葡萄汁的含量對飲料的質(zhì)量有很大的影響，葡萄汁中含有的獨(dú)特風(fēng)味物質(zhì)，使其具有濃郁的口感和持久的香氣，添加量過大時(shí)，有明顯的澀味，酸甜比不適中。葡萄汁添加量在10 g/100 g～30 g/100 g時(shí)，葡萄籽原花青素果汁飲料對DPPH自由基的清除率逐漸減小，當(dāng)葡萄汁添加量為40 g/100 g時(shí)，對DPPH自由基的清除率達(dá)到95.12%，為最大值。綜合分析，故應(yīng)選擇葡萄汁添加量在40 g/100 g左右為宜。

葡萄籽原花青素添加量對葡萄籽原花青素果汁飲料的影響見圖3。

圖3 葡萄籽原花青素添加量對葡萄籽原花青素果汁飲料的影響Fig.3 Effect of grape seed proanthocyanidins addition on grape seed proanthocyanidins juice beverage

由圖3可知，隨著葡萄籽原花青素添加量的增加，感官評分呈先升高后降低的趨勢，這與葡萄籽原花青素酸澀的口感有關(guān)。當(dāng)添加量達(dá)到1.5 g/100 g時(shí)，感官分值達(dá)到最大值，此時(shí)飲料色澤呈紅棕色，口感濃郁，葡萄籽原花青素添加量高于1.5 g/100 g時(shí)，則顏色變深，口感酸澀，整體感官分值有明顯的降低。根據(jù)前期試驗(yàn)結(jié)果，當(dāng)添加量再增大時(shí)葡萄籽原花青素的抗氧化活性并不會(huì)增加，但整體來說沒有太大影響，也可能是因?yàn)槠咸炎言ㄇ嗨嘏c葡萄汁同時(shí)添加時(shí)抑制了它的清除能力，綜合考慮則應(yīng)選擇葡萄籽原花青素添加量為1.5 g/100 g左右。檸檬酸添加量對葡萄籽原花青素果汁飲料的影響見圖4。

圖4 檸檬酸添加量對葡萄籽原花青素果汁飲料的影響Fig.4 Effect of citric acid addition on grape seed proanthocyanidins juice beverage

從圖4可以看出，隨著檸檬酸添加量的增加，果汁飲料感官評分及其對DPPH自由基清除率均呈先增大后減小的趨勢，當(dāng)添加量較少時(shí)酸味較弱，酸甜比不均衡，當(dāng)檸檬酸添加量為0.125 g/100 g時(shí)，可與白砂糖形成協(xié)調(diào)的糖酸比，此時(shí)飲料的感官評分、對DPPH自由基清除率均達(dá)到最大值；之后再繼續(xù)增加檸檬酸用量，果汁飲料過酸澀，表明飲料較好的口感與適宜的糖酸比例密切相關(guān)。故檸檬酸的添加量應(yīng)為0.125 g/100 g左右最適宜。白砂糖添加量對葡萄籽原花青素果汁飲料的影響見圖5。

圖5 白砂糖添加量對葡萄籽原花青素果汁飲料的影響Fig.5 Effect of white sugar addition on grape seed proanthocyanidins juice beverage

由圖5可知，當(dāng)白砂糖添加量從2 g/100 g增加到10 g/100 g時(shí)，果汁飲料感官評分呈先升后降的趨勢，在添加量為6 g/100 g時(shí)達(dá)到最高，此時(shí)綜合感官品質(zhì)最佳，可能是由于白砂糖與葡萄汁的風(fēng)味物質(zhì)通過味的相乘作用或相互作用[17]使香味濃郁，甜味醇厚；隨著白砂糖含量的增加，甜度過高，酸甜比例失調(diào)，掩蔽了葡萄果汁原有的風(fēng)味。原花青素葡萄果汁飲料對DPPH自由基的清除率隨白砂糖添加量的增加逐漸降低，白砂糖的添加主要是為了改善飲料的口感，因此確定白砂糖添加量為6 g/100 g。

綜合分析圖2～圖5可知，在試驗(yàn)范圍內(nèi)，葡萄籽原花青素果汁飲料的感官評分隨葡萄汁添加量、葡萄籽原花青素添加量、檸檬酸添加量及白砂糖添加量的增加而增大，感官評分達(dá)最大值后，隨各因素添加量增加感官評分減小，說明各因素的添加量對飲料感官評分影響較大。從圖4可以看出，葡萄籽原花青素果汁飲料對DPPH自由基的清除率隨檸檬酸添加量的增多呈先增大后減小的趨勢，隨葡萄籽原花青素添加量（圖3）的增多對DPPH自由基的清除率減小，這與之前的試驗(yàn)結(jié)果一致（圖1A），葡萄籽原花青素在較低濃度時(shí)對DPPH自由基有較強(qiáng)的清除作用。

2.3 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

采用Box-Benhnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)葡萄籽原花青素果汁飲料優(yōu)化結(jié)果見表3。

表3 葡萄籽原花青素果汁飲料響應(yīng)面試驗(yàn)及結(jié)果Table 3 Response surface test and results of grape seed proanthocyanidins juice beverage

續(xù)表3 葡萄籽原花青素果汁飲料響應(yīng)面試驗(yàn)及結(jié)果Continue table 3 Response surface test and results of grape seed proanthocyanidins juice beverage

各因素對綜合得分的回歸模型方程為Y=71.10-2.32A+0.413 5B+3.53C+1.72AB+2.55AC+0.046 6BC-0.887 1A2-1.22B2-2.97C2。表4為方差分析結(jié)果。

表4 方差分析Table 4 Analysis of variance

由表4可知，回歸模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），說明該模型擬合度良好，失擬項(xiàng)P＝0.352 643＞0.05，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明失擬不顯著，誤差小，穩(wěn)定性較好，可用來預(yù)測葡萄籽原花青素果汁飲料綜合評分。從F值可以看出，因素A、B、C對葡萄籽原花青素果汁飲料綜合評分影響大小依次為葡萄汁添加量（C）＞原花青素添加量（A）＞檸檬酸添加量（B）。

影響葡萄籽原花青素果汁飲料綜合評分的各因素交互作用的響應(yīng)面結(jié)果見圖6。

圖6 各因素交互作用對葡萄籽原花青素果汁飲料綜合評分的影響Fig.6 The influence of the interaction of various factors on the comprehensive score of grape seed proanthocyanidins juice beverage

由響應(yīng)面結(jié)果得到葡萄籽原花青素果汁飲料的最優(yōu)配方為原花青素添加量0.5 g/100 g、檸檬酸添加量0.12 g/100 g、葡萄汁添加量41.62 g/100 g、白砂糖添加量6 g/100 g。理論預(yù)測該葡萄籽原花青素果汁飲料的綜合評分為72.953，為驗(yàn)證該模型的可靠性，根據(jù)以上優(yōu)化配方做3組重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，3組葡萄籽原花青素果汁飲料的感官評分和抗氧化指標(biāo)測定結(jié)果如表5所示。

表5 葡萄籽原花青素果汁飲料的感官評價(jià)和抗氧化指標(biāo)測定結(jié)果Table 5 Sensory evaluation and antioxidant index test results of grape seed proanthocyanidins juice beverage

由表5可知，所得最終評分與理論分值接近，且3次驗(yàn)證試驗(yàn)誤差較小，說明此次配方所得的成品在感官評分和抗氧化性均達(dá)到良好，且飲料口感較好。

2.4 理化指標(biāo)測定結(jié)果

用手持糖度計(jì)測定飲料中可溶性固形物含量為15%，用pH計(jì)檢測飲料pH值為3.72。此時(shí)的飲料口感較好，有合適的糖酸比。

2.5 微生物指標(biāo)測定結(jié)果

將葡萄籽原花青素果汁飲料成品，進(jìn)行微生物指標(biāo)檢測，測定結(jié)果見表6。

表6 葡萄籽原花青素果汁飲料的微生物指標(biāo)測定結(jié)果Table 6 Microbial index test results of grape seed proanthocyanidins juice beverage

由表6可知，該葡萄籽原花青素果汁飲料中菌落總數(shù)、大腸菌群和金黃色葡萄球菌均符合GB 16740—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)保健食品》的要求。

3 討論與結(jié)論

已有研究表明含有黃酮類、酚類或花青素的天然植物提取物在體內(nèi)外均表現(xiàn)出良好的抗氧化性能[18-19]。另有研究發(fā)現(xiàn)B環(huán)2'-和4'-甲氧基取代基的花青素被FRAP方法證明具有較低的抗氧化活性，與維生素C具有1/3的等效效應(yīng)[20]。本研究通過考察GSP對DPPH自由基、ABTS+自由基、羥自由基（·OH）的清除能力、總還原力測定及FRAP法測定抗氧化能力，發(fā)現(xiàn)云南大理賓川縣GSP具有良好的體外抗氧化活性，該結(jié)論與前期研究成果相同，說明該葡萄籽原花青素可作為開發(fā)食品、藥品、化妝品等行業(yè)的天然抗氧化劑。Jia等[21]通過測定4種粗藤提取物對·OH的清除能力，發(fā)現(xiàn)在相同濃度下粗藤提取物的清除效果不如VC，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致，即賓川葡萄籽原花青素對·OH的清除率相對較低。在此基礎(chǔ)上研發(fā)的葡萄籽原花青素果汁飲料采用單因素試驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面優(yōu)化確定最優(yōu)配方為葡萄籽原花青素添加量0.5 g/100 g、檸檬酸添加量0.12 g/100 g、葡萄汁添加量41.62 g/100 g、白砂糖添加量6 g/100 g。果汁飲料經(jīng)脫氣、灌裝、密封和殺菌（90℃、15 min），并冷卻至室溫（25℃），經(jīng) 5 d貯藏后，檢驗(yàn)沒有被微生物污染、飲料沒有褪色、分層、沉淀和脹罐現(xiàn)象，即為葡萄籽原花青素果汁飲料成品。通過上述生產(chǎn)技術(shù)，可生產(chǎn)出質(zhì)量優(yōu)良的果汁飲料，滿足廣大消費(fèi)者的飲食需求，為現(xiàn)代人提供了更健康的飲食選擇并提升當(dāng)?shù)仄咸旬a(chǎn)業(yè)附加值。