溶劑-超聲波-酶法輔助提取桑葚果渣色素及其抗氧化活性研究

吳均，吳俊葶，黃傳書*，趙珮，劉艷，馬婧秋

（1.重慶市蠶業科學技術研究院，重慶 400700；2.中國人民解放軍陸軍勤務學院，重慶 401331）

桑葚富含多糖、脂肪酸、花色苷、鞣質、蘆丁、維生素、蛋白質、果膠、粗纖維等成分[1]，具有抑菌、抗氧化、抑制動脈粥樣硬化和有害物質生成的作用[2-6]。因桑葚皮薄、易腐敗、易霉變和保質期極短等特點使其工業化發展受到了極大的限制，我國桑葚種植面積大、分布廣，資源豐富，但總體利用率較低，絕大多數以采摘鮮食為主，加工產品主要為果干、果汁、果醋、果粉、果膏和果酒等[7-11]。加工產生的果渣營養豐富但通常被丟棄，資源浪費十分嚴重。研究表明，桑葚果渣中富含大量有色物質花色苷[12]，可作為理想的天然色素提取原料[13]。

近年來，人們對食品安全的重視程度越來越強，用天然色素代替化學合成色素已成為必然趨勢[14-15]，不僅是因為天然色素無毒，更因為它本身就是食品中具有生理活性的一部分，且營養豐富[16-17]，將其添加至食品中對人體健康有益。從桑葚果渣中提取天然色素，可以拓寬天然色素的獲取渠道，滿足輕工業對天然色素日漸增長的需求，也能提高桑葚產品的附加值。色素提取工藝主要有溶劑提取法[18]、超聲波輔助提取法[19]、微波輔助提取法[20]、酶解法[21]、微生物發酵提取法[22]和超臨界CO2法[23]等。溶劑-超聲波-酶法輔助提取法將3種方法整合，促進溶劑與有效成分融合，加快色素的溶解速度，提高色素的提取率，且不會造成成分的破壞，最大限度的保證產物的品質。本試驗優化溶劑-超聲波-酶法輔助提取桑葚果渣色素的工藝條件，獲得提取液后分析其抗氧化活性，為桑葚果渣廢棄物的開發應用提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑葚果渣：重慶市蠶業科學技術研究院；無水檸檬酸（食品級）：濰坊英軒實業有限公司；無水乙醇（分析純）：成都市科隆化學品有限公司；鹽酸（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；纖維素酶（食品級，5萬U/g）、維生素C（分析純）：北京索萊寶科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH）（分析純）：合肥博美生物科技有限責任公司；2，2'-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]（分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；Trolox（純度97%）：美國sigma公司。

1.2 儀器與設備

原汁機（H-200）：上海韓惠人愛家電科技有限公司；電熱鼓風干燥箱（101型）：北京科偉永興儀器有限公司；破壁料理機（MJ-PB80Easy215）：廣東美的生活電器制造有限公司；超聲波清洗儀（SB25-12DTD）：寧波新芝生物科技股份有限公司；數顯全溫振蕩器（HZQ-2）：山東博科科學儀器有限公司；旋轉蒸發儀（RE-52AA）：上海亞榮生化儀器廠；冷凍干燥機（CTFD-12S）：青島永合創信電子科技有限公司；pH計（PHS-3C）：上海雷磁儀器有限公司；紫外可見光分光光度計（Ultra-3600）：北京普源精電科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料預處理

將廢棄冷凍果渣置于搪瓷盤中，于60℃烘箱中烘干，用破壁料理機破碎成粉，過80目篩，于-4℃條件下避光保存。

1.3.2 桑葚果渣色素的最大吸收波長測定

稱取適量桑葚果渣粉末于三角瓶中，按1∶25（g/mL）料液比加入50%乙醇，置于超聲功率300 W、50℃下提取30 min，10 000 r/min離心10 min，吸取1 mL上清液至25 mL棕色容量瓶，超純水定容，用紫外可見光分光光度計進行400 nm～700 nm可見光波段掃描，確定最大吸收波長。試驗設3次重復。

1.3.3 桑葚果渣色素提取的單因素試驗

稱取適量桑葚果渣粉末，以檸檬酸-90%乙醇（體積比1∶1）為提取溶劑提取桑葚果渣色素，考察檸檬酸濃度（6.0%、6.5%、7.0%、7.5%、8.0%）、料液比[1∶20、1∶25、1 ∶30、1 ∶35、1 ∶40（g/mL）]、纖維素酶添加量（40、60、80、100、120 U/mL）、超聲溫度（30、40、50、60、70 ℃）、超聲時間（20、30、40、50、60 min）、超聲功率（240、300、360、420、480、540、600 W）對吸光度的影響。提取液于10 000 r/min離心10 min，取1 mL上清液至10 mL棕色容量瓶，超純水定容，于最大吸收波長513 nm處測定吸光度。

1.3.4 桑葚果渣色素提取的響應面試驗

以單因素試驗結果為依據，選擇對結果影響較大的檸檬酸濃度（A）、料液比（B）、超聲溫度（C）和超聲時間（D）為自變量，以吸光度（Y）為響應值，采用響應面法進行優化，對桑葚果渣色素最佳提取工藝條件進行設計，試驗設計因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

1.3.5 桑葚果渣色素的抗氧化活性分析

1.3.5.1 DPPH自由基清除率測定

分別取 20、40、60、80、100、120、140、160 μL 的桑葚果渣色素提取液于試管中，用超純水補充至3 mL，加入3 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液搖勻，避光放置30 min，于波長513 nm處測定吸光度Ai。同時測定含有20、40、60、80、100、120、140、160 μL 的桑葚果渣色素提取液（超純水補充至3 mL）與無水乙醇各3 mL混合后的溶液吸光度Aj，以及無水乙醇與0.2 mmol/L DPPH溶液各3 mL混合后的溶液吸光度A0[24]；以VC和Trolox做陽性對照。DPPH自由基清除率計算公式如下。

1.3.5.2 ABTS+自由基清除率測定

分別取 10、20、30、40、50、60、70、80 μL 的粗提色素溶液于試管中，用超純水補充至0.2 mL，加入ABTS+工作液5.8 mL，搖勻，避光放置10 min，于波長734 nm處測定吸光度 Ai，同時測定含有 10、20、30、40、50、60、70、80 μL的桑葚果渣色素提取液（超純水補充至0.2 mL）與5.8mL無水乙醇混合后的溶液吸光度Aj，以及0.2mL無水乙醇與5.8 mL ABTS+工作液混合后的溶液吸光度A0[25]；以VC和Trolox做陽性對照。ABTS+自由基清除率計算公式如下。

1.3.6 數據處理及繪圖

采用 Excel、Origin 9.0和 Design Expert 8.0.6進行繪圖和響應面分析。

2 結果與分析

2.1 桑葚果渣色素最大吸收波長測定結果

桑葚果渣色素的最佳吸收光譜圖見圖1。

圖1 桑葚果渣色素的最佳吸收光譜圖Fig.1 Optimal absorption wavelength of mulberry residue pigment

由圖1可知，400 nm～700 nm可見光波全段掃描稀釋后的提取液在波長513 nm出現最大吸光度，吸光度為0.422 4。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 檸檬酸濃度對桑葚果渣色素提取的影響

檸檬酸濃度對桑葚果渣色素提取的影響見圖2。

圖2 檸檬酸濃度對桑葚果渣色素提取的影響Fig.2 Effect of citric acid concentration on pigment extraction from mulberry residue

由圖2可知，提取液的吸光度隨著檸檬酸濃度增加先升高后下降，可能是因為花色苷的存在形式隨著檸檬酸濃度的增加由醇型假堿轉化為黃烊鹽[26]。當檸檬酸濃度上升到7.0%時，提取液吸光度達到最大值；之后提取液的吸光度隨著檸檬酸濃度的增加而下降，可能是因為隨著檸檬酸濃度的增加，黃烊陽離子被水的親核攻擊而水合，濃度下降，使花色苷主要以無色的甲醇假堿或淡黃色查爾酮的形式存在。因此，最佳檸檬酸濃度為7.0%。

2.2.2 料液比對桑葚果渣色素提取的影響

料液比對桑葚果渣色素提取的影響見圖3。

圖3 料液比對桑葚果渣色素提取的影響Fig.3 Effect of material-liquid ratio on pigment extraction from mulberry residue

由圖3可知，隨著溶劑的增加，提取液的吸光度不斷增加，料液比為1∶30（g/mL）時吸光度達到最大值，隨后溶劑繼續增加，桑葚果渣色素溶液被稀釋使得溶液濃度下降，吸光度下降。因此，最佳料液比為1∶30（g/mL）。

2.2.3 纖維素酶添加量對桑葚果渣色素提取的影響

纖維素酶添加量對桑葚果渣色素提取的影響見圖4。

圖4 纖維素酶添加量對桑葚果渣色素提取的影響Fig.4 Effect of cellulase dosage on pigment extraction from mulberry residue

纖維素酶通過降解半纖維素和纖維素，使細胞結構局部變得疏松、膨脹、崩潰，細胞內的色素不斷溶出，吸光度不斷增加[27]。由圖4可知，隨著纖維素酶添加量的增加，提取液中的色素含量不斷增加，添加量為80 U/mL時吸光度達到最大值，隨后酶添加量繼續增加，吸光度反而有所下降。因此，最佳纖維素酶添加量為80 U/mL。

2.2.4 超聲溫度對桑葚果渣色素提取的影響

超聲溫度對桑葚果渣色素提取的影響見圖5。

圖5 超聲溫度對桑葚果渣色素提取的影響Fig.5 Effect of ultrasonic temperature on pigment extraction from mulberry residue

由圖5可知，隨著超聲溫度的升高，提取液的吸光度不斷增大，超聲溫度為50℃時吸光度達到最大值，超聲溫度繼續增加，吸光度降低，原因可能是當超聲溫度較低時，酶活較低，酶促反應慢，色素溶出較少，隨著溫度的升高，酶促反應加快，色素溶出增多；而當溫度過高時，又會抑制酶的活性或使酶失活，酶促反應停止，且高溫也會致使桑葚果渣色素大量分解，進一步使吸光度降低。因此，最佳超聲溫度為50℃。

2.2.5 超聲時間對桑葚果渣色素提取的影響

超聲時間對桑葚果渣色素提取的影響見圖6。

圖6 超聲時間對桑葚果渣色素提取的影響Fig.6 Effect of ultrasonic time on pigment extraction from mulberry residue

由圖6可知，隨著超聲時間的延長，吸光度不斷增大，這是由于超聲使得液體體系分子運動速度加快，色素加快溶出，提取液吸光度不斷增大。當超聲時間達到40 min時，吸光度達到最大值，之后超聲時間繼續延長吸光度逐漸降低，可能是因為超聲時間過長導致桑葚果渣色素大量分解[28]。因此，最佳超聲時間為40 min。

2.2.6 超聲功率對桑葚果渣色素提取的影響

超聲功率對桑葚果渣色素提取的影響見圖7。

圖7 超聲功率對桑葚果渣色素提取的影響Fig.7 Effect of ultrasonic power on pigment extraction from mulberry residue

由圖7可知，超聲功率低于300 W時，吸光度隨著超聲功率的增加而增大。功率為300 W時，吸光度達到最大值，可能是因為隨著超聲功率的增加，溶液中分子之間的碰撞和摩擦頻率逐漸增大，從而使產生的機械效應、空化效應、熱效應相繼增加，加快桑葚色素的溶出。當功率大于300 W時，吸光度開始減小，分析是產生的熱效應使桑葚果渣色素分解，使吸光度減小[29]。因此，最佳超聲功率為300 W。

2.3 響應面試驗結果

2.3.1 響應面試驗結果與方差分析

響應面試驗結果見表2。

表2 Box-Behnken試驗設計方案及結果Table 2 Results of Box-Behnken experiments design

采用Design-Expert 8.0.6分析軟件對表2試驗結果進行多元回歸分析，得到預測模型回歸方程為Y=1.36+0.044A-0.14B-0.059C+0.039D-0.045AB-0.084AC-0.011AD-0.029BC-0.045BD+6.000×10-4CD-0.22A2-0.17B2-0.18C2-0.26D2。方差分析見表3。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

由表3可知，該模型極顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（P=0.832 3＞0.05），說明該模型擬合度較好，方程可以較好地預測結果[30]。A、B、C、D、AB、AC、BD、A2、B2、C2、D2對桑葚果渣色素提取效果的影響極顯著，說明它們對吸光度的影響比較復雜，不僅是簡單的線性關系。R2=0.970 4，R2adj=0.984 8，說明該模型能解釋98.48%的變化，擬合度較好，因此能用此模型對桑葚果渣色素提取工藝進行分析和預測。由F值大小可知，4個因素對響應值的影響順序為超聲溫度（C）＞檸檬酸濃度（A）＞料液比（B）＞超聲時間（D）。

2.3.2 響應面交互作用

以回歸方程為依據，繪制各因素之間交互作用的三維空間響應曲面圖，結果見圖8。

圖8 各因素交互作用對桑葚果渣色素提取影響的響應面分析Fig.8 Response surface analysis of the influence of interaction of various factors on pigment extraction from mulberry residue

三維圖和等高線能夠預測和檢驗自變量的響應值及自變量之間的關系[31]。由圖8可以看出AB、AC和BD的等高線呈橢圓形，說明兩者交互作用對吸光度的影響大，達到極顯著效果，CD、AD、BC的等高線呈圓形，說明兩者的交互作用不顯著。

經響應面分析得到桑葚果渣色素最佳提取工藝條件為檸檬酸濃度7.09%、料液比1∶27.73（g/mL）、超聲溫度48.30℃、超聲時間41.08 min，桑葚果渣色素提取液吸光度預測值為1.403 54；為了方便操作，將以上條件調整為檸檬酸濃度7%、料液比1∶28（g/mL）、超聲溫度48℃、超聲時間41 min，在此條件下進行桑葚果渣色素提取，得到桑葚果渣色素提取液吸光度為1.404 5，真實值與預測值相符度高，表明該提取工藝可行。

2.4 桑葚果渣色素抗氧化活性測定結果

桑葚果渣色素提取液的DPPH自由基清除率見圖9。

圖9 桑葚果渣色素提取液的DPPH自由基清除率Fig.9 DPPH scavenging capacity of mulberry marc pigment solution

由圖9可知，樣品體積小于140 μL時，桑葚果渣色素提取液、VC溶液、Trolox溶液的DPPH自由基清除率隨著樣品體積的增加而增加。當樣品體積為140 μL時，桑葚果渣色素提取液、VC溶液、Trolox溶液的DPPH自由基清除率分別為97.72%、97.71%和97.05%，樣品體積大于140μL時，桑葚果渣色素提取液、VC溶液、Trolox溶液對DPPH自由基清除率的增長緩慢。相同體積的桑葚果渣色素提取液的DPPH自由基清除能力均高于VC溶液和Trolox溶液。

桑葚果渣色素提取液的ABTS+自由基清除率見圖10。

圖10 桑葚果渣色素提取液的ABTS+自由基清除率Fig.10 ABTS+scavenging capacity of mulberry marc pigment solution

由圖10可知，樣品體積小于60 μL時，桑葚果渣色素提取液、VC溶液、Trolox溶液的ABTS+自由基清除率隨樣品體積的增加而增加。當樣品體積為60 μL時，桑葚果渣色素提取液、VC溶液、Trolox溶液的ABTS+自由基清除率分別為98.22%、96.68%和98.03%，樣品體積大于60 μL時，桑葚果渣色素提取液、VC溶液、Trolox溶液對ABTS+自由基清除率的增長緩慢。相同體積的桑葚果渣色素提取液的ABTS+自由基清除能力要低于Trolox溶液，但略高于VC溶液。

3 結論

通過單因素和響應面分析得到桑葚果渣色素的最佳提取工藝條件：檸檬酸濃度7%、料液比1∶28（g/mL）、超聲溫度48℃、超聲時間41 min，在此條件下進行桑葚果渣色素提取，得到桑葚果渣色素提取液吸光度為1.404 5。表明該模型擬合程度良好，能用此模型對桑葚果渣色素提取進行分析和預測，140 μL桑葚果渣色素提取液的DPPH自由基清除率為97.72%，60 μL的桑葚果渣色素提取液的ABTS+自由基清除率為98.22%。該提取工藝能夠提高桑葚果渣色素的提取率，對具有高活性成分天然桑葚色素的提取具有指導意義。