余甘子多酚純化工藝研究及組分分析

孟令志，王佳慧，王甄潔，孫晗，李云飛，張雅捷，夏寧，謝春陽

（吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130000）

余甘子又稱為庵摩勒、望果、久如拉等，是大戟科落葉灌木的干燥果實[1]，作為藥食同源的材料[2]，含有氨基酸[3-4]、油脂[5]、糖類物質[6]、維生素[7]及多酚類物質[8]。其中多酚類物質包括沒食子酸、柯里拉京、鞣花酸、訶子林鞣酸等[9-11]，具有抗癌、消炎、抗菌等作用。余甘子多酚經超聲提取后，純度較低，對其后續研究影響較大，需進行純化處理，而大孔樹脂作為吸附分離介質，具有吸附性好、穩定性高、可再生等優點，在工業脫色、活性物質分離純化等領域已廣泛應用[12]。本試驗采用大孔樹脂純化法，在6種大孔樹脂中篩選出對余甘子多酚純化效果良好的樹脂，并確定最佳吸附-解吸條件，對純化后的多酚采用高效液相色譜法測定具體成分及含量[13]。為工業化生產其多酚類物質及成分分析提供參考。

1 材料與試劑

1.1 試驗材料

新鮮余甘子：福建惠安采摘園，采摘后立即運送至實驗室進行預處理。

1.2 試驗試劑

福林酚（分析純）：上海藍李科技發展有限公司；沒食子酸、無水乙醇（均為分析純）、甲醇（色譜純）：國藥集團化學試劑有限公司；訶子林鞣酸、柯里拉京、鞣花酸（均為分析純）：上海源葉生物科技有限公司；X-5、D101、S-8型大孔樹脂：東鴻化工有限公司；AB-8型大孔樹脂：安徽皖樹化工銷售有限公司；D1400型大孔樹脂：鄭州和成新材料科技有限公司；XAD-7HP型大孔樹脂：美國ROHM AND HAAS公司。

1.3 儀器與設備

U3000高效液相色譜儀：賽默飛世爾科技公司；BS-100自動部分收集器：上海滬西分析儀器廠有限公司；PHS-25酸度計：上海理達儀器廠；層析柱（1.6 cm×20 cm）：上海亞榮生化儀器廠；CX-HL-20004F恒流泵：上海瓷熙儀器儀表有限公司；BSD-YX（F）3200立式智能精密搖床：上海博訊醫療生物儀器股份有限公司。

2 試驗方法

2.1 原料處理

運用超聲波輔助法對余甘子多酚進行提取，將濃縮后的提取液冷凍干燥，獲得余甘子多酚凍干粉，并對其多酚含量進行測定。

2.2 標準曲線的繪制

余甘子多酚濃度使用福林酚法測定[14]，以質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。

2.3 大孔樹脂預處理

使用無水乙醇對 X-5、D-101、S-8、AB-8、D-1400、XAD-7HP大孔樹脂進行活化，攪拌至無氣泡產生，靜置24 h使其活化充分后，用蒸餾水將樹脂中乙醇洗凈[15]。

2.4 大孔樹脂的篩選

稱取5 g大孔樹脂于錐形瓶中，加入2.5 mg/mL余甘子粗多酚溶液50 mL，置于搖床上靜態吸附24 h，測定上清液中多酚質量濃度，按公式（1）、（2）計算吸附量、吸附率[16]。

吸附后的大孔樹脂表面殘留多酚使用蒸餾水洗凈，加入50 mL 85%乙醇溶液，置于搖床上靜態解吸24 h，測定上清液中多酚質量濃度，按公式（3）計算解吸率[17]。

式中：Q為吸附量，mg/g；C0為吸附前多酚質量濃度，mg/mL；C1為吸附后多酚質量濃度，mg/mL；C2為解吸后多酚質量濃度，mg/mL；V1為多酚溶液體積，mL；V2為乙醇溶液體積，mL；m為樹脂質量，g。

2.5 XAD-7HP大孔樹脂靜態吸附-解吸條件優化

稱取XAD-7HP大孔樹脂5 g于錐形瓶中，分別加入 1、2、3、4、5 mg/mL 的余甘子多酚溶液 50 mL，置于搖床上靜態吸附，充分吸附后測定上清液中多酚質量濃度，篩選最佳上樣液質量濃度。

配制 pH 值為 2、3、4、5、6、7，質量濃度為 4 mg/mL余甘子多酚溶液，稱取XAD-7HP大孔樹脂5 g于錐形瓶中，分別加入多酚溶液50 mL后，置于搖床上靜態吸附，充分吸附后測定上清液中多酚質量濃度，篩選最佳上樣液pH值。

吸附后的XAD-7HP大孔樹脂使用蒸餾水將表面殘留多酚洗凈，分別加入55%、65%、75%、85%、95%乙醇溶液50 mL后，置于搖床上靜態解吸，充分解吸后測定上清液中多酚質量濃度，篩選最佳解吸乙醇體積分數。

配制 pH 值為 2、3、4、5、6、7、8、9、10 的乙醇溶液，重復上述步驟，篩選最佳解吸液pH值。

2.6 XAD-7HP大孔樹脂動態吸附-解吸條件優化

濕法裝柱XAD-7HP大孔樹脂于1.6 cm×20 cm的層析柱，將樣液分別以1、2、3、4、5mL/min速度通過恒流泵上樣，進行動態吸附，收集流出液（5 mL/管），測定管中多酚質量濃度，計算泄漏點體積[18]，確定最佳上樣流速及上樣體積。達到平衡后，使用蒸餾水以相同流速洗柱直至無色，用苯酚硫酸法每50 mL測定多糖濃度，考察洗脫液體積。當雜質洗凈后，以 1、2、3、4、5mL/min 速度將解吸液注入層析柱中解吸，收集流出液（5 mL/管），測定流出液多酚質量濃度，確定最佳解吸液流速。

2.7 余甘子多酚純度測定方法

稱取一定量的余甘子粗多酚凍干粉和經過純化后的余甘子多酚凍干粉，配制成溶液按步驟計算余甘子多酚質量濃度后，按公式（4）計算余甘子多酚純度。

式中：C0為多酚質量濃度，mg/mL；V為溶液體積，mL；m 為凍干粉質量，mg。

2.8 余甘子多酚組分分析

采用高效液相色譜法測定多酚組分，稱取0.01 g純化后的余甘子多酚凍干粉，甲醇為溶劑，定容于5 mL棕色容量瓶中，然后經過C18固相萃取小柱，收集3 mL后的流出液，用0.22 μm濾膜過濾，加入棕色進樣瓶，用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）分析測定余甘子多酚組分。以對照品色譜圖的保留時間為參考，進行分析鑒定其中的有效成分，并通過外標法計算各組分的含量[19]。

色譜條件：Diamonsil C18色譜柱；柱溫30℃；總流速 1 mL/min；進樣量 10 μL；檢測波長 270 nm；流動相A為甲醇，流動相B為0.2%醋酸溶液。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure

2.9 數據統計分析

試驗數據利用 Excel 2010、SPSS 17.0、Origin 2018及Design-Expert 8.0.6進行分析及繪圖。

3 結果與分析

3.1 沒食子酸標準曲線及線性方程

沒食子酸標準曲線如圖1所示。回歸方程為y=104.050 0x+0.045 8，R2=0.999 3，線性關系良好。

圖1 沒食子酸標準曲線Fig.1 Gallic acid standard curve

3.2 大孔樹脂的篩選結果

6種大孔樹脂對余甘子多酚的靜態吸附與解吸結果見表2。

表2 6種大孔樹脂對余甘子多酚的靜態吸附與解吸結果Table 2 Static adsorption and desorption results of polyphenols from Phyllanthus emblica L.by six macroporous resins

由表2可以看出，S-8、XAD-7HP大孔樹脂的吸附效果較好，在解吸方面XAD-7HP的解吸效果明顯高于其余5種大孔樹脂，綜合考慮，余甘子多酚的純化材料選擇XAD-7HP大孔樹脂。

3.3 XAD-7HP大孔樹脂靜態吸附-解吸結果與分析3.3.1 余甘子多酚質量濃度對吸附量的影響

余甘子多酚質量濃度對吸附量的影響見圖2。

圖2 余甘子多酚質量濃度對吸附量的影響Fig.2 Effect of polyphenol concentration of Phyllanthus emblica L.on adsorption capacity

由圖2可知，隨著多酚質量濃度的增加XAD-7HP大孔樹脂對余甘子多酚的吸附量呈先上升后下降的趨勢，余甘子多酚質量濃度為4 mg/mL時，大孔樹脂的吸附量最大為（30.18±0.12）mg/g，當余甘子多酚的質量濃度大于4 mg/mL時，吸附量降低，這是由于當余甘子多酚質量濃度過大時會在層析柱內產生絮狀物沉淀，阻塞樹脂空隙，同時雜質的含量也在增加，和余甘子多酚爭奪XAD-7HP大孔樹脂的活性位點；而低質量濃度的余甘子多酚會使XAD-7HP大孔樹脂吸附活性降低。所以，XAD-7HP大孔樹脂對余甘子多酚進行純化時選定質量濃度為4 mg/mL最佳。

3.3.2 余甘子多酚溶液pH值對吸附量的影響

余甘子多酚溶液pH值對吸附量的影響見圖3。

圖3 余甘子多酚溶液pH值對吸附量的影響Fig.3 Effect of pH value of Phyllanthus emblica L.polyphenol solution on adsorption capacity

由圖3可知，XAD-7HP大孔樹脂的吸附量隨著余甘子多酚溶液pH值的增大先增加后減少，當余甘子多酚溶液pH值為3時，吸附量最大為（31.76±0.16）mg/g，而余甘子多酚多為酚酸類，在酸性條件下會以分子形式存在，利于XAD-7HP大孔樹脂對其吸附；多酚分子本身呈微極性，其極性會隨著pH值的不同而改變，從而影響其與XAD-7HP大孔樹脂之間的吸附作用。綜上所述，XAD-7HP大孔樹脂對余甘子多酚進行純化時樣液的pH值為3最佳。

3.3.3 解吸液體積分數對XAD-7HP大孔樹脂解吸效果的影響

解吸液體積分數對XAD-7HP大孔樹脂解吸效果的影響見圖4。

圖4 乙醇體積分數對XAD-7HP大孔樹脂解吸效果的影響Fig.4 Effect of ethanol volume fraction on desorption effect of XAD-7HP macroporous resin

由圖4可知，XAD-7HP大孔樹脂的解吸率與乙醇體積分數呈正相關，當乙醇體積分數95%時，解吸率最大為（90.47±0.97）%。這是因為隨乙醇體積分數的增大，溶劑的極性減小，與樹脂的極性更加相近，余甘子多酚越容易從樹脂上洗脫下來。綜上所述，對XAD-7HP大孔樹脂進行解吸時所選乙醇溶液的體積分數為95%最佳。

3.3.4 解吸液pH值對XAD-7HP大孔樹脂解吸效果的影響

解吸液pH值對XAD-7HP大孔樹脂解吸效果的影響見圖5。

圖5 乙醇溶液pH值對XAD-7HP大孔樹脂解吸效果的影響Fig.5 Effect of pH value of ethanol solution on desorption effect of XAD-7HP macroporous resin

由圖5可知，XAD-7HP大孔樹脂隨著乙醇溶液pH值的增加，解吸率先增大后減小，pH值為7時，解吸率達到最大為（90.61±0.97）%；當乙醇溶液pH值大于7時，解吸率急速減小。造成此種現象一方面可能是在酸性條件下，溶液的極性較大，XAD-7HP大孔樹脂屬于弱極性，致使余甘子多酚不易脫離，導致解吸率較低；另一方面是在堿性條件下，余甘子多酚分子與堿發生反應，致使多酚含量減少，解吸率降低。所以，對XAD-7HP大孔樹脂進行解吸時所選乙醇溶液的pH值定為7最佳。

3.4 XAD-7HP大孔樹脂動態吸附-解吸結果與分析

3.4.1 上樣流速對XAD-7HP大孔樹脂吸附效果的影響

上樣流速對XAD-7HP大孔樹脂吸附效果的影響見圖6。

圖6 不同流速的動態吸附曲線Fig.6 Dynamic adsorption curves at different flow rates

樹脂進行動態吸附時，當流出液中多酚質量濃度為原液的10%時，定為泄漏點，即吸附終點，上樣液質量濃度為4 mg/mL。由圖6可知，當上樣流速分別為1、2、3、4、5 mL/min時，其泄漏點出現時上樣體積分別在400、310、210、150、95 mL。上樣流速過快，使大孔樹脂對余甘子多酚的吸附不充分，降低吸附效果，而上樣流速過低，會增加試驗周期。綜合以上因素，在XAD-7HP大孔樹脂對余甘子多酚進行動態吸附時上樣流速為2 mL/min最佳，此時最佳上樣體積為310 mL。

3.4.2 蒸餾水洗脫用量對除雜效果的影響

蒸餾水洗脫用量對除雜效果的影響見圖7。

圖7 水洗曲線Fig.7 Water washing curve

由圖7可知，隨著洗脫體積的增加多糖濃度減小，當洗脫體積為200 mL時，層析柱中多糖基本被洗凈，而此時流出液也基本為無色，說明未被吸附的余甘子多酚也被洗出。為了將未被吸附的余甘子多酚、多糖等雜質清洗干凈，水洗體積定為300 mL。

3.4.3 解吸流速對XAD-7HP大孔樹脂解吸效果的影響

解吸流速對XAD-7HP大孔樹脂解吸效果的影響見圖8。

圖8 解吸流速對洗脫效果的影響Fig.8 Effect of desorption flow rate on elution effect

由圖8可知，在相同吸附條件下，隨著洗脫流速的增加，余甘子多酚洗脫峰越寬，拖尾現象越重，使得解吸效果變差。而過快的洗脫流速會導致XAD-7HP大孔樹脂上的余甘子多酚不能充分溶解，使得洗脫體積增加，造成資源浪費。而洗脫流速過低會延長試驗周期，綜合考慮，對XAD-7HP大孔樹脂進行解吸時，洗脫流速定為2 mL/min，而此時的洗脫體積為280 mL。

3.5 余甘子多酚純化結果與分析

經顯色反應，測得余甘子粗凍干粉中多酚純度為16.45%，經上述工藝純化后多酚純度提高到60.67%，甘瑾等[20]使用NKA-II大孔吸附樹脂對余甘子多酚進行純化，純化后多酚純度為36.08%，與其相比，XAD-7HP大孔樹脂能夠有效提高余甘子多酚純度。

3.6 高效液相色譜儀分析純化后余甘子多酚組分結果與分析

純化后余甘子凍干粉經高效液相色譜分析，根據混合標準品出峰時間，余甘子多酚樣品中均有相應峰出現，具體見圖9、圖10。

圖9 混合標準品的HPLC色譜Fig.9 HPLC chromatogram of mixed standard

圖10 純化后余甘子多酚的HPLC色譜Fig.10 HPLC chromatogram of purified Phyllanthus emblica L.polyphenols

經測定，樣品中標準品的含量分別為沒食子酸72.179 mg/g、柯里拉京35.443 mg/g、柯子林鞣酸42.731mg/g、鞣花酸38.652mg/g。合計占總多酚31.15%，為余甘子中主要多酚類物質。

4 結論

研究比較了 X-5、D101、S-8、AB-8、D1400、XAD-7HP型大孔樹脂對余甘子多酚靜態吸附-解吸能力，篩選出XAD-7HP樹脂對余甘子多酚的純化效果最佳，并對其純化工藝進行優化。最佳純化工藝為上樣液濃度4 mg/mL、pH3、上樣體積 310mL、上樣液流速 2 mL/min，解吸時乙醇體積分數95%、體積280mL、流速2mL/min。

在此純化工藝條件下余甘子多酚純度由16.45%提升到60.67%，經HPLC法分析后，凍干粉中沒食子酸的含量為72.179 mg/g、柯里拉京的含量為35.443 mg/g、柯子林鞣酸的含量為42.731 mg/g、鞣花酸的含量為38.652 mg/g。本試驗可為余甘子多酚工業化生產和其深入研究提供參考。