天香丹對冠狀動脈微循環障礙大鼠微血管內皮結構及功能的影響

古麗葛娜·薩吾爾，劉 偉，馬學寬，安冬青，4

冠狀動脈微循環障礙(CMD)是導致心肌缺血的重要原因[1]。研究發現，CMD發病廣泛但尚缺乏有效治療方案[2]。CMD的發生主要是由于管徑<500 μm的冠狀動脈微血管結構或功能異常，導致冠狀動脈血流量減少，心肌灌注水平降低[3]。冠狀動脈微血管內皮細胞(CMECs)作為冠狀動脈微血管的主要組成部分，在維持微血管穩態方面具有重要作用[4]。天香丹為名老中醫經驗方，在治療冠心病方面具有較好效果。研究顯示，天香丹可改善冠心病病人心肌缺血癥狀，并保護血管內皮[5-6]，但其對CMD的作用機制尚未明確。本研究以CMD大鼠及CMECs損傷模型為研究對象，探討天香丹對CMD的內皮結構及功能的調節作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及細胞 選取雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠53只，體質量(200±20)g，隨機分為假手術組、模型組、天香丹低劑量組、天香丹中劑量組、天香丹高劑量組及尼可地爾組，每組8只。實驗大鼠均購自新疆醫科大學動物實驗中心，實驗環境為無特定病原體(SPF)級。本實驗通過倫理委員會批準(編號：IACUC-20170222027)。CMECs購自上海中喬新舟生物科技有限公司(貨號：ZQ0882)。

1.1.2 實驗藥品 天香丹顆粒購自新疆華世丹藥業有限公司(批號：新藥制字Z20040820，每袋9 g，含生藥量3.125 g，其藥物成分紅景天∶丹參∶新塔花∶降香為8∶8∶6∶3)；尼可地爾購自上海梯希愛公司。月桂酸鈉粉劑購自美國Sigma公司；脂多糖(LPS)購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.1.3 實驗試劑 一氧化氮(NO)檢測試劑盒購自碧云天生物科技有限公司；內皮素-1(ET-1)酶聯免疫吸附法(ELISA)試劑盒購自華聯生物有限公司；一抗內皮型一氧化氮合酶(eNOS)(ab5589)、一抗CD34(ab81289)、一抗β-actin(ab8227)均購自Abcam公司；二抗HRP標記山羊抗兔(PV6001)購自北京索萊寶公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物建模與給藥 大鼠適應性喂養1周后，用1%的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉全身，連接呼吸機輔助通氣。在胸骨左側第3肋、第4肋間打卡胸腔充分暴露心臟和主動脈，使用一次性BD胰島素針迅速將1 mL/kg的月桂酸鈉注入左心室(假手術組注入等量生理鹽水)，同時夾閉主動脈約10 s，關閉胸腔，加熱墊保持體溫，回籠復蘇。手術全程無菌操作并由操作熟練的兩名專業實驗員共同完成。術后連續3 d給予青霉素8×105U腹腔注射預防感染，術后隨機選5只模型大鼠，并取出心臟組織，以心肌組織石蠟切片HE染色法觀察到微血栓、微血管閉塞視為造模成功。造模完成后，根據體表面積法[7]，假手術組給予生理鹽水灌胃，每日2 mL；模型組給予生理鹽水灌胃，每日2 mL；天香丹低劑量組給予天香丹灌胃，每日0.81 g/kg；天香丹中劑量組給予天香丹灌胃，每日1.62 g/kg；天香丹高劑量組給予天香丹灌胃，每日3.24 g/kg；尼可地爾組給予尼可地爾灌胃，每日1.35 mg/kg。均連續給藥28 d。

1.2.2 心肌微血管超微結構觀察 將新鮮心肌組織約1 mm3切片并于2.5%戊二醛固定液中固定24 h后漂洗、固定、脫水、包埋、切片，在透射電鏡下觀察心肌內CMECs超微結構變化并采集圖像。

1.2.3 心肌微血管密度(MVD)測定 用大鼠心肌組織制作石蠟切片，用CD34免疫組化法標記冠狀動脈內皮細胞，通過計數棕色內皮細胞或內皮細胞簇的數量進行定量計算MVD，每個組織切片在放大400倍下隨機選取5個光學顯微鏡視野，取平均值作為各樣本的MVD。

1.2.4 脂多糖誘導的CMECs損傷模型建立及分組 用內皮細胞專用培養基培養CMECs，采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法確定脂多糖誘導的CMECs損傷及天香丹作用于CMECs的最佳濃度及時間。將細胞隨機分為4組，對照組：正常CMECs不進行任何干預；脂多糖組：脂多糖10 μg/mL干預24 h；天香丹組：天香丹50 μg/mL干預24 h；脂多糖+天香丹組：脂多糖10 μg/mL和天香丹50 μg/mL同時干預24 h。

1.2.5 NO、ET-1水平檢測 每組各取5只大鼠，腹主動脈取血，離心后分離血清，NO、ET-1試劑盒檢測血清NO、ET-1水平。收集CMECs各組細胞上清液，用NO檢測試劑盒檢測細胞上清液NO水平。所有操作均按照試劑盒操作說明進行，用酶標儀測定各孔吸光度，并根據標準曲線計算各組血清NO、ET-1濃度及細胞上清NO水平。

1.2.6 eNOS蛋白表達檢測 采用免疫組化法檢測心肌切片組織eNOS蛋白表達情況，每張切片隨機選取5個視野，以組織出現黃色或棕褐色區域判斷有陽性反應，采用Image-Proplus軟件進行分析。再從各組大鼠的心肌組織及各組CMECs中提取蛋白進行蛋白免疫印跡法檢測，進行電泳、轉膜、封閉、洗膜后，加入一抗eNOS(1∶1 000)、β-actin(1∶5 000)，4 ℃孵育過夜，相應二抗孵育后，加入ECL顯色液，凝膠成像系統曝光后，用Image J軟件進行eNOS蛋白定量分析。每項檢測重復4次。

1.3 統計學處理 采用SPSS 25.0軟件進行數據分析。定量資料多組間比較采用方差分析，若符合正態分布且方差齊，采用Tukey檢驗；若不符合正態分布或方差不齊時，采用Kruskal-Wallis檢驗或Brown-Forsythe檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠心肌微血管結構比較 假手術組大鼠心肌微血管基底膜正常，內皮細胞無腫脹、形態基本正常；模型組大鼠心肌微血管內皮細胞腫脹、胞質增厚，內質網腫脹，細胞核周隙明顯增寬，血管腔內存在血栓；天香丹低劑量組大鼠心肌微血管內皮細胞腫脹，內質網腫脹，但血管內無明顯血栓形成；天香丹中劑量組大鼠心肌微血管基底膜輕微皺縮，但內皮細胞形態無明顯腫脹，管腔內未見血栓；天香丹高劑量組心肌微血管內皮細胞無明顯腫脹或皺縮，形態大致正常，管腔內未見血栓；尼可地爾組心肌微血管基底膜可見皺縮，內皮細胞輕微腫脹，血管腔內未見血栓。由此可見，天香丹可能通過減輕微血管內皮水腫、減少微血栓而改善模型大鼠心肌微血管結構。詳見圖1。

圖1 各組大鼠冠狀動脈心肌微血管超微結構觀察

2.2 各組大鼠心肌MVD比較 與假手術組比較，模型組MVD明顯減少，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，天香丹中劑量組、天香丹高劑量組及尼可地爾組MVD增加，差異有統計學意義(P<0.05)，其中，天香丹高劑量組MVD增加最明顯。說明天香丹可增加CMD大鼠的微血管密度。詳見圖2、圖3。

圖2 各組大鼠心肌組織CD34免疫組化染色圖

與假手術組比較，＊ P<0.05；與模型組比較，# P<0.05。

2.3 各組大鼠NO、ET-1水平比較 與假手術組比較，模型組大鼠血清NO水平降低，ET-1水平升高，NO/ET-1明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05)，提示CMD大鼠模型有內皮功能損傷；與模型組比較，天香丹中劑量組、天香丹高劑量組及尼可地爾組NO水平及NO/ET-1明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。表明中、高劑量天香丹及尼可地爾對CMD大鼠內皮功能具有改善作用，其中天香丹中劑量組內皮功能改善效果更為明顯。詳見表1。

表1 各組大鼠血清NO、ET-1表達水平()

2.4 各組大鼠心肌eNOS蛋白表達比較 免疫組化結果顯示，eNOS主要在血管內皮及其周圍表達，且與模型組比較，天香丹中劑量組與尼可地爾組eNOS蛋白表達水平升高，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)，而與尼可地爾組比較，天香丹低劑量組eNOS水平明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)。蛋白免疫印跡法檢測顯示，與假手術組比較，模型組eNOS蛋白表達水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，天香丹中劑量組、天香丹高劑量組、尼可地爾組eNOS蛋白表達水平升高，差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。說明天香丹中、高劑量可增加大鼠心肌eNOS的表達，其表達水平與尼可地爾相當，提示中、高劑量天香丹可提高eNOS的表達以改善內皮功能。詳見圖4～圖7。

圖4 各組大鼠心肌組織eNOS免疫組化染色圖(×200)

與模型組比較，＊ P<0.05，# P<0.01；與尼可地爾組比較，△ P<0.05。

圖6 各組大鼠eNOS蛋白表達條帶圖

模型組與假手術組比較，＊ P<0.05；與模型組比較，#P<0.05，△ P<0.01。

2.5 各組CMECs上清液NO及細胞內eNOS蛋白表達水平比較 為進一步證實天香丹對微血管內皮功能保護作用，通過細胞實驗檢測天香丹干預CMECs后細胞上清NO水平及細胞內eNOS蛋白表達水平。結果顯示，與對照組比較，脂多糖組細胞上清液NO水平及細胞內eNOS蛋白表達水平均降低，差異均有統計學意義(P<0.01)；與脂多糖組比較，脂多糖+天香丹組NO水平、eNOS蛋白表達水平均升高，差異均有統計學意義(P<0.01)。說明天香丹可促進CMECs細胞內eNOS表達及NO的釋放，從而改善內皮功能。詳見圖8～圖10。

脂多糖組與對照組比較，＊ P<0.01；與脂多糖組比較，# P<0.01。

圖9 各組CMECs上清液細胞內eNOS蛋白表達條帶圖

脂多糖組與對照組比較，＊ P<0.01；與脂多糖組比較，# P<0.01。

3 討 論

CMD是冠心病的重要發病機制[8]。通過正電子發射斷層掃描檢測1 218例存在心絞痛病人的冠狀動脈微血管灌注情況的研究顯示，約51%的男性和54%的女性都患有CMD[9]。有研究表明，心絞痛病人存在CMD會使不良心血管事件的風險明顯增加[10]。因此，CMD的積極防治對心血管疾病的預防具有重要意義。CMD是由多種因素相互作用而造成的冠狀動脈微血管結構或功能異常[11]，其結構異常包括微血管內皮腫脹、破裂或微血管直徑或密度改變等[12-13]，功能異常則以內皮功能障礙最為常見[14]，主要表現為血管舒張因子與收縮因子分泌不平衡，導致微血管痙攣、血流量減少、心肌灌注水平降低[15-16]。eNOS是血管壁中NO的主要來源，具有調節微血管舒張功能的作用，保護血管內皮的完整性[17]。研究顯示，與大動脈比較，小動脈eNOS蛋白含量明顯增加[18]，eNOS水平對維持冠狀動脈微血管正常功能具有重要作用。

CMD在中醫學中屬“胸痹”范疇，心絡氣血生成不足或氣血運行不暢，心失濡養，痰瘀內阻，血脈不通，發為胸痹。本病多為本虛標實之證，故治療以益氣活血為主。如顏德馨教授經驗方益心湯以黃芪、黨參益氣養心為君，輔以葛根、川芍、丹參、赤芍、降香等以活血通脈[19]。吳以嶺教授的通心絡膠囊以人參為君補益氣血，而又以水蛭、赤芍等藥物化瘀通絡，仍以“益氣活血通絡”為治療核心[20]。因此，益氣、活血并進，標本兼顧是CMD中醫治療的重要原則。

天香丹由紅景天、丹參等中藥組成，補心肝之血，肺、脾、腎精元之氣，開泄水飲痰濁瘀血。研究表明，天香丹可保護血管內皮功能、抑制炎癥反應、減少血栓形成[21-22]。本研究結果顯示，天香丹可減輕微血管內皮細胞腫脹，減少微血栓，增加心肌MVD，還可通過增加eNOS的蛋白表達及NO的分泌，改善CMD大鼠的內皮功能。

綜上所述，本研究從動物及細胞水平證明了天香丹對心肌微血管結構及內皮功能的保護作用，為天香丹防治CMD提供了客觀依據。在后續研究中還需從天香丹改善內皮功能障礙的內在機制角度進行進一步深入探討。