炎性小體與缺血性腦卒中發(fā)病及中醫(yī)相關機制的研究進展

蘇 鈺，朱文浩

全球疾病負擔研究(GBD)顯示，我國總體腦卒中終生發(fā)病風險為39.9%，位居全球首位，也是我國疾病所致壽命損失的首位病因[1]。缺血性腦卒中導致腦組織缺血，神經元細胞無法維持正常的跨膜離子梯度和平衡，從而導致細胞凋亡、興奮性毒性、氧化應激和炎癥等一系列細胞死亡的發(fā)生[2]。炎癥反應研究是當前腦卒中研究的熱點之一。

“炎性小體”一詞由Tschopp Jürg博士等在2002年首次提出[3]，并將炎性小體描述為一個“Caspase激活復合物”，由半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)、Caspase-5、Pycard(Caspase相互作用域)和NALP1(NLRP1的舊名稱)組成，該復合物負責促炎性因子白細胞介素-1β(IL-1β)的成熟[4]。在先天免疫系統(tǒng)參與免疫應答時，當檢測到微生物成分或內源性損傷信號后，由模式識別受體(PRR)識別病原體相關分子模式和危險相關分子模式(PAMPs和DAMPs)，觸發(fā)啟動下游信號級聯(lián)反應，調節(jié)各種免疫應答，并導致形成一個稱為炎性小體的多蛋白復合體[5]。炎性小體主要是由不同的受體蛋白(如NLRP1、NLRP3、NLRP4和AIM2等)、銜接蛋白[凋亡相關斑點樣蛋白(ASC)]和效應蛋白半胱氨酸蛋白酶-1前體(pro-Caspase-1)組成的多蛋白復合體[6]。炎性小體的傳感器通過ASC的胱天蛋白酶募集結構域(CARD)招募pro-Caspase-1形成炎性小體，隨后促炎性因子白細胞介素-1β前體(pro-IL-1β)和白細胞介素-18前體(pro-IL-18)可被Caspase-1裂解為促炎癥分子的活性形式，啟動下游信號通路，引發(fā)炎癥反應[7-8]。研究顯示,炎性小體在缺血性腦卒中后的炎癥反應中有關鍵作用。本研究對NLRP3炎性小體、NLRP1炎性小體、NLRP4炎性小體和AIM2炎性小體的結構組成、激活模式及在缺血性腦卒中發(fā)病機制中的作用進行論述。

1 NLRP3炎性小體

1.1 NLRP3炎性小體的結構與組成 NLRP3炎性小體由NLRP3受體、ASC、pro-Caspase-1 三部分組成。NLRP3受體包括3個結構域：包含C-端的亮氨酸重復序列(LRR)、中心的核苷酸寡聚化(NACHT)結構域、N-端的熱蛋白(PYD)結構域和胱天蛋白酶募集(CARD)結構域[9]。

1.2 NLRP3炎性小體的激活 在健康的細胞條件下，由于NACHT結構域和LRRs之間的內部相互作用，NLRP3被自動抑制[10]。在檢測到細胞應激后，NLRP3的NACHT結構域之間通過同型交互作用寡聚，其PYD與含有ASC的PYD結構域相互作用，之后ASC又通過CARD/CARD交互招募pro-Caspase-1[10]。最后，pro-Caspase-1自我切割并形成活性Caspase-1，并介導成熟的、具有生物活性的細胞因子參與免疫防御[5]。

NLRP3炎性小體的組裝和下游信號的激活依賴于兩種與細胞損傷相關的互補信號：一種啟動信號，需要通過核轉錄因子-κB(NF-κB)和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路上調NLRP3炎性小體復合物蛋白、pro-IL-1β及pro-IL-18[11]；第二種信號導致NLRP3激活和ASC磷酸化，從而觸發(fā)其組裝到NLRP3炎性小體復合物中[12]。NLRP3對一系列不同的物質刺激產生反應，這些物質包括晶體和顆粒物質(如尿酸晶體、二氧化硅、石棉和明礬)、細胞外ATP、成孔毒素、RNA-DNA雜交體以及幾種病毒、細菌、真菌和原生動物病原體[13]。NLRP3受體可以感受到動態(tài)平衡的紊亂，并通過以下幾個過程做出反應自大多數是相互協(xié)同不排斥的：①胞漿中低K+濃度可觸發(fā)NLRP3活化；②胞內Ca2+積累可誘導有害信號通路，激活NLRP3炎性小體；③溶酶體不穩(wěn)定可刺激組織蛋白酶釋放，誘導NLRP3活化；④線粒體損傷誘導的活性氧(ROS)生成可激活NLRP3，損傷線粒體DNA[14]。此外研究發(fā)現(xiàn)，蛋白激酶7(PK7)對于NLRP3的激活是必不可少的，并且作用于鉀外流的下游[13]。

1.3 NLRP3炎性小體在缺血性腦卒中的作用 缺血性腦卒中有關炎性小體的研究眾多，其中對NLRP3炎性小體的研究最為廣泛深入。目前，主流觀點認為NLRP3炎性小體誘導急性缺血性腦卒中的神經炎癥[15]，在腦卒中神經元細胞死亡和行為缺陷中發(fā)揮主要作用[16]。NLRP3可產生眾多促炎細胞因子，介導神經細胞功能障礙和腦水腫，一旦激活最終導致神經細胞死亡[14]。通過研究短暫性大腦中動脈閉塞(tMCAO)小鼠模型發(fā)現(xiàn)，NLRP3缺失可保護小鼠免受缺血性腦損傷，減少梗死體積和水腫形成，保持血腦屏障(BBB)的通透性，減少炎癥反應[17]。因此，NLRP3炎性小體被認為是治療腦缺血再灌注時腦水腫的重要靶點。實驗顯示，NLRP3炎性小體特異性抑制劑MCC950具有抑制NLRP3炎性小體擴大梗死區(qū)水通道蛋白4(AQP4)的表達和分布的作用[18]。

隨著NLRP3炎性小體在臨床中的應用逐步深入，有關NLRP3炎性小體在缺血性腦卒中疾病中的激活通路和參與組成有了進一步的研究。在缺血條件下初級皮質神經元和腦組織，NF-κB和MAPK信號通路在NLRP1和NLRP3炎性小體的表達和激活中發(fā)揮了關鍵作用[19]。腦卒中后炎癥誘導受體互相作用蛋白3(RIP3)/混合譜系激酶區(qū)域樣蛋白(MLKL)信號通路的激活，而MLKL觸發(fā)NLRP3炎性小體，另外缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)也參與了RIP3/MLKL通路，HIF-1α的表達在缺血性腦卒中后增加[20]。研究表明，布魯頓酪氨酸激酶(BTK)是NLRP3炎性小體的重要組成部分，是NLRP3炎性小體活化所必需的，并可能是缺血性腦卒中的有效治療靶點[21]。重組骨橋蛋白(OPN)能夠縮小大鼠缺血性梗死面積，減輕腦缺血損傷，這可能與其參與炎性小體和小膠質細胞炎癥激活的抑制調節(jié)有關[22]。NLRP3炎性小體除了可作為治療靶點，對于急性缺血性腦卒中病人的預后同樣具有一定的臨床應用價值。NLRP3炎性小體是腦梗死病人早期神經功能恢復不佳的危險因素[23]。NLRP3炎性小體參與了急性缺血性腦卒中的炎癥級聯(lián)放大[24]，NLRP3炎性小體表達越高，則病人早期神經功能恢復情況愈差。此外，NLRP3炎性小體組分基因的基因型組合CARD8 rs2043211/NLRP3 rs 10754558AT/CG，是動脈粥樣硬化血栓型缺血性腦卒中的危險因素[25]。NLRP3炎性小體蛋白編碼基因中的核苷酸變異可能對缺血性腦卒中有重要影響，攜帶雜合子的CARD8 rs2043211和NLRP3 rs10754558的男性患缺血性腦卒中的風險更高[26]。

也有研究對于NLRP3炎性小體在缺血性腦卒中的主導地位提出質疑。Sch?lwer等[27]認為，NLRP3在缺血刺激后的炎癥反應中起次要作用，在缺血后的吞噬作用調節(jié)中有關鍵作用。ASC以NLRP3依賴的方式在持續(xù)性炎癥的擴散中發(fā)揮關鍵作用，這可能是腦卒中復發(fā)的原因之一[28]。但Denes等[29]研究認為，NLRC4和AIM2炎性小體參與了急性缺血性腦損傷，這與ASC有關，但NLRP3不參與。Lemarchand等[30]用抑制劑MCC950靶向NLRP3或使用敲除NLRP3的小鼠發(fā)現(xiàn)其對腦卒中引起的損傷程度沒有影響，表明NLRP3通路并沒有促進炎癥加劇缺血性腦損傷。

2 NLRP1炎性小體

2.1 NLRP1炎性小體的結構與組成 NLRP1炎性小體由4部分胞質成分組成[31]：NLRP1受體、ASC(有Caspase募集域的凋亡相關斑點樣蛋白)、pro-Caspase-1、半胱氨酸蛋白酶-4前體和半胱氨酸蛋白酶-5前體(pro-Caspase-4和pro-Caspase-5)。NLRP1受體包含5個特征性的結構域：N-末端PYD、中央的NACHT、LRRs、FIIND(未發(fā)現(xiàn)功能的區(qū)域)和C-末端的CARD[3]。

2.2 NLRP1炎性小體的激活機制 NLRP1炎性小體的激活形成機制主要有2種模式[31]：NLRP1受體的C-末端的CARD域在缺少調控蛋白ASD的情況下可以直接與pro-Caspase-1相互反應；NLRP1受體的N-末端PYD域趨近與下游同型的調控蛋白ASD的PYD域進行蛋白質-蛋白質相互作用，經由ASD的CARD域連接于pro-Caspase-1的CARD域。

2.3 NLRP1炎性小體在缺血性腦卒中的作用 在缺血條件下的初級皮質神經元和腦組織中，NF-κB和MAPK信號通路為NLRP1和NLRP3炎性小體的表達和激活發(fā)揮了關鍵作用[18]。效應分子Caspase-1是NLRP1的下游靶點，異丙酚通過抑制NLRP1-Caspase-1-Caspase-6的炎癥通路，在腦卒中中發(fā)揮神經保護作用[32]。研究結果顯示，MCAO大鼠的NLRP1炎性小體水平升高，包括NLRP1受體、ASC和pro-Caspase-1，誘導切割的Caspase-1、成熟的IL-1β和IL-18水平升高[33]。

3 AIM2炎性小體

3.1 AIM2炎性小體的結構與組成 AIM2炎性小體是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種模式識別受體，屬于與免疫反應相關的HIN-200(具有200氨基酸重復序列的造血干擾素誘導核蛋白)蛋白家族的一員，因其最先是在黑色素瘤細胞株中發(fā)現(xiàn)并分離出來，且由于其在黑色素瘤細胞中的表達缺失造成了細胞增殖，因此將其命名為黑色素瘤缺乏因子2炎性小體[34]。AIM2受體是PYHIN(包含PYRIN和HIN結構域)家族成員，具有一個N端PYD和一個C端HIN結構域，后者由一對緊密排列的寡核苷酸或寡糖組成[17]。

3.2 AIM2炎性小體的激活 研究表明，細菌激活AIM2炎性小體需要溶解胞漿中的塔拉弗朗西斯菌亞種或單核細胞增生李斯特菌等[35-36]。AIM2炎性小體是一種模式識別受體，在受到特異性信號刺激后，產生炎性小體復合物，進而活化Caspase-1，活化的Caspase-1可裂解前體IL-1β和IL-18，從而導致IL-1β和IL-18的成熟和釋放，誘導細胞焦亡的發(fā)生[37]。AIM2炎性小體也可能直接參與神經元細胞的死亡，培養(yǎng)的胚胎大鼠皮層神經元在受到AIM2激活劑poly(dA：dT)的刺激時，發(fā)生了依賴于AIM2炎性小體的細胞死亡[29]。

Adamczak等[38]提出了一種AIM2炎性小體激活并焦亡神經元的機制：AIM2炎性小體在細胞核內聚集，經宿主或病原DNA激活后，AIM2寡聚并激活ASC，激活細胞核內Caspase-1；ASC從炎性小體中解離并轉移到細胞質中，在細胞質中低聚成焦磷酸體，并激活Caspase-1，活性Caspase-1裂解炎性細胞因子，打開泛連接蛋白-1(Pannexin-1)孔隙，誘導細胞焦亡。

3.3 AIM2炎性小體在缺血性腦卒中的作用 研究表明，AIM2炎性小體與腦卒中后的腦損傷有相關性[38]，AIM2可能是缺血性腦卒中潛在的治療靶點。急性腦梗死病人血漿AIM2表達水平越高，其神經功能缺損越嚴重，腦梗死面積越大，預后更差[37]。通過建立MCAO大鼠模型和體外缺氧葡萄糖剝奪再灌注(OGD/R)處理的神經細胞模型，表明AIM2炎性小體通過母系表達基因3(MEG3)/miR-485/AIM2軸激活腦缺血-再灌注損傷期間的Caspase-1信號參與細胞焦亡[39]。Roth等[40]研究發(fā)現(xiàn)，腦卒中誘導表達Fas蛋白的天然配體(FasL)的單核細胞群，導致外部T細胞凋亡，在感測無細胞DNA之后，由AIM2依賴性IL-1β分泌驅動。腦內皮細胞可通過信號轉導與轉錄激活因子3(STAT3)信號通路依賴的方式抑制細胞間黏附分子-1(ICAM-1)表達和中性粒細胞黏附，至少部分通過調節(jié)STAT3的激活來抑制AIM2炎性小體，保護缺血性腦卒中后BBB的完整性，從而逆轉缺血誘導的BBB損傷[41]。

4 NLRP4炎性小體

NLRC4炎性小體介導缺血性卒中后的小膠質細胞凋亡和焦亡[42]。通過使用嚙齒動物腦卒中模型，發(fā)現(xiàn)NLRC4炎性小體和AIM2炎性小體造成腦損傷[29]。雖然對于NLRP4炎性小體與缺血性腦卒中的激活機制研究較少，但研究證明NLRP4炎性小體是心臟炎癥的重要負性調節(jié)因子[43]，通過TANK結合激酶1(TBK1)/干擾素調節(jié)因子3(IRF3)和IκB活激酶復合物(IKK)/NF-κB信號通路負調控，其對于缺血性腦卒中的激活機制需進行進一步探索。

5 中藥通過干預炎性小體治療缺血性腦卒中的相關機制

中醫(yī)對于治療缺血性卒中有著一定優(yōu)勢，關于中藥治療缺血性腦卒中與炎性小體之間的相關機制已有初步探索。Arcctigenin(ARC)是牛蒡子中提取的一種苯基丙酸二芐基丁內酯木脂素，通過激活大腦中的沉默信息調節(jié)因子1(SIRT1)信號，抑制缺血性腦卒中誘導的NLRP3炎性小體激活及IL-1β、IL-18分泌，減輕缺血性腦卒中誘發(fā)的神經炎癥，提供神經保護作用[44]。綠根皂苷元是從麥冬中提取的一種重要的甾體皂苷元，能抑制NLRP3的表達，降低OGD/r誘導的ROS的生成，抑制了MAPK通路，減輕腦缺血誘導的血腦屏障功能障礙[45]。川芎嗪是提取于中藥飲片川芎的無色針狀結晶，川芎嗪具有改善腦缺血再灌注損傷(CIRI)大鼠神經功能缺損癥狀，控制梗死灶擴大，抑制炎性因子分泌的作用[46]。大黃酚是從大黃屬植物中提取，全身給藥可有效抑制腦缺血/再灌注期間的神經損傷和組織損傷，且呈劑量依賴性，能抑制NLRP3炎性小體的激活，對缺血性腦卒中具有保護作用[47]。紅花黃素是一種從紅花中提取的黃酮類化合物，實驗顯示其能使含有NLRP3炎性小體信號通路的皮層NF-κB/NLR家族pyrin域失活性，并降低血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-1β和IL-6濃度，減輕大鼠腦缺血再灌注損傷及炎癥反應[48]。人參首烏提取物通過抑制大鼠缺血性腦卒中后Toll樣受體4(TLR4)/NF-κB/NLRP3信號通路，增強神經和血管再生[49]。基于網絡藥理學篩選丹參-紅花藥對配伍抗缺血性腦卒中的成分靶點、作用靶點，并實驗證明該配伍能夠通過NF-κB信號通路下調NLRP3炎性小體的釋放，阻斷炎癥損傷環(huán)節(jié)，最終達到抗炎性損傷的作用[50]。片仔癀對腦缺血再灌注損傷大鼠的神經元凋亡具有顯著的抑制作用，通過腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/自噬起始復合物(ULK1)信號通路增強自噬，減輕NLRP3炎性小體相關神經炎癥[51]。同樣，清開靈(QKL)通過抑制AMPK介導的NLRP3炎性小體的激活，緩解腦缺血再灌注損傷，抑制炎癥反應[52]。人參、當歸合用通過抑制NLRP3炎性小體和小膠質細胞焦亡，對短暫性MCAO大鼠缺血性損傷起到神經保護作用[53]。研究發(fā)現(xiàn)，在OGD條件下清腦滴丸可抑制MCAO大鼠和人神經母細胞瘤細胞株(SH-SY5Y)中NLRP3炎性小體的表達，可降低由NLRP3炎性小體介導并在MCAO大鼠中升高的炎性細胞因子IL-1β和IL-18水平，表明其可能通過NLRP3炎性小體介導的機制保護神經元[54]。

6 小 結

近年來，炎性小體與缺血性腦卒中的相關性研究越來越廣泛，越來越多的炎性小體被證明與缺血性腦卒中發(fā)病關系密切，其發(fā)病機制的相關性逐漸明晰，并逐步開始靶點治療的研究。現(xiàn)在已有針對單個靶點的研究，但對缺血性腦卒中發(fā)病后的整體生理調節(jié)網絡的研究仍較不足。炎性小體與缺血性腦卒中發(fā)病及中醫(yī)治療缺血性腦卒中與炎性小體的機制處于初步探索階段，仍需進一步深入研究。