UPLC-MS/MS對腎陽虛原發性骨質疏松臨床代謝標志物篩查研究

郭勝男 戚曉楠 姚嘯生 任路* 陳文娜*

1.遼寧中醫藥大學，遼寧 沈陽 110847 2.遼寧中醫藥大學附屬醫院，遼寧 沈陽 110000

原發性骨質疏松癥(primary osteoporosis，POP)是一種常見的骨科疾病，其特征表現為慢性的骨密度下降，骨微結構退化及低創傷性骨折風險增加。中醫將其歸屬于“骨痿”、“骨枯”等范疇。利用超高效液相色譜-串聯質譜 (ultra performance liquid chchromatography/tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS)法研究中醫“證候”的代謝物差異，為建立基于證型的客觀標準和物質量化指標提供了客觀依據。本研究旨在通過家系隊列，開展POP中腎陽虛證型的代謝組學研究，為中醫藏象學說在臨床辨證論治相關疾病提供依據。

1 材料和方法

1.1 一般資料

于2019年5月1日至2021年7月31日期間，在遼寧中醫藥大學附屬醫院骨傷科門診和病房收集符合腎陽虛POP的患者，建立家系隊列。要求同時滿足POP且為腎陽虛的患者作為先證人，通過先證人聯系其一級家屬(父母、子女、同胞)，如其一級家屬也同時患有POP且為腎陽虛，其所在家族可納入家系隊列。共收集到20例腎陽虛POP患者作為疾病組(DO組)；先證人配偶所在家系中排除POP或腎陽虛證的健康者12例作為對照組(CN組)，其資料情況見表1。

1.2 病例診斷標準

1.2.1西醫診斷標準：滿足其中任何一項均可診斷。①中軸骨或非優勢側橈骨遠端1/3骨密度的T值≤-2.5；②-2.5

1.2.2中醫辨證分型標準：同時符合以下3項方可確診。①依據國家中醫藥管理局發布的《中醫臨床診療術語》的證候分型標準確診為腎陽虛證；②依據中華中醫藥學會《中醫體質分類與判定自測表——陽虛質》量表評分測定，轉化分數>30分可確診；③由3名副高級職稱以上中醫醫師獨立辨證，至少需兩名醫生診斷“腎陽虛證”可確診。

1.3 納入標準

①符合入選先證家系；②符合POP西醫診斷標準者；③證候為腎陽虛證者；④臨床病史及檢驗資料相對完整者；⑤受試者知情同意并簽署知情同意書。

1.4 排除標準

①可能影響體內骨代謝的相關疾病，如惡性腫瘤、內分泌疾病等；②當前或過去存在血液、腎臟、肝臟、精神或神經系統疾病者；③長期服用影響骨代謝的藥物(如糖皮質激素)者。

1.5 倫理審批

本研究經遼寧中醫藥大學附屬醫院醫學倫理委員會批準同意實施[編號為2019064FS(KT)-040-02]。

1.6 UPLC-MS/MS采集條件

UPLC-MS/MS采集檢驗系統包括超高效液相色譜和串聯質譜。T3液相使用沃特世ACQUITY UPLC?HSS T3 色譜柱(1.8 μm，1 mm×100 mm)。流動相的柱溫設置為40 ℃，使用0.4 mL/min流速運行，A相為超純水，B相為乙腈，各含0.1 %甲酸。Amide液相使用沃特世ACQUITY UPLC?BEH Amide色譜柱(1.7 μm，2.1 mm×100 mm)。A相為含甲酸銨(20 mmol/L)和氨(0.4 %)超純水，B相為純乙腈，運行流速、柱溫與T3液相相同。質譜采集時電噴霧離子源溫度設為500 ℃，質譜電壓正極為5 500 V，負級為4 500 V。離子源氣體1流速設為55 Psi，氣體2流速設為60 Psi，氣簾氣設為25 Psi，并設高參數的碰撞誘導電離。

1.7 統計學處理

2 結果

2.1 代謝組學的質控分析

質譜檢測結果顯示，質控樣本總粒子流曲線相互重疊性高，見圖1。結果表明各峰的響應強度和保留時間基本重疊，說明在整個實驗過程中儀器偏差引起的變異較小，反映本研究使用的儀器穩定性較高，實驗結果的準確性和可重復性較好。

圖1 質控樣本質譜檢測總粒子流重疊圖Fig.1 Figure of quality control sample mass spectrometry detection

分組主成分分析結果顯示DO組和CN組之間代謝物有分離趨勢，見圖2和圖3。而偏最小二乘判別分析(partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA)模型得分圖(圖4)顯示，DO組和CN組發生了明顯的分離。其中模型置換測試參數R2X (cum) = 0.392，R2Y (cum) = 0.989，Q2(cum) =0.711，提示該模型是有效的。

圖2 分組主成分分析圖Fig.2 Map of principal component analysis

圖3 分組主成分分析三維圖Fig.3 Three-dimensional map of principal component analysis

圖4 偏最小二乘判別分析圖Fig.4 Map of PLS-DA score S-plot

2.2 差異代謝物的篩選

利用PLS-DA和其正交信號的結果初步篩選出差異代謝物，VIP值≥1的代謝物以紅色圓點表示，<1的代謝物以綠色圓點表示，見圖5。進一步以VIP>1，P<0.05，FC≥1.2或≤0.65為條件，共篩選出157個差異性代謝物。

圖5 正交偏最小二乘判別分析圖Fig.5 Map of OPLS

對篩選的差異代謝物原始相對含量采用標準化處理，通過R軟件繪制熱圖，結果見圖6。腎陽虛POP患者血清γ-氨基丁酸、犬尿酸、尿黑酸、L-異亮氨酸、黃嘌呤、鳥苷、腺苷、十二烷二酸、肉堿 C18∶3等93個代謝物上調，谷氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、肌氨酸、苯乙酰甘氨酸、3-羥基馬尿酸、苯乙酰甘氨酸等64個代謝物下調。

2.3 KEGG通路富集分析

分析發現腎陽虛POP患者血清差異代謝物主要參與色氨酸代謝、谷胱甘肽代謝、磷脂酶D信號通路、精氨酸和脯氨酸代謝、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝等信號通路，結果見圖7。

圖7 腎陽虛POP的差異代謝物KEGG富集圖Fig.7 KEGG enrichment map of different metabolites in Yan deficiency syndrome of primary osteoporosis

3 討論

本研究采用家系隊列的研究方法，先建立腎陽虛家系隊列，再進行病例納入，以此造成了兩組間性別和年齡的分布差異。與CN組比較，DO組中女性數量占比較多，年齡增高，該特征與臨床腎陽虛POP患者以老年女性居多的流行病學調查結果相一致[1]。

腎主骨生髓，與骨骼的生長發育密切相關。研究發現，POP存在氨基酸和脂質方面的代謝變化[2-3]。Zhao等[4]發現去卵巢骨質疏松小鼠模型中氨基酸和核苷酸代謝下調，而脂質代謝上調。本研究經UPLC-MS/MS法篩選出157個血清差異代謝物，氨基酸、有機酸、甘油磷脂和核苷酸及其代謝產物是其主要差異代謝物種類。

3.1 氨基酸及其代謝產物

POP存在一定程度的氨基酸代謝紊亂。精氨酸、亮氨酸、脯氨酸和苯丙氨酸均能促進胰島素分泌，增強胰島素樣生長因子-1的作用，促進成骨細胞的增殖和分化[5-6]；脯氨酸、苯丙氨酸可抑制破骨細胞生成，減少POP中的骨吸收[7]。谷氨酸可通過與破骨細胞表達的谷氨酸受體結合促進骨吸收，谷氨酰胺升高則與低骨礦物質密度呈正相關[8-9]。尿黑酸中黑色素過量沉積可引起關節的炎癥反應和退行性病變，出現廣泛的椎間盤層狀鈣化和POP[10]。本研究發現，在DO組，谷氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸和天冬氨酸水平降低，尿黑酸、γ-氨基丁酸增多。

纈氨酸可增強腸道對鈣的吸收，提高機體血清鈣水平。纈氨酸代謝紊亂在POP的發生發展中起一定作用，纈氨酸轉氨酶缺陷可能為POP的潛在因素[9]。雖然亮氨酸與纈氨酸的吸收速度類似，但You等[9]認為POP患者不存在亮氨酸的異常代謝情況，這與本研究的結果不一致。

現有研究[11]認為，腎陽虛與神經-內分泌系統聯系密切。腎陽虛患者常表現為四肢不溫、言語無力、易疲勞、夜尿頻多，性欲減退，面色發白，脈沉遲無力，這與交感神經功能不足的臨床表現相似。丙氨酸還可轉化生成苯乙酰甘氨酸，與腎上腺素受體結合興奮交感神經[12]。本研究發現，DO組中苯乙酰甘氨酸水平降低，與張愛華[13]研究結果一致。以上結果顯示，腎陽虛可能與苯乙酰甘氨酸下調以及腎上腺素受體結合能力降低有關，此觀點有待于進一步研究證實。

肌氨酸在骨骼肌的能量代謝中發揮重要作用。犬尿喹啉酸又稱犬尿酸，其在脂肪組織中具有提高機體能量利用、刺激脂肪代謝和產熱的功能。在本研究中，DO組內血清肌氨酸含量減少，犬尿酸含量增多，提示腎陽虛POP患者骨骼肌供能可能相對不足，這與齊敏瑞等[14]的研究結果相一致。肌氨酸和犬尿酸還可以影響神經系統。肌氨酸紊亂與精神疾病的發生有關，而腦內犬尿酸累積會擾亂睡眠，引起意識紊亂[15-16]。同時，谷氨酸和天冬氨酸是中樞神經系統的興奮性氨基酸，而γ-氨基丁酸是腦內主要的抑制性神經遞質。在本研究中涉及能量代謝和影響神經系統的這些差異代謝物可能對解釋腎陽虛的本質有一定意義。

3.2 脂質及其代謝產物

POP的發生發展與脂質代謝失調密切相關[9,17-19]。尹恒等[3]發現小鼠股骨骨質疏松的發生與脂質變化相關，表現為脂肪?；?、甘油脂、甾醇、一些甘油磷脂和神經酰胺增加，另一部分甘油磷酸膽堿和鞘脂類則呈下降趨勢。脂質增加可激活核轉錄因子(過氧化物酶體增殖物激活受體γ)，抑制成骨細胞分化[20-22]。POP小鼠血漿溶血磷脂酰膽堿和ROS顯著上調，氧化應激損傷導致骨質丟失和骨脆性增強[23-24]。絕經期骨質疏松小鼠鞘磷脂明顯減少，鞘糖脂和神經酰胺增加，表明鞘脂代謝失調與骨代謝異常密切相關[25]。此外，維生素D3及其產物和甾醇酯類似物增加可促進骨吸收，導致POP[26]。在本研究中，腎陽虛POP患者血清游離脂肪酸包括十二烷二酸、肉堿 C18∶3等增多，其具體機制不清。

3.3 核苷酸及其代謝產物

在核苷酸物質中，黃嘌呤和次黃嘌呤是嘌呤核苷酸的代謝過程中的中間產物，尿苷和胞苷則存在于嘧啶代謝途徑中。本研究中，腎陽虛POP患者血漿黃嘌呤含量顯著上升，提示組織中上游次黃嘌呤堆積，DNA合成速度緩慢。以此推測，腎陽虛患者疲勞、嗜睡與虛弱癥狀可能與氨基酸化合物消耗增加，核酸合成緩慢相關。

4 結語

代謝組學研究能夠全面、綜合、動態地檢測出生物體內的代謝物質變化，這些檢測特性與整體、辨證和恒動的中醫基礎理論具有一致性，能為中醫診療提供啟發性的思路和方法。利用代謝組學方法研究“證”引起的代謝物變化，為建立基于證型的客觀標準和物質量化指標提供了客觀依據。本研究篩選出的血清差異代謝標志物，有利于腎陽虛POP發病機制的進一步研究，為尋找中醫腎陽虛證的生物學本質提供了理論依據。