基于GEO差異分析及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究銀杏葉治療肺間質(zhì)纖維化的作用機制*

程雨馨，周思琪，張興彩

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟南 250000；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟南 250000)

肺間質(zhì)纖維化((pulmonary fibrosis，PF)又稱為彌漫性間質(zhì)性肺疾病或肺間質(zhì)性疾病，特征是彌漫性肺泡炎和肺泡結(jié)構(gòu)的破壞。病因和發(fā)病機制尚不完全清楚，亦未有明確有效的治療手段，為呼吸系統(tǒng)難治性疾病[1]。一直以來關(guān)于肺間質(zhì)纖維化的治療方案討論甚多，以其中最多發(fā)的特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化(IPF)尤為多見，中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會問質(zhì)性肺疾病學(xué)組發(fā)布的《特發(fā)性肺纖維化診斷和治療中國專家共識》中指出，非藥物治療包括戒煙、氧療、機械通氣、肺康復(fù)手段、肺移植手術(shù)；在藥物治療方面明確指出IPF尚無肯定顯著有效的治療藥物，僅推薦根據(jù)實際情況酌情使用吡非尼酮、尼達尼布、抗酸藥物、N-乙酰半胱氨酸。糖皮質(zhì)激素聯(lián)合硫唑嘌呤和N-乙酰半胱氨酸曾經(jīng)被認為是IPF的“標準治療”，但因缺乏理論依據(jù)，現(xiàn)已不推薦應(yīng)用于穩(wěn)定期IPF患者，現(xiàn)有治療方案下，唯有實施肺移植手術(shù)，可以使具有適應(yīng)證的IPF患者生存年限增加，但是由于手術(shù)較難、供體稀缺、生存率不確定、價格高昂等各種因素，導(dǎo)致肺移植在臨床的難以實施[2]。因此，發(fā)現(xiàn)以及研制切實有效的新藥物勢在必行。

有學(xué)者認為，本病多因陽氣虛弱或肝腎不足，風寒濕等邪氣痹阻，病邪在表不解而成“肺痹”[3]，這與古人對痹證總屬經(jīng)絡(luò)壅閉、氣血不行的病機吻合。病機是致病因素侵入體內(nèi)，損傷正氣，正虛不運，痰瘀內(nèi)生，蘊久化熱，進一步損傷正氣。素體虧虛，再加之長期應(yīng)用激素，機體防御功能低下，更難以抵御外邪，反復(fù)損傷正氣，從而惡性循環(huán)，形成邪實正虛的局面[4]。

近些年來，因中醫(yī)藥不良反應(yīng)少，且在免疫調(diào)節(jié)、綜合調(diào)理等方面也具有明顯優(yōu)勢，越來越多的學(xué)者開始研究利用中醫(yī)藥治療肺間質(zhì)纖維化。中西結(jié)合、綜合診療，已經(jīng)成為治療肺間質(zhì)纖維化的一個新方向。其中，銀杏葉的性味歸經(jīng)、功效作用，都非常符合“肺痹”的治療原則。銀杏葉為銀杏科銀杏屬植物銀杏Ginkgo biloba L.的干燥葉，最早記錄于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其味甘、苦、澀，性平，具有止咳、平喘、潤肺等功效。銀杏葉歸肺經(jīng)，具有活血通絡(luò)、止咳化痰、潤肺平喘的作用[5]。近年來通過現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，銀杏葉提取物可以抗炎、抗氧化，還能調(diào)節(jié)免疫、清除自由基以及抑制細胞凋亡，能利用“多成分-多靶點-多通路”的特點治療PF，且成本低廉，易于獲得，安全性高，應(yīng)用前景良好。但目前銀杏葉用于治療PF的作用機制還尚未清楚。因此，擬利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，采用在線數(shù)據(jù)庫及可視化軟件，建立藥物-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)，探究單味中藥銀杏葉是通過何種作用機制來發(fā)揮治療PF的作用。

1 資料與方法

1.1 GEO差異基因分析 在GEO數(shù)據(jù)庫(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)中以“Pulmonary Fibrosis”為關(guān)鍵詞進行檢索，選取人類樣本，按照疾病相關(guān)性最終選擇使用“Gene expression profiles of interstitial lung disease(ILD)patients(間質(zhì)性肺疾病患者的基因表達譜)”數(shù)據(jù)集，下載其相關(guān)GSE矩陣文件、GPL平臺文件，通過“R語言”對獲得的數(shù)據(jù)進行整理注釋，利用Limma包以|LogFc|>0.5，P<0.05為條件，挑選出表達有差異的基因，然后通過使用ggplot2包做出能體現(xiàn)基因差異表達對比的火山圖。

1.2 銀杏葉中化合物成分及靶點的收集與篩選 用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺TCMSP(http：//tcmspw.com/tcmsp.php)，以銀杏葉(Ginkgo Folium)為關(guān)鍵詞搜索其化合物成分并篩選有效成分，標準為口服生物利用度(OB)≥30%，類藥性(DL)≥0.18。在Uniprot(https：//www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫中檢索靶點所對應(yīng)基因的名稱，并對其進行實用性處理。

1.3 構(gòu)建有效成分-靶點調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 將搜索所獲銀杏葉活性成分和PF靶點的篩選結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件，生成成分-靶點網(wǎng)絡(luò)。

1.4 構(gòu)建PPI蛋白網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖 利用Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)并進行拓撲分析。獲得PPI核心網(wǎng)絡(luò)。以Betweenness值、Closeness值、度值進行篩選，獲取核心網(wǎng)絡(luò)。

1.5 GO功能富集分析與KEGG通路富集分析 通過Bioconductor平臺中的數(shù)據(jù)，可以將靶點基因名轉(zhuǎn)化為對應(yīng)的基因ID，進行GO富集分析，保存富集結(jié)果并選取基因可能參與的生物學(xué)過程(biological process BP)、反應(yīng)可能存在的細胞組分(cell component CC)以及可能行使的分子功能(molecular function MF)各自前20位繪制氣泡圖。以同樣的方法進行KEGG富集分析，將富集程度排名靠前的20個通路做柱狀圖并構(gòu)建KEGG關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。

1.6 分子對接 選取1.4部分構(gòu)建出的PPI網(wǎng)絡(luò)中度值排名較高的靶點及活性成分，利用PDB蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫和ZINC數(shù)據(jù)庫獲取受體的晶體結(jié)構(gòu)和配體的化學(xué)結(jié)構(gòu)，應(yīng)用AutoDock vina軟件分別進行分子對接驗證。

2 結(jié)果

2.1 GEO差異基因分析 經(jīng)過在GEO數(shù)據(jù)庫中的挑選，綜合分析GSE21369間質(zhì)性肺炎基因表達數(shù)據(jù)較為合適，選取它作為基礎(chǔ)數(shù)據(jù)進行進一步分析，并采用平臺文件GPL570[HG-U133_Plus_2]Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array。平臺文件中包括有5例正常人樣本及23例間質(zhì)性肺炎患者樣本，以|LogFc|>0.5，P<0.05為標準，共獲取差異表達基因1077個，其中包含516個表達上調(diào)基因，561個表達下調(diào)基因。繪制火山圖(圖1)，根據(jù)圖像可驗證所獲基因確實在正常人及患者中的表達存在明顯差異。

2.2 銀杏葉中化合物成分及靶點的收集與篩選 在TCMSP數(shù)據(jù)庫中得到總化合物成分307種，以O(shè)B≥30%，DL≥0.18為標準篩選后得到關(guān)鍵化合物成分共27種，按照OB值排序前十位成分見表1。根據(jù)TCMSP數(shù)據(jù)庫中的活性成分靶點信息獲取靶點共2166個，進行標準化處理并整理后共得到419個有效成分所對應(yīng)靶點。

表1 銀杏葉化合物有效成分前十位

2.3 構(gòu)建“有效成分-靶點”調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 在Gene Cards數(shù)據(jù)庫(https：//www.genecards.org/)，OMIM(https：//www.omim.org/)數(shù)據(jù)庫中搜索“Pulmonary Fibrosis”，對PF的靶點進行搜索。通過Gene Cards數(shù)據(jù)庫共搜索到2999個，利用中位數(shù)篩選疾病基因后保留1210，與OMIM數(shù)據(jù)庫中獲得的530個疾病基因、GEO NCBI數(shù)據(jù)庫得到的1077個差異基因進行合并，去重，最終得到2676個疾病基因。查找與藥物靶點基因進行映射后所獲100個交集基因的對應(yīng)成分共18個，利用Cytoscape 3.8.0軟件進行處理，運用網(wǎng)絡(luò)拓撲結(jié)構(gòu)分析得到各節(jié)點度值，按照將有效成分和靶點分別按照度值大小做圓形排列，構(gòu)建有效成分-靶點作用網(wǎng)絡(luò)，見圖2。從圖中可清晰看出分布，度值排名前3位的化學(xué)成分為槲皮素、木犀草素、山柰酚，均為黃酮類化合物；排名前3位的靶點為前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(PTGS2)、前列腺素-內(nèi)過氧化物合酶1(PTGS1)、熱休克蛋白90AB1(HSP90AB1)。而此中槲皮素的度值為78，木犀草素的度值為36。由此可以推測，槲皮素在銀杏葉治療肺間質(zhì)纖維化中發(fā)揮的作用大有可觀。

圖2 有效成分-靶點網(wǎng)絡(luò)

2.4 構(gòu)建PPI蛋白網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖 將獲得的100個交集基因輸入Cytoscape 3.8.0軟件，應(yīng)用BisoGenet插件通過HPRD、BIND、DIP、MINT、INTACT、BIOGRID數(shù)據(jù)庫獲取物種為人類的蛋白并對應(yīng)其編碼基因。共得到節(jié)點5462個，邊132242條。利用“CytoNCA”插件進行拓撲結(jié)構(gòu)分析。以點度中心性(Degree)的二倍中位數(shù)54進行初步篩選，得到節(jié)點1470個，邊62987條；再次以點度中心性值的二倍中位數(shù)182進行進一步篩選，得到節(jié)點234個，邊7490條；最終以中介中心性(Betweenness)值中位數(shù)132.86，接近中心性(Closeness)值中位數(shù)0.583，度值中位數(shù)230.5進行最終篩選，提取核心網(wǎng)絡(luò)節(jié)點63個，邊906條。篩選流程見圖3。其中度值排名前10的節(jié)點為神經(jīng)營養(yǎng)性酪氨酸激酶受體1(NTRK1)、P53腫瘤蛋白(TP53)、表皮生長因子受體(FGFR)、βA4-淀粉樣蛋白前體(APP)、泛素連接酶(CUL3)、雌激素受體1(ESR1)、熱休克蛋白90AA1(HSP90AA1)、核輸出蛋白1(XPO1)、微小染色體維持蛋白2(MCM2)、熱休克蛋白90AB1(HSP90AB1)，這很可能是銀杏葉治療肺間質(zhì)纖維化發(fā)揮藥理作用的關(guān)鍵靶點。

圖3 PPI核心網(wǎng)絡(luò)獲取過程

2.5 GO功能富集分析與KEGG通路富集分析 利用R語言將核心網(wǎng)絡(luò)中靶點名稱轉(zhuǎn)化為ID進行GO功能富集分析，最終得到2047條生物學(xué)過程；44條細胞組分；102條分子功能。各按照P值由小到大選取前20的條目繪制氣泡圖，生物學(xué)過程(a)、細胞組分(b)、生物學(xué)過程(c)見圖4。其中縱坐標為通路名稱，氣泡從小到大代表通路上富集的基因數(shù)目越來越多，氣泡顏色從紅到藍表示富集程度越來越高，即P值越來越小。GO功能富集分析結(jié)果顯示銀杏葉-肺間質(zhì)纖維化疾病交集基因的可能參與到的生物學(xué)過程主要有細胞對化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)、對脂多糖的反應(yīng)、對細菌來源分子的反應(yīng)、對氧化應(yīng)激的反應(yīng)、對活性氧的反應(yīng)等；反應(yīng)可能發(fā)生在膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)、囊泡腔等細胞組分；其可能行使的分子功能有：細胞因子受體結(jié)合、細胞因子活性、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合等。

圖4 GO富集分析(P值前20)

對其再進行KEGG通路富集分析，共涉及到156個通路，按照P值由小到大選取排名前20的信號通路繪制氣泡圖，見圖5。其中縱坐標代表通路名稱，氣泡從小到大代表通路上富集的基因數(shù)目越來越多，氣泡顏色從紅到藍表示富集程度越來越顯著，即表示該通路與疾病相關(guān)性越高，有可能是核心通路。結(jié)果顯示核心通路主要有流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化、IL-17信號通路、TNF信號通路、C型凝集素受體信號通路、Toll樣受體信號通路等。構(gòu)建“靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)，如圖6所示。紫色箭頭代表靶點，橙紅色圓圈代表通路，圖形大小與連接點數(shù)目相關(guān)。紫色箭頭越大，即表示可能是銀杏葉治療肺間質(zhì)纖維化的關(guān)鍵靶點。核心靶點主要有AKT1、RELA、MAPK1、IKBKB等。

圖5 KEGG通路富集分析(P值前20)

圖6 靶點-通路網(wǎng)絡(luò)

2.6 分子對接 將PPI網(wǎng)絡(luò)中挑選的度值排名較高的活性成分槲皮素、木犀草素、山奈酚與核心靶點APP、CUL3、EGFR、ESR1、NTRK1進行對接，其中上述核心靶點對應(yīng)的PDB ID分別為4PPD、4EOZ、5WB7、1HCQ、2IFG，利用AutoDock軟件對接結(jié)果見表2。一般認為配體與受體分子之間存在結(jié)合活性的條件為系統(tǒng)對接結(jié)果小于0，而當配體與受體的結(jié)合越緊密，其所釋放的能量越大，則結(jié)合能越小[6]。可以看出槲皮素與ESR1的結(jié)合性最好，其分子對接示意圖見圖7。

表2 銀杏葉關(guān)鍵化合物與核心靶點結(jié)合能

圖7 槲皮素與ESR1分子對接示意圖

3 討論

銀杏葉作為一味傳統(tǒng)中藥，已經(jīng)應(yīng)用了數(shù)百年，在現(xiàn)代的中國藥典中，建議將其果與葉用于治療心肺疾病[7]。目前，銀杏葉提取物已用于治療老年人腦血管疾病，例如阿爾茨海默病癡呆和血管認知障礙的眩暈以及耳鳴[8]。近年來，也有學(xué)者對銀杏葉治療肺部疾病的作用機制進行了大量的研究，如許碧云等[9]認為銀杏葉提取物的主要成分黃酮類物質(zhì)可以降低肺間質(zhì)中炎癥細胞的滲出量，這一特點能夠通過降低膠原蛋白和細胞免疫因子的表達來治療肺間質(zhì)纖維化?，F(xiàn)已明確肺間質(zhì)纖維化患者均會由于細胞外基質(zhì)(ECM)如膠原等過多沉積在肺組織內(nèi)而導(dǎo)致肺泡正常結(jié)構(gòu)被破壞，最終形成廣泛的纖維化及蜂窩肺。有學(xué)者認為，肺間質(zhì)纖維化的形成，與肺內(nèi)膠原合成與降解的失衡有關(guān)。銀杏葉提取物可以通過調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑的表達來調(diào)節(jié)其平衡，進而防治肺間質(zhì)纖維化。張鵬飛等[10]通過實驗發(fā)現(xiàn)，銀杏葉提取物能降低大鼠肺組織中MMP9及TIMP1的陽性表達，并通過調(diào)節(jié)平衡影響氣道的重塑，從而降低肺組織損害，抑制肺纖維化的發(fā)生及進展。丁明橋等[11-12]也通過實驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)銀杏葉提取物治療后，MMP2mRNA、MMP9、TIMP1的表達均有所降低，這意味這銀杏葉提取物可能通過抑制MMP2mRNA的過度表達以及調(diào)節(jié)MMP9|TIMP1的相對平衡關(guān)系來防止肺間質(zhì)纖維化。

銀杏葉的核心成分主要是黃酮類化合物，此類化合物大都具有程度不等的抑菌活性，可以單獨使用，也可以與其他抗生素聯(lián)用增強其作用。還有部分可以殺滅細菌毒性的因子和具毒素的病原體[13]，其中槲皮素通過多種細菌性病原體抑制生物膜的發(fā)育[14]。木犀草素能通過干擾細菌的分裂增殖發(fā)揮抑菌作用[15]。山奈酚不僅對部分耐藥菌有較強抗菌活性，并且可以增強氟喹諾酮類的抗菌活性[16]。肺間質(zhì)纖維化患者因其病理特征易合并感染，反復(fù)應(yīng)用抗生素使耐藥菌感染概率大大增加，且感染后易重癥、預(yù)后差[17]。通過有效的抗感染治療可以減緩肺功能下降，這也是銀杏葉治療肺間質(zhì)纖維化的一種思路。

KEGG通路富集分析的結(jié)果顯示銀杏葉可通過眾多通路對肺間質(zhì)纖維化發(fā)揮治療作用。其中TNF信號通路與肺纖維化的形成高度相關(guān)，為其始動因素，其功能主要通過TNFR1來實現(xiàn)。TNFR1作用廣泛，包括殺細胞活性、抗病毒活性、ICAM1及IL6的表達、促進成纖維細胞增殖以及細胞凋亡、激活NFKB等多種生物活性物質(zhì)的信號傳遞[18]。IL-17通路同時擁有對炎癥的雙向調(diào)節(jié)作用[19]。如果不加以控制，IL-17途徑中的正性蛋白可以驅(qū)動致病性，因此負性抑制劑對于控制炎癥至關(guān)重要[20]。C型凝集素受體(CLRs)和Toll樣受體(TLRs)均為模式識別受體(PRRs)，CLRs與絕大多數(shù)引起人類疾病的真菌物種結(jié)合。主要用于吞噬細胞結(jié)合和吸收真菌，誘導(dǎo)抗真菌效應(yīng)機制，產(chǎn)生炎癥介質(zhì)，以及指導(dǎo)和調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫反應(yīng)。[21]TLRs能夠感知病原體并增強機體防御機制，但過度激活TLRs會破壞免疫穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致炎性疾病和自身免疫病的風險增加，有證據(jù)表明TLRs在系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風濕性關(guān)節(jié)炎、COPD、哮喘等疾病的發(fā)生和發(fā)展中起作用[22]。

“靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)中顯示核心靶點主要有AKT1、RELA、MAPK1、IKBKB等。AKT1通過調(diào)控細胞生長與增殖參與包含細胞凋亡和葡萄糖代謝在內(nèi)的細胞過程；RELA是NFKB家族一個重要的成員，其翻譯后修飾可精準調(diào)控NFKB的轉(zhuǎn)錄活性，在調(diào)節(jié)炎癥、腫瘤、代謝以及免疫應(yīng)答等重要的生命活動及相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用[23]。NFKB如果發(fā)生錯誤調(diào)節(jié)，則會引發(fā)機體自身免疫病和慢性炎癥等；ERK2是一種胞外信號調(diào)節(jié)激酶，其參與構(gòu)成的ERK信號通路可能是轉(zhuǎn)化生長因子β這一個強大致纖因子對細胞調(diào)控作用中最為重要的通路之一，通過研究表明，ERK信號通路很可能還介導(dǎo)腫瘤壞死因子α促肺間質(zhì)纖維化的發(fā)生[24]。IKB是NFKB的抑制蛋白，可以通過控制NFKB的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)起到抗炎作用[25]。

綜上所述，本文通過差異分析以及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)初步探討了銀杏葉對于肺間質(zhì)纖維化的作用機制，得到的結(jié)論是其治療作用是通過多成分、多靶點、多通路實現(xiàn)的。其中核心成分主要是為黃酮類化合物，可能通過發(fā)揮抗炎抗菌活性、調(diào)節(jié)MMP9|TIMP1的相對平衡關(guān)系、調(diào)節(jié)細胞凋亡、調(diào)控細胞因子、調(diào)節(jié)免疫等作用來治療肺間質(zhì)纖維化。但本研究因為缺少實驗驗證，僅為理論分析，故仍有較大局限性，期待未來可以通過實驗研究進一步完善本思路。