三白草酮通過調控海馬Nrf2/HO-1表達減少酒精戒斷大鼠抑郁樣行為*

姜 敏， 李露露▲， 吳 桐， 李成沖， 王宇晨， 焦 宇， 劉藝涵，馬淑麗， 鄭曉宇， 趙容杰△， 趙正林△

（1齊齊哈爾醫學院醫學技術學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2齊齊哈爾醫學院精神衛生學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

抑郁癥（depression）主要表現為持續的悲傷情緒，并伴有一定的日常功能缺陷，是導致放棄生命的主要原因，現已成為世界范圍內嚴重的公共衛生問題［1］。酒精作為一種非特異性藥物，也是最常被濫用的藥物之一［2］。酒精濫用會導致中毒和成癮，戒斷后可導致一系列情感障礙，誘發焦慮癥或抑郁癥等精神疾病。其發病機制非常復雜尚無明確的理論說明，多數學者認為去甲腎上腺素和多巴胺等單胺類神經遞質的缺乏與抑郁癥的發病相關［3］，因此臨床上利用單胺類神經遞質治療抑郁癥。但由于該類藥物的研發局限于發病機制，其適用范圍十分狹窄。酒精戒斷所致抑郁癥的病理變化發現，氧化應激使大腦特定部位尤其是海馬中大量神經細胞凋亡，抑制神經細胞再生，誘發神經系統的退行性改變會導致抑郁癥［4-5］。但是目前還沒有治療效果良好的酒精戒斷所致抑郁癥藥物。三白草酮（sauchinone，Sau）是從傳統中草藥三白草中提取的單體類化合物，具有清熱解毒、抗炎抗氧化功效，具有細胞保護作用，廣泛用于心血管系統、神經系統和免疫系統疾病的治療。其中抗氧化作用對神經組織的再生與營養、保護作用備受學者的關注［6-8］。本實驗首先建立動物模型從行為學和氧化應激指標的變化觀察了Sau 對酒精戒斷大鼠的抑郁樣行為的改善作用，同時利用細胞實驗，檢測氧化應激信號通路相關蛋白的表達，進一步探討Sau 的抗抑郁作用及其機制，為Sau 抗抑郁藥物的研發提供基礎實驗依據。

材料和方法

1 動物

雄性 SPF 級 Sprague-Dawley 大鼠 32 只，8 周齡，體重（210±10）g，由齊齊哈爾醫學院動物實驗中心提供，使用許可證號：SYXK（黑）2021-013。所有大鼠均在專用IVC 鼠籠，在溫度20～25 ℃，濕度30%～35%自動空氣清潔設備的條件下飼養，自由攝食。

2 HT22細胞

小鼠海馬神經細胞系HT22 購自BeNa Culture Collection，培養在含有10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的 Dulbecco's modified Eagle's medium（DMEM）高糖培養液中，于37 ℃、5% CO2培養箱中孵育生長。

3 主要藥品與試劑

Sau 購于湖州展舒生物科技有限公司，純度＞98%；MTT 試劑盒、總蛋白測定（BCA 法）試劑盒、Annexin V-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒、兔抗大鼠核因子E2 相 關 因 子 2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）抗體和兔抗大鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體均購于碧云天生物技術研究所；兔抗大鼠血紅素加氧酶 1（heme oxygenase-1，HO-1）抗體購于 Santa Cruz；總超氧化物岐化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）和谷胱甘肽（glutathione，GSH）試劑盒購于南京建成生物工程研究所；Alexa FlourTM488 goat anti-rabbit IgG（H+L）購自Life Technologies；4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）試劑購于索萊寶科技有限公司。

懸尾實驗（tail suspension test，TST）分析系統和強迫游泳實驗（forced swimming test，FST）分析系統（上海軟隆科技發展有限公司）；Gen5 酶標儀（BioTek）；倒置熒光顯微鏡（ZEISS）；FluorChem-E 化學發光成像系統（ProteinSimple）；高電流電泳儀（Bio-Rad）：FACSCalibur流式細胞儀（BD）。

4 主要方法

4.1 動物模型的建立、分組、給藥方法 取雄性健康SD 大鼠，適應性飼養1 周后，隨機分為正常對照（control）組、酒精戒斷模型（model）組、低劑量Sau 治療（low-sau）組和高劑量Sau 治療（high-Sau）組，每組8 只。除正常對照組外，其余各組每日1 次腹腔注射酒精3 g/kg，正常對照組給予等體積的生理鹽水代替酒精，連續28 d 后停止酒精注射，戒斷3 d 制作酒精戒斷大鼠模型［9］。在戒斷 3 d 期間，Sau 低劑量治療組（5 mg/kg）和高劑量治療組（25 mg/kg）分別每日灌胃1 次［10］，正常對照組和模型組灌胃生理鹽水。末次給藥30 min 后，利用蔗糖偏好實驗（sucrose preference test，SPT）、TST 和FST 進行行為學檢測，觀察各組大鼠行為學變化。

4.2 SPT 主要用于評價實驗動物快感缺失的程度判斷其抑郁行為。實驗時，各大鼠按照1籠1鼠單獨飼養。每只鼠籠放置2 瓶1%蔗糖溶液，使其自由攝取。24 h后用相同規格純凈水置換其中1瓶蔗糖，再次自由攝取24 h 后，所有動物停止進食進水并持續24 h。隨后，每個籠子提供1瓶預量體積的純凈水和1 瓶預量體積的1%蔗糖溶液，大鼠自由攝取1 h 后，取走兩瓶并分別測定體積，計算每只大鼠的蔗糖偏好率［11］。蔗糖偏好率（%）=蔗糖飲用體積（mL）［/蔗糖飲用體積（mL）+純水飲用體積（mL）］×100%。

4.3 TST 主要以動物在無可回避的壓迫環境中產生絕望的不動狀態來評估動物的抑郁樣行為。將各組大鼠先放入安靜且光線柔和穩定的操作間內適應1 h。懸尾檢測裝置放置于相同環境操作間內，安裝好攝像頭并連接電腦。將大鼠尾部距末端約2 cm處用膠帶固定，倒掛于裝置懸掛桿上，頭距箱底部約30 cm，兩側用擋板隔開動物視線，底部放置用于收集糞便和尿液的可拆卸托盤，開始計時和錄像。分析5 min 內各大鼠的不動狀態的總時間。以大鼠放棄掙扎，呈不動狀態記作不動［12］。每只大鼠僅測試一次，且每測試完一次都要進行排泄物和氣味的清除，以避免影響下次測試結果。

4.4 FST 以動物在局限壓迫環境中放棄掙扎的不動狀態來評價抑郁樣行為。于實驗操作間內安置好各儀器設備并連接電腦，大鼠適應環境1 h后開始實驗。將大鼠放入一水深40 cm的透明圓柱缸內（直徑30 cm，高60 cm），水溫（24±1）℃。該實驗分為適應階段（2 min）和測試階段（5 min）兩個部分，記錄測試階段大鼠不動時間。以大鼠不掙扎，呈漂浮狀態，可僅頭部在水面運動，后肢輕微擺動記作為不動［13］。每只大鼠測試完畢后均要清洗玻璃圓桶并更換同樣溫度的水，避免干擾下次實驗。每只大鼠僅測試一次，每次測試完畢后需將大鼠擦干保暖后再放回原籠中。

4.5 氧化應激相關指標的檢測 上述行為學測試結束后，將大鼠進行安樂死，迅速剝離海馬組織并稱重，按10%的配制比例于生理鹽水中充分勻漿，850×g離心10 min，將海馬組織勻漿上清液凍存于-80 ℃超低溫冰箱中備用。然后按試劑盒操作說明分別檢測海馬組織中T-SOD、MDA、CAT和GSH水平。

4.6 Western blot 檢測蛋白 將收集的海馬組織勻漿上清用BCA 試劑盒進行蛋白定量，經SDS-PAGE分離并轉移到PVDF 膜上，5%脫脂牛奶封閉1.5 h，分別加入特異性Ⅰ抗4 ℃反應24 h，再加入Ⅱ抗孵育2 h 后，用增強化學發光劑（enhanced chemiluminescence，ECL）顯色。用AlphaView SA 3.4進行灰度值分析，用GAPDH作為內參照。

4.7 MTT 法檢測細胞活力 HT22 細胞傳代培養穩定后，在96 孔板每孔接種100 μL（2×103個）細胞，加入不同濃度（50、100、200、400、700 和1 000 μmol/L）的 H2O2培養 24 h，加入不同濃度（3、10、30 和 60 μmol/L）的 Sau 培養 24 h，每組設 3 個復孔。然后加入 MTT 孵育 4 h 以形成甲臜結晶，加入 100 μL 甲臜溶解液繼續孵育4 h 結晶完全溶解后，用酶標儀于570 nm 處測定吸光度（A）值并計算各組的細胞存活率，確定最佳H2O2濃度和Sau干預濃度。

4.8 HT22 細胞分組、給藥以及氧化應激指標的檢測 細胞分為正常對照組（control 組）、模型組（H2O2組）、低劑量Sau 治療組（low-Sau 組）和高劑量Sau 治療組（high-Sau 組）。低、高劑量Sau 治療組細胞分別予以 3 和 30 μmol/L Sau 預處理孵育 2 h，除了正常對照組外其他組以最佳濃度的H2O2處理后繼續培養24 h。然后將細胞洗滌3次，加入100 μL生理鹽水勻漿，600×g離心10 min，取上清按試劑盒操作說明用酶標儀進行檢測。

4.9 流式細胞術檢測細胞凋亡 用H2O2誘導細胞氧化應激模型后，按試劑盒說明要求，離心收集細胞，用PBS 重懸計數5 萬個細胞，先后加入Annexin V-FITC 和碘化丙啶（propidium iodide，PI），室溫避光孵育20 min，1 h 內利用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

4.10 免疫熒光實驗 將HT22 細胞爬片到經組織培養物處理的圓形玻片上，分為正常對照組（control組）、模型組（H2O2組）和高劑量Sau治療組（high-Sau+H2O2組）。H2O2誘導建模處理后經10%中性甲醛固定，5%BSA 封閉爬片，加入Nrf2 Ⅰ抗4 ℃孵育過夜，Alexa FlourTM488 goat anti-rabbit IgG Ⅱ抗37 ℃孵育1 h，DAPI 核染色10 min，抗熒光淬滅劑封片后用倒置熒光顯微鏡觀察。

5 統計學處理

用GraphPad Prism 7.0 統計軟件進行分析。數據均采用均數±標準差（mean±SD）表示。多組間比較采用單因素方差（one-way ANOVA）分析，組間兩兩比較采用Newman-Keuls 法進行檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 Sau對酒精戒斷大鼠抑郁樣行為的影響

如表1 可知，蔗糖偏好實驗中，模型組大鼠蔗糖偏好率顯著低于正常對照組（P＜0.01），與模型組比較，低劑量治療組和高劑量治療組蔗糖偏好率顯著升高（P＜0.05 或P＜0.01）；懸尾和強迫游泳實驗中，與正常對照組比較，模型組大鼠不動時間均顯著升高（P＜0.01），與模型組比較，低劑量治療組和高劑量治療組的不動時間均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），強迫游泳實驗中高劑量治療組不動時間顯著低于低劑量治療組（P＜0.01），且有劑量依賴性。

表1 Sau對酒精戒斷大鼠行為的影響Table 1. Effects of sauchinone（Sau）on the behaviors of alcohol withdrawal rats（Mean±SD. n=8）

2 Sau對酒精戒斷大鼠的大腦海馬組織中氧化應激水平的影響

如表2 所示，與正常對照組比較，模型組大鼠TSOD、CAT 和 GSH 水平均顯著降低（P＜0.01），而MDA 水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，低劑量治療組和高劑量治療組T-SOD、CAT 和GSH 水平均顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），MDA 水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；其中高劑量治療組CAT 水平顯著高于低劑量治療組（P＜0.05），且有劑量依賴性。

表2 Sau對酒精戒斷大鼠海馬氧化應激水平的影響Table 2. Effects of sauchinone（Sau）on the level of oxidative stress in the hippocampus of alcohol withdrawal rats（Mean±SD. n=8）

3 Sau對酒精戒斷大鼠海馬組織中Nrf2和HO-1蛋白表達的影響

如圖1所示，模型組大鼠海馬組織中Nrf2和HO-1蛋白表達顯著低于正常對照組（P＜0.01）；與模型組比較，低劑量Sau 治療組和高劑量Sau 治療組大鼠海馬組織中Nrf2和HO-1蛋白表達顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。

Figure 1. Effects of sauchinone（Sau）on the protein expression of Nrf2 and HO-1 in the hippocampus of alcohol withdrawal rats.Mean±SD. n=8.##P＜0.01 vs control group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs model group.圖1 Sau對酒精戒斷大鼠海馬組織Nrf2和HO-1表達的影響

4 Sau對H2O2誘導的HT22細胞活力的影響

如圖2 所示，H2O2和Sau 單獨處理后觀察對細胞活力的影響，選擇H2O2最佳處理濃度為200 μmol/L，Sau 預處理濃度分別為低劑量組3 μmol/L 和高劑量組為30 μmol/L。后續實驗結果顯示，與正常對照組比較，H2O2模型組細胞活力顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，低劑量Sau 組和高劑量Sau 組HT22 細胞的活力均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。

Figure 2. Effects of sauchinone（Sau）on the viability of H2O2-induced HT22 cells. Mean±SD. n=3.##P＜0.01 vs control group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs model group.圖2 Sau對H2O2誘導的HT22細胞活力的影響

5 Sau對H2O2誘導的HT22細胞凋亡水平的影響

如圖3 所示，與正常對照組比較，模型組細胞凋亡率顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，低劑量Sau組和高劑量Sau 組細胞凋亡率均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。

Figure 3. Effects of sauchinone（Sau）on the apoptosis of H2O2-induced HT22 cells. Mean±SD. n=3.##P＜0.01 vs control group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs model group.圖3 Sau對H2O2誘導的HT22細胞凋亡水平的影響

6 Sau 對H2O2誘導的HT22 細胞氧化應激水平的影響

如表3 所示，與正常對照組比較，模型組T-SOD水平顯著降低（P＜0.01），MDA 水平顯著升高（P＜0.01），與模型組比較，Sau低劑量組和高劑量組細胞內T-SOD 水平顯著升高（P＜0.05，P＜0. 01），MDA 水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。

表3 Sau對H2O2誘導的HT22細胞氧化應激水平的影響Table 3. Effects of sauchinone（Sau）on the level of oxidative stress in H2O2-induced HT22 cells（Mean±SD. n=8）

7 Sau 對 H2O2 誘 導 的 HT22 細 胞 中 Nrf2 表 達 的影響

如圖4 所示，正常對照組中，Nrf2 主要存在于胞質內，胞核中表達極少，而模型組細胞的胞核中Nrf2的表達量顯著高于正常對照組（P＜0.01），與模型組比較，Sau高劑量組細胞核中的Nrf2的表達顯著降低（P＜0.01）。

討 論

Figure 4. Effects of sauchinone（Sau）on the expression of Nrf2 in H2O2-induced HT22 cells. Red arrow：Nrf2 expressed in nuclei.Scale bar=100 μm. Mean±SD. n=3.##P＜0.01 vs control group；**P＜0.01 vs model group.圖4 Sau對H2O2誘導的HT22細胞中Nrf2表達的影響

長期大量的飲酒會引起酒精依賴同時戒斷會導致睡眠困難、焦慮和抑郁等精神癥狀，其發病率逐年增加，給社會和個人的生活帶來嚴重的危害［14］。嚙齒類動物天生對甜食有強烈的欲望，通過對蔗糖偏好測試能衡量動物的享樂狀態或者感受快樂的能力，這是判斷抑郁的基本特征之一。同時，懸尾實驗和強迫游泳實驗是通過動物的求生欲望與行為的絕望程度評價抑郁樣行為的研究方法［15-16］。本實驗行為學檢測結果顯示，模型組大鼠的蔗糖偏好率顯著低于正常對照組，這表明酒精戒斷后大鼠對蔗糖快感顯著降低，TST 和FST 中不動時間顯著增加，證明成功誘導典型的酒精戒斷抑郁大鼠模型。同時研究觀察到低、高劑量Sau治療均有效減少酒精戒斷大鼠的抑郁樣行為。應激反應會導致情感的變化，有研究表明，海馬具有處理、記錄和儲存分析記憶的功能，是壓力反應和情緒的關鍵調節器，海馬的氧化應激水平對焦慮和抑郁有重要的調節作用［17-18］。活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平的增加會對細胞造成一系列氧化應激損傷。T-SOD 和CAT 等抗氧化酶在氧化應激中處于一線防御機制，T-SOD 能清除超氧陰離子而對細胞起到保護作用，而MDA 升高是氧化應激時細胞損傷的一個典型指標［19-20］。CAT是機體內的一種末端氧化酶，能清除細胞代謝過程中產生的H2O2，從而保護細胞免受傷害。而GSH 是一種抗氧化劑，它能防止由活性氧物質導致的細胞組分損害。本實驗結果顯示，酒精戒斷能顯著降低海馬組織中 T-SOD、CAT 和 GSH 水平，增加 MDA 水平，這表明酒精戒斷破壞體內氧化與抗氧化的內環境穩態誘導海馬氧化應激的產生，而Sau干預后上述氧化應激指標具有良好的改善作用。因此分析行為學和氧化應激的結果顯示，酒精戒斷大鼠產生抑郁樣行為的主要原因是海馬組織的氧化應激所致，而在戒斷期間給與Sau不僅能糾正氧化應激水平，也能改善大鼠的抑郁樣行為。同時在細胞實驗中通過凋亡和氧化應激水平的檢測也得到一致的結果。

多數學者關注抑郁癥的發病機制及其治療的研究，其中認為氧化應激對神經細胞的凋亡和損傷作用是常見的機制之一。長期的酒精依賴或戒斷導致持續的氧化應激狀態，會產生過多的ROS，最終使體內氧化與抗氧化調節失衡，導致神經細胞的凋亡或損傷。在此過程中Nrf2 發揮關鍵的調節作用。Nrf2是一種新型的核轉錄因子，能維持體內氧化與抗氧化系統的平衡［21］。文獻表明，Nrf2 常定位于胞質中，與伴侶蛋白 Kelch-like ECH 相關蛋白 1（Keap1）相連，當使Nrf2 從Keap1 解離時，它便移位到細胞核，與靶基因上的抗氧化反應元件（antioxident responseelement，ARE）結合激活抗氧化防御系統［22-23］。在氧化應激狀態時，ROS 能促進Nrf2 進入細胞核內與ARE 結合，上調HO-1的表達發揮細胞的自我保護作用。很多研究表明小鼠Nrf2基因敲除后活性氧及氧化應激水平顯著升高［24］。HO-1 是受 Nrf2 調節的主要酶，其啟動子上含有較強的ARE，可以通過多種方式發揮很強的抗氧化作用。因此認為調控Nrf2 和HO-1 可以作為酒精戒斷大鼠抑郁樣行為的新的靶點［25-28］。本研究顯示，酒精戒斷大鼠海馬組織中Nrf2和HO-1 的相對表達量顯著降低，而Sau 的干預增加其表達最終減少大鼠的抑郁樣行為。同時利用體外實驗也表明，氧化應激時凋亡率顯著增高且細胞核內Nrf2的高表達失去氧化與抗氧化的相對平衡導致細胞的自我保護機制紊亂。以上結果證明Sau 能緩解體內氧化應激水平而改善大鼠的抑郁樣行為，其作用機制涉及Nrf2/HO-1信號通路。

近年來，中草藥及其提取物廣泛應用于各種情緒障礙相關的精神疾病的治療，與常用的苯二氮卓類藥物比較表現出副作用少療效好的獨特優越性，在各種原因所致焦慮和抑郁癥的治療中顯得非常重要。Sau 是從傳統中草藥三白草中提取的單體類化合物，具有清熱解毒、消腫利尿和抗炎之功效，通過抗炎和抗氧化等機制對腫瘤、肝炎、神經退行性病變、急性肺損傷、氣道變應性疾病及細菌感染等具有良好的治療作用，尤其對神經細胞的抗氧化作用及其保護作用備受關注。本實驗采用動物與細胞實驗相結合的方式，探討Sau對酒精戒斷大鼠抑郁樣行為的改善作用及其機制。在動物實驗中顯示Sau 干預后，行為學和氧化應激指標顯著改善，顯著上調海馬組織中Nrf2 及其抗氧化基因產物HO-1 的水平。在體外的實驗中也觀察到Sau 能夠顯著改善氧化應激所致HT22 細胞凋亡以及細胞內氧化應激水平，Nrf2從Keap1 解離后于胞質向胞核內的顯著轉位參與了該機制。

綜上所述，本研究發現Sau對酒精戒斷大鼠抑郁樣行為具有顯著的改善作用，其主要機制可能通過Nrf2/HO-1 信號通路的調控，調節大腦海馬組織的氧化應激水平介導對神經細胞的保護作用。同時為臨床上抗抑郁藥物的研發提供基礎實驗依據。但由于針對Sau在該疾病作用機制研究報道的缺乏，且大腦各區域作用效應交錯復雜，系統給藥在藥物作用靶點定位上又具有一定的局限性，我們暫時還無法提供更為全面的數據，后續我們將在本研究基礎上，采用大腦定位埋管微量注射和藥物示蹤等方法，從大腦各區域及各通路做進一步探索，為該類藥物的研發提供更為深入而可靠的基礎實驗證據。