丹七片調控神經酰胺通路改善心肌梗死后心力衰竭小鼠的藥效及機制研究

田 雪，陳 旭，張亞雯，姜茜茜，江艷艷，孫乾斌，劉恬恬，邵明燕，馬 林，王 勇，3，4

心力衰竭(heart failure，HF)是一種復雜的臨床綜合征，可由任何損害心室充血或射血能力的功能性心臟病引起[1]。心力衰竭的發病率和死亡率較高，給病人和社會帶來了巨大負擔[2]。鞘脂是一類重要的脂質小分子，參與多種重要的生命活動[3]。研究表明，鞘脂可作為心肌梗死復發和預后轉歸的生物標志物，改善其代謝可有效減弱心肌梗死后的細胞死亡和炎癥反應[4]。研究證實，在缺血損傷或炎癥信號刺激下心臟釋放鞘脂[5]。神經酰胺作為鞘脂結構和代謝的核心成分，同時是介導多種細胞功能的第二信使分子[6]，越來越多的證據表明神經酰胺在心血管疾病狀態中發揮重要作用[7]。神經酰胺有多種合成途徑，但神經酰胺的產生在正常和病理心肌中是如何調節的尚不清楚。單鏈絲氨酸棕櫚酰轉移酶(SPT)作為神經酰胺合成途徑中的第一個限速酶，由SPT長鏈亞基1(SPTLC1)和SPT長鏈亞基2(SPTLC2)2個亞基形成異二聚體，這兩個亞基對于產生功能活躍的異二聚體是必需的，其對神經酰胺的合成及心血管作用的發揮具有重要作用[8]。

越來越多的研究顯示，中醫藥在心血管疾病的治療中發揮重要作用[9]。丹七片作為廣泛應用于心血管疾病的臨床藥物[10]，療效顯著，由丹參和三七組成，具有活血化瘀、理氣止痛的功效。但丹七片能否通過減輕神經酰胺來發揮藥效尚不清楚。本研究擬采用冠狀動脈左前降支結扎的方法構建心肌梗死后心力衰竭小鼠模型，通過超聲影像圖檢測、蘇木精-伊紅(HE)染色和Masson病理切片染色及血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)和心肌肌鈣蛋白I(cTnI)檢測等多角度對丹七片的藥效進行評價；此外，基于蛋白免疫印跡法(Western Blot)對脂毒性通路的關鍵蛋白神經酰胺、SPTLC1和SPTLC2進行檢測，旨在揭示丹七片通過神經酰胺通路改善心肌損傷的調控作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康無特定病原體(SPF)級雄性美國癌癥研究所(ICR)小鼠40只，體重(28±2)g，由北京斯貝福生物技術有限公司提供，許可證號：SCXK(京)2019-0010，根據體重隨機分為假手術組、模型組、丹七片組、辛伐他汀組，每組10只。小鼠適應性飼養1周，濕度(45±5)%，溫度(22±2)℃，保持光照與黑暗12 h/12 h循環，自由飲水，普通飼料喂養。本動物研究方案獲得北京中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準(編號：BUCM-4-2018001201-1014)。

1.2 主要試劑與儀器 丹七片(北京同仁堂制藥有限公司，國藥準字：ZH020471，批號：20120096)；辛伐他汀片(英國Merck Sharp & Dohme Limited公司，注冊證號：H20171161，批號：U010049，規格：每片20 mg)；封閉專用脫脂奶粉(北京普利萊基因技術有限公司，批號：P1622)；放射免疫沉淀試驗(RIPA)裂解液(北京普利萊基因技術有限公司，批號：C1053)；二喹啉甲酸(BCA)法蛋白定量試劑盒(北京普利萊基因技術有限公司，批號：P1511)；磷酸酶抑制劑(北京普利萊基因技術有限公司，批號：P1260)；蛋白酶抑制劑(北京普利萊基因技術有限公司，批號：P1265)；10×電泳緩沖液(北京普利萊基因技術有限公司，批號：B1005)；10×電轉移緩沖液(北京普利萊基因技術有限公司，批號：B1006)；10×封閉洗滌緩沖液(TBST，北京普利萊基因技術有限公司，批號：B1009)；蛋白分子量標準(Marker，Thermo Fisher Scientific，批號：26616)；Western Blot 超敏發光液(Super ECL Plus，北京普利萊基因技術有限公司，批號：P1010)；Anti-SPTLC2 antibody(Affinity，批號：DF12231)；Anti-SPTLC1-antibody(Affinity，批號：DF12752)；Anti-GAPDH-antibody(Abways，批號：AB0037)；cTnI(武漢華美生物工程有限公司，批號：CSB-E08421m)；小鼠神經酰胺(ceramide)定量檢測試劑盒(睿信生物科技有限公司，批號：RX202647)；山羊抗兔單克隆二抗(Abways，貨號：AB0101)；小動物超聲影像系統(Visual Sonics公司，型號：Vevo2100)；組織超聲破碎儀(Qiagen公司，型號：40714 HildenTissueLyser Ⅱ)；電泳及電轉系統(BIO-RAD公司，型號：041BR182017)；凝膠成像儀及圖像分析系統(BIO-RAD公司，型號：Molecular lmagery ChemiDocTMXRST)；搖床(Kylin-Bell Lab Instruments公司，型號：TS-2)；Multiskan全自動酶標儀(Thermo公司，型號Mk3)；塑料薄膜封口機(溫州市興業機械設備有限公司，型號：SF-3000)；全自動高壓滅菌鍋(日本TOMY公司，型號：SX-500)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物模型建立及分組 ICR小鼠稱重，腹腔注射0.5% 戊巴比妥鈉(0.08 mL/10 g)麻醉，于左胸前第3肋、第4肋間開胸，暴露心臟，7-0手術線自左心耳下1 mm結扎冠狀動脈左前降支，之后用5-0手術線逐層縫合肋骨、肌肉和表皮，脫呼吸機，進行術后護理待其蘇醒。假手術組采取只穿線不結扎，其他步驟與模型組相同。術后1 d開始給藥，每組8只。基于本課題組前期對丹七片的有效性及安全性的研究結果[11-13]，丹七片組給予丹七片1.5 g/kg灌胃；辛伐他汀組給予2.9 mg/kg灌胃；假手術組和模型組均給予等體積蒸餾水灌胃。每日1次，連續給藥14 d。

1.3.2 超聲影像圖檢測 利用小動物超聲影像系統對各組小鼠左心室射血分數(left ventricular ejection fraction，LVEF)、左心室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening，LVFS)、左室收縮末期內徑(left ventricular end-systole diameter，LVESD)和左室舒張末期內徑(left ventricular end-diastole diameter，LVEDD)等指標進行檢測。

1.3.3 血生化檢測 超聲檢查后，在麻醉狀態下腹主動脈取血。血液于室溫下靜置2 h后，4 ℃，3 000 r/min，離心20 min后取上清并分裝保存于-80 ℃冰箱備用。采用酶聯免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)法檢測各組小鼠血清cTnI表達水平，使用全自動生化分析儀檢測血清CK-MB水平。

1.3.4 形態學檢測 4%多聚甲醛固定心肌組織72 h，石蠟包埋，切成5 mm切片。采用HE、Masson染色觀察小鼠心肌組織形態，并通過計算膠原容積分數(collagen volume fraction，CVF)量化心肌纖維化程度，計算公式為CVF=膠原纖維面積/心肌表面積×100%。

1.3.5 Western Blot檢測相關蛋白表達 稱取各組小鼠心臟組織20～40 mg，RIPA裂解緩沖液提取總蛋白，每100 mg組織加入1 mL裂解液，離心后吸取上清，即為心肌組織中蛋白樣品。根據BCA法進行蛋白定量，依據蛋白濃度，計算上樣體積，沸水中煮10 min變性。蛋白樣品通過SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并轉移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上，用5%脫脂牛奶封閉。將膜與一抗(SPTLC1、SPTLC2、GAPDH)在4 ℃下孵育過夜。將膜在室溫下孵育二抗1 h，TBST洗膜3次，在PVDF膜上均勻地滴加ECL超敏發光液，使用凝膠成像儀進行顯影，并采用Image-Lab 軟件進行數據分析。

1.3.6 ELISA檢測 將剪取的心肌組織與對應體積的PBS(按1∶9的重量體積比)，加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。3 000 r/min離心20 min，收集上清液待檢。將試劑平衡至室溫后，嚴格按照試劑盒說明書進行神經酰胺檢測。

2 結 果

2.1 各組小鼠心臟超聲檢測結果比較 與假手術組比較，模型組LVEF和LVFS值明顯下降，差異均有統計學意義(P<0.001)，且模型組LVEDD和LVESD明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.01或P<0.001)，提示模型成功制備。與模型組比較，丹七片組小鼠LVEF和LVFS明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.01或P<0.001)，LVEDD和LVESD明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)，表明丹七片能夠改善心力衰竭小鼠的心功能。陽性藥辛伐他汀也有改善心功能的效果。詳見圖1、圖2。

圖1 各組小鼠超聲心動圖

與假手術組比較，＊ P<0.01，# P<0.001；與模型組比較，△ P<0.05，☆ P<0.01，◇P<0.001。

2.2 各組小鼠HE染色結果 HE染色是評價心肌組織的形態及病理變化。假手術組小鼠心肌細胞排列有序，具有完整的細胞核，且無炎性細胞浸潤；在模型組中觀察到心肌纖維斷裂和紊亂，以及心肌組織水腫、細胞核缺失和梗死區域周圍的大量纖維組織。與模型組比較，丹七片組表現出心肌細胞排列紊亂狀態改善，細胞核趨于完整，且炎性細胞浸潤明顯減少，表明丹七片減輕了心力衰竭小鼠的病理改變。詳見圖3。

圖3 各組小鼠心肌組織HE染色結果(n=3，×200或×400)

2.3 各組小鼠Masson染色結果 假手術組小鼠心肌細胞排列整齊，其間隙未見膠原組織分布；與假手術組比較，模型組小鼠心肌細胞膠原不斷產生，且呈彌漫性、浸潤性分布，其纖維化程度明顯加重。與模型組比較，丹七片組和辛伐他汀組小鼠心肌細胞膠原含量明顯減少，形態規則，表明丹七片和辛伐他汀能夠有效改善心肌梗死后心力衰竭小鼠心肌纖維化程度。通過CVF量化心肌纖維化程度，結果提示丹七片和辛伐他汀能夠降低心肌細胞內的膠原含量水平，減輕小鼠心肌纖維化程度。詳見圖4、圖5。

圖4 各組小鼠心肌組織Masson染色結果(n=3，×200或×400)

與假手術組比較，＊P<0.001；與模型組比較，# P<0.01。

2.4 各組小鼠血清CK-MB、cTnI水平比較 與假手術組比較，模型組小鼠血清CK-MB、cTnI水平較高，差異均有統計學意義(P<0.01或P<0.001)；與模型組比較，丹七片組和辛伐他汀組小鼠血清CK-MB、cTnI水平降低，差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01或P<0.001)，表明丹七片、辛伐他汀均可降低CK-MB、cTnI水平，改善心功能。詳見圖6。

與假手術組比較，＊ P<0.01，# P<0.001；與模型組比較，△ P<0.05，☆ P<0.01，◇ P<0.001。

2.5 各組小鼠心肌組織神經酰胺含量比較 與假手術組比較，模型組小鼠心肌組織中神經酰胺含量明顯上升，差異有統計學意義(P<0.001)；與模型組比較，丹七片組和辛伐他汀組小鼠心肌組織中神經酰胺含量明顯下降，差異均有統計學意義(P<0.001)。詳見圖7。

與假手術組比較，＊P<0.001；與模型組比較，# P<0.001。

2.6 丹七片對SPTLC1、SPTLC2蛋白表達的影響 Western Blot結果顯示，與假手術組比較，模型組小鼠心肌組織中SPTLC1和SPTLC2的表達上調，差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。給予丹七片干預后，可以明顯下調SPTLC1和SPTLC2的表達，差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)，辛伐他汀對SPT相關蛋白也表現出相似的改善作用，差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。詳見圖8。

與假手術組比較，＊ P<0.05，# P<0.01；與模型組比較，△ P<0.05，☆ P<0.01。

3 討 論

心力衰竭作為各種心血管疾病發展的終末階段，其高患病率、高死亡率以及高復發率已成為威脅人類健康的主要病因[14]。心肌缺血作為心力衰竭的主要原因，常伴心室射血分數降低、舒張功能障礙、左心室舒張末期壓力升高等[15]。多項研究表明，心力衰竭的心室重構與潛在毒性脂質如神經酰胺的積累有關[7，16]，這可能成為目前被低估的心肌病和心力衰竭的危險因素之一[17]。

本研究通過復制心肌梗死后心力衰竭小鼠模型，給予丹七片干預，采用超聲影像檢測、組織病理學以及血清心肌損傷標志物檢測來評價丹七片對心肌梗死后心力衰竭小鼠心功能和病理環節的影響。超聲結果顯示，模型組LVESD、LVEDD值明顯升高，LVEF、LVFS值明顯下降，提示其模型建立成功，心功能下降。給予丹七片干預后，小鼠LVEF、LVFS值明顯提高，LVESD、LVEDD值也有明顯降低趨勢。HE和Masson染色因其應用廣泛，成為組織學及病理學檢測的基本方法，更能直觀反映小鼠心肌組織形態與結構的改變。Masson染色是提示組織中纖維以及炎性因子的染色方法之一，用來評價心肌纖維化水平[18]。HE、Masson染色提示模型組小鼠心肌結構異常改變，心肌纖維斷裂和紊亂，并伴有大量膠原產生。與模型組比較，丹七片組小鼠心肌細胞膠原含量明顯減少，心肌細胞排列紊亂狀態改善，細胞核趨于完整。CK-MB、cTnI常作為心肌損傷的特異性標志物[19]，血清檢測結果提示模型組小鼠心肌損傷標記物CK-MB及cTnI水平明顯升高，在給予丹七片干預后，其水平明顯下調。綜上表明，模型組小鼠出現心功能下降、心肌結構異常改變及心肌損傷標志物釋放等，在丹七片干預后能夠有效改善小鼠的心臟功能，并減輕小鼠的心肌病理損傷及心肌損標記物的釋放。

近年來，鞘脂在缺血/再灌注損傷、2型糖尿病和肥胖等心功能障礙發病機制中的作用備受關注[20]。研究顯示，鞘脂是哺乳動物細胞膜脂的普遍成分，廣泛分布于其他動植物和微生物中，主要包括神經酰胺、鞘磷脂、鞘氨醇、1-磷酸鞘氨醇(sphingosine 1-phosphate，S1P)和神經節苷脂。研究發現，鞘脂不僅是生物膜的結構成分，也是具有高度生物活性的化合物，可通過改變脂質雙層的理化特性調節受體和細胞內蛋白質活性[21]。而神經酰胺作為鞘酯結構和代謝的核心分子[22]，是該家族中研究最深入的成員。同時神經酰胺也是調節細胞能量代謝的潛在脂毒分子之一[23]，可以通過多種途徑調節細胞的生長、增殖、分化及凋亡。1990年Okazaki等[24]首次發現神經酰胺是第二信使，并作為脂質過量的信號出現，引發大量細胞應激反應，最終導致細胞凋亡[25]。研究表明，神經酰胺與心臟代謝疾病有相關性，被認為是心血管疾病的生物標志物[26]，其中在大小鼠心臟左冠狀動脈閉塞模型中均發現缺血再灌注時神經酰胺含量明顯增加[27-28]，同時研究表明，在缺血/再灌注期間和心力衰竭動物模型以及人的心肌疾病中，神經酰胺會在心肌中積累，病人在心力衰竭不同階段，其心臟和循環中神經酰胺水平均有不同程度的升高，因此，推測神經酰胺參與了心力衰竭的發展過程[7]。

SPT屬于5′-磷酸吡哆醛依賴性α-氧代胺合酶家族，催化L-絲氨酸和棕櫚酰輔酶A的縮合反應形成3-酮二氫鞘氨醇，這是神經酰胺合成的第一步和速率決定步驟[29]。而神經酰胺主要合成途徑是從頭合成途徑，SPT被認為是調節細胞中鞘脂水平的關鍵酶，調節SPT合成可防止神經酰胺的有害積累[8]。Myriocin是一種SPT抑制劑，可顯著保護缺血區域免受缺血/再灌注損傷[30]。研究顯示，急、慢性缺血性損傷中神經酰胺水平的增加是從頭合成途徑激活的主要來源[7]。本研究Western Blot實驗結果提示，模型組小鼠心肌組織中SPTLC1和SPTLC2蛋白表達升高，在給予丹七片干預后，可以下調其表達，說明SPT可能是丹七片的潛在靶點，丹七片能夠通過該靶點來保護心功能。此外，基于ELISA技術對小鼠心肌組織中神經酰胺的檢測也證實了這一結論，在經丹七片干預后，小鼠心肌組織中其水平下調，這與Western Blot實驗結果相一致。通過研究發現，丹七片可以通過調控神經酰胺從頭合成途徑關鍵限速酶SPT來減輕心肌梗死后心力衰竭小鼠心肌中的神經酰胺水平，從而改善心功能，減輕心肌損傷。

綜上所述，本實驗通過活體動物實驗對丹七片進行了基于脂毒性通路SPT蛋白表達降低神經酰胺的機制研究，為后續丹七片治療心肌梗死的藥效及機制研究提供新的依據，同時為心力衰竭的臨床治療開辟新道路。