坎離顆粒抑制血管緊張素Ⅱ誘導H9c2心肌細胞肥大的作用機制探究

李 悅，王肖龍，姚成增

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是各種心血管疾病發展的終末階段，且預后較差[1]。慢性心肌肥大及其相關的心肌重構是CHF發生發展的主要病理基礎[2]。血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)作為腎素-血管緊張素-醛固酮系統的主要組成部分，是導致心肌肥大及心肌重構的重要致病因素，而血管緊張素轉換酶抑制劑及AngⅡ受體拮抗劑可抑制心肌肥大的發展進程[3]。因此，抑制AngⅡ相關的心肌肥大對改善CHF預后具有重要意義。

中醫藥防治CHF相關證候歷史候久。多項臨床研究證實，中醫藥可改善CHF病人的臨床癥狀，提高CHF病人的生活質量[4]。坎離顆粒是蔣梅先教授在繼承全國名老中醫張伯臾的學術經驗基礎上，創制的治療CHF經驗方，經本學科長期應用，療效顯著。臨床研究已證實，坎離顆粒對CHF病人的療效顯著，能明顯改善CHF病人的腎素-血管緊張素-醛固酮系統指標、內皮功能及心率變異性等，提高心力衰竭病人的活動耐量和生活質量[5-7]。基礎研究也已證實，坎離顆粒具有改善心肌一氧化氮(NO)/內皮素(ET)值，抑制心肌細胞凋亡，降低其心肌膠原體積分數、心臟指數、左室質量指數、左心室舒張末期內徑，升高Ⅰ/Ⅲ型膠原比值等藥理效應[8-9]。本研究運用AngⅡ誘導心肌肥大，探索坎離顆粒抗CHF的作用機制，以期為坎離顆粒在心血管疾病方面的應用提供更有力的證據，為心血管疾病的治療提供新方向。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗藥物坎離顆粒(生黃芪、熟附子、白術等9味中藥組成)由上海中醫藥大學附屬曙光臨床醫學院制劑室制作而成；H9c2心肌細胞購自上海中國科學院細胞庫；AngⅡ(貨號：A9525)購自美國Sigma公司；改良伊格爾培養基DMEM(貨號：C11995500CP)、胎牛血清(貨號：10099141)、胰蛋白酶(貨號：25200072)和青霉素/鏈霉素雙抗(貨號：15140122)購自美國Gibco公司；BCA蛋白定量試劑盒(貨號：NCI3225CH)購自美國Thermo公司；RIPA裂解液(貨號：P0013C)購自中國碧云天公司；CellTiter-Glo?發光法細胞活力檢測試劑盒(貨號：G7571)購自美國Promega公司；TRIzol試劑(貨號：15596-026)購自美國Invitrogen 公司；RNA抽提試劑盒Direct-zolTMRNA MiniPrep(貨號：A-R2051)購自美國Zymo Research公司；逆轉錄試劑盒(貨號：RR047A)購自日本Takara公司；實時熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒(貨號：AM1005)購自美國Thermo公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒(貨號：NCI3225CH)購自美國Thermo公司；兔多克隆抗體心房鈉尿肽(atrial natriuretic peptide，ANP)(貨號：NBP2-14873)購自美國Novus公司；兔多克隆抗體腦鈉肽(brain natriuretic peptide，BNP)(貨號：ab19645)、基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)(貨號：ab38898)、組織金屬蛋白酶組織抑制因子-1(tissue inhibitor of metalloproteinases 1，TIMP-1)(貨號：ab38898)均購自美國Abcam公司；兔多克隆抗體基質金屬蛋白酶-1(matrix metalloproteinases，MMP-1)(貨號：DF6325)購自美國Affinity公司；小鼠單克隆抗體β-肌球蛋白重鏈(β-myosin heavy chain，β-MHC)(貨號：sc-53089)購自美國Santa Cruz公司；PCR引物由上海鉑尚生物技術公司合成，引物序列見表1。

表1 基因名稱及引物序列(5′-3′)

1.2 方法

1.2.1 H9c2心肌細胞的培養 H9c2心肌細胞系在含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的二甲基亞礬(DMEM)培養基中置于5%CO2、37 ℃恒溫培養箱中小心培養。待細胞生長密度至80%～90%時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代或凍存。

1.2.2 AngⅡ及坎離顆粒溶液的配制 AngⅡ溶于無血清的DMEM培養基中，配制成1 mmol/L母液，根據需要濃度再行稀釋。坎離顆粒浸膏粉以二甲基亞砜(DMSO)為溶劑，再溶于無血清DMEM培養基中，配制成1 mg/mL母液，根據需要濃度再行稀釋(DMSO濃度不超過0.1%)。

1.2.3 H9c2心肌細胞的分組及處理方法 取對數生長期細胞，胰蛋白酶消化后以適當密度鋪于6孔板、26孔板或96孔板，待細胞長至70%左右時進行藥物干預。第1部分實驗分為4組，空白組：H9c2心肌細胞正常培養24 h，未做任何處理；AngⅡ-24 h組：H9c2心肌細胞加入濃度為100 nmol/L的AngⅡ培養24 h；AngⅡ-48 h組：H9c2心肌細胞加入濃度為100 nmol/L的AngⅡ培養48 h；AngⅡ-72 h組：H9c2心肌細胞加入濃度為100 nmol/L的AngⅡ培養72 h。第2部分實驗分為5組，空白組：H9c2心肌細胞正常培養48 h，不做任何處理；AngⅡ組：H9c2心肌細胞加入濃度為100 nmol/L的AngⅡ培養48 h；坎離顆粒低劑量組：H9c2心肌細胞加入濃度為100 nmol/L的AngⅡ+低劑量(25 μg/mL)坎離顆粒溶液培養48 h；坎離顆粒中劑量組：H9c2心肌細胞加入濃度為100 nmol/L的AngⅡ+中劑量(50 μg/mL)坎離顆粒溶液培養48 h；坎離顆粒高劑量組：H9c2心肌細胞加入濃度為100 nmol/L的AngⅡ+高劑量(75 μg/mL)坎離顆粒溶液培養48 h。

1.2.4 α-actin免疫熒光染色 準備4組24孔板，在每塊板中間區域輕輕放入6塊玻片，每孔先加入1 mL的1×磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)清洗1遍，將生長狀態良好的H9c2心肌細胞用胰蛋白酶消化，以密度為1×103左右的細胞密度種到24孔板內。培養24 h后進行相應處理。將處理好的細胞加入4%多聚甲醛室溫固定15 min，隨后用PBS清洗2遍，每次5 min；加入0.2% TritonX-100通透5 min，隨后清洗3遍，每次5 min；室溫封閉30 min，隨后清洗2遍，每次5 min；加入一抗稀釋液，4 ℃過夜處理；次日清洗細胞后，加入二抗稀釋液，室溫孵育40 min，隨后清洗2遍，每次5 min；最后加入DAPI工作液，避光室溫處理1 min，隨后清洗晾干，封片，使用激光共聚焦顯微鏡掃描拍照。

1.2.5 實時熒光定量PCR技術(qRT-PCR)檢測基因mRNA表達水平 使用TRIzol試劑和Direct-zolTMRNA MiniPrep試劑盒提取細胞內總RNA，隨后對提取的RNA進行逆轉錄。擴增條件：95 ℃ 10 s變性、60 ℃ 20 s退火、72 ℃ 20 s延伸，共42個循環。mRNA相對表達量采用2-△△Ct法測定。

1.2.6 蛋白免疫印跡(Western Blot)檢測H9c2心肌細胞中相關蛋白表達水平 使用RIPA裂解緩沖液中裂解實驗細胞，并使用BCA蛋白定量分析試劑盒測定蛋白濃度。制備蛋白樣本，將等量的煮沸蛋白質提取物通過7.5%或10.0% 聚丙烯酰胺凝膠分離，然后轉移到甲醇預活化的聚偏二氟乙烯膜上。將膜與5%脫脂牛奶在室溫下孵育1 h，然后與目的一抗稀釋液在4 ℃下孵育過夜。然后將膜在二抗中室溫孵育2 h。使用增強的化學發光試劑使印跡中的蛋白質可視化。

2 結 果

2.1 AngⅡ誘導H9c2心肌細胞肥大最佳作用時間的確定

2.1.1 不同時間AngⅡ刺激H9c2心肌細胞表面積的變化 細胞免疫熒光實驗結果顯示，與空白組比較，AngⅡ刺激H9c2心肌細胞24 h、48 h和72 h后，心肌細胞表面積均有一定程度的增大，其中AngⅡ誘導H9c2心肌細胞48 h時，細胞表面積增加最為明顯。詳見圖1。

圖1 不同時間AngⅡ刺激對H9c2心肌細胞表面積影響的細胞免疫熒光

2.1.2 不同時間AngⅡ誘導的H9c2心肌細胞肥大基因的蛋白表達變化 與空白組比較，AngⅡ-24 h組、AngⅡ-48 h組、AngⅡ-72 h組ANP、BNP、β-MHC、MMP-1、MMP-9和TIMP-1的蛋白表達均明顯上升，差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)；其中AngⅡ-48 h組上述基因的表達增加最為明顯，差異均有統計學意義(P<0.01)。因此，后續實驗均采用AngⅡ刺激細胞48 h為心肌肥大模型最佳誘導時間。詳見圖2。

與空白組比較，＊P<0.05，# P<0.01。

2.1.3 坎離顆粒對H9c2心肌細胞活力的影響 坎離顆粒用藥濃度范圍經過多組多次由高到低的實驗濃度篩選，最終得到相對精確的實驗用藥濃度。首先分別用0 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL、800 μg/mL、1 600 μg/mL坎離顆粒處理H9c2心肌細胞48 h，進行CellTiter-Glo4?檢測，結果顯示，與 0 μg/mL比較，100 μg/mL時細胞活力開始下降，至400 μg/mL時細胞存活率>50%，800 μg/mL時細胞存活率<50%，由此確定400 μg/mL為低濃度細篩最高值(見圖3A)。隨后采用濃度為0 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、150 μg/mL、200 μg/mL、250 μg/mL、300 μg/mL、350 μg/mL、400 μg/mL、450 μg/mL坎離顆粒處理H9c2心肌細胞48 h，檢測細胞存活率，結果顯示，與0 μg/mL比較，至100 μg/mL時細胞存活率>90%，150 μg/mL時細胞存活率<90%，因此確定100 μg/mL為坎離顆粒實驗用藥濃度上線(見圖3B)。因此，后續實驗選用25 μg/mL、50 μg/mL、75 μg/mL坎離顆粒作為其高、中、低劑量組。

圖3 坎離顆粒的細胞毒性實驗

2.2 坎離顆粒對H9c2心肌細胞肥大模型的干預作用 采用qRT-PCR與Western Blot 法檢測坎離顆粒干預心肌細胞48 h后的ANP、BNP、β-MHC、MMP-1、MMP-9和TIMP-1 mRNA與蛋白表達水平。與空白組比較，AngⅡ組ANP、BNP、β-MHC、MMP-1、MMP-9和TIMP-1 mRNA與蛋白表達均明顯上升，差異均有統計學意義(P<0.01)；與Ang Ⅱ組比較，坎離顆粒用藥組ANP、BNP、β-MHC、MMP-1、MMP-9和TIMP-1 mRNA與蛋白表達明顯下降，差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)，提示坎離顆粒能夠有效抑制Ang Ⅱ誘導的心肌肥大相關mRNA與蛋白水平的上調。詳見圖4。

與空白組比較，＊ P<0.01；與AngⅡ組比較，#P<0.05，△ P<0.01。

3 討 論

CHF作為世界范圍內死亡的主要病因之一，發病群體逐漸年輕化，其5年內存活率接近惡性腫瘤[10-12]。CHF具有復雜的病理生理學特征，研究表明包括心肌肥大在內的心肌重構是CHF臨床進程的重要決定因素[13-16]。心肌肥大是機體受到生理或病理刺激初期做出的適應性反應，以減少室壁應力并維持心臟功能，隨著病程時間的延長，生理性心肌肥大向病理性心肌肥大轉變，持續性的肥大則會加重心肌重構，最終導致CHF的發生與發展[17-18]。

目前，現代醫學治療CHF的觀念發生了明顯變化，為提高病人生活質量，延長生命，CHF治療目標不再只是追求其暫時的癥狀改善，更重要的是預防和延緩心肌重構的發生和發展。因此，抑制心肌重構，改善心臟功能，是當前階段治療CHF的重要方向[17，19]。臨床常用藥物ACEI類、β受體阻滯劑、醛固酮拮抗劑及伊伐布雷定、腦啡肽酶抑制劑等均是通過抗心肌重構而抑制CHF的發展[20-21]，雖然CHF病人的長期死亡率明顯下降，但這些藥物引發的副作用較多，病人的生活質量依然低下，如使用利尿劑后，CHF病人血流動力學雖有明顯好轉與改善，但可能會出現尿酸升高、腎功能惡化等一系列不良反應，進而導致其他并發癥，嚴重影響病人的生存質量[22]。因此，探索療效顯著且副作用小的治療方式迫在眉睫。

中醫藥在治療CHF方面有豐富的臨床經驗及獨特的理論體系。CHF 屬于中醫學“心悸”“胸痹”“喘證”“痰飲”“水腫”等范疇，其臨床表現主要為心悸、心慌、胸悶、喘咳、咳痰、氣短、肢體浮腫等。中醫認為心主血脈，其以血為本，以氣為用，全身上下血液之運行有賴心氣之推動，于百脈中川流不息，以發揮濡養四肢百骸之功能。對心功能的認識，傳統醫學與現代醫學并無歧義。多項科學研究證實，中醫藥在治療CHF有著較為完善的治療體系和較好的臨床療效[23-24]。坎離顆粒是蔣梅先教授在繼承全國名老中醫張伯臾教授學術思想和臨床經驗基礎上創制的治療心力衰竭的經驗方，經本學科長期臨床應用，療效顯著。近30年的臨床應用業已證實該方可有效增加CHF病人的活動耐量，提高病人6 min步行距離，改善病人的臨床癥狀等[25]。

本研究借助離體實驗的方法，采用AngⅡ刺激H9c2心肌細胞構建心肌肥大模型，對該方的藥理機制進行深入探究。H9c2大鼠心肌細胞系來源于胚胎期BD1X大鼠心臟組織的亞克隆細胞系，因其具有培養操作性強、可傳代且細胞存活率高等優勢，在心血管疾病研究領域有著較為廣泛的應用[26-27]。目前，國內外多項基礎研究均采用H9c2大鼠胚胎心肌細胞株作為離體實驗部分的細胞載體，用以探索某種基因或藥物在心肌重構或心力衰竭中的作用機制[28]。此外，AngⅡ是腎素-血管緊張素-醛固酮系統的重要執行因子，參與多種心血管事件的發生發展，在不增加血管阻力和心臟后負荷的情況下，AngⅡ能夠直接作用于心肌細胞促進其肥大，使胞內肥大基因ANP、BNP和β-MHC的表達增加[29-32]。ANP、BNP等利鈉肽的血漿水平已被證明是心力衰竭等心血管疾病診斷和預后的生物標志物，兩者的血漿水平變化可反映左室收縮和舒張功能障礙、瓣膜功能障礙以及右室功能障礙等情況[33-34]。而心肌細胞作為一種高度分化的終末細胞，以α-肌球蛋白為主，當心肌肥大時，收縮蛋白以β-MHC 占優勢。β-MHC與心肌重構密切相關，其蛋白水平升高一定程度上可以反映心肌重構程度[35]。此外，基質金屬蛋白酶(MMPs)家族在CHF進程中同樣有重要作用，金屬蛋白酶抑制因子(TIMPs)是MMPs的內源性抑制物，也被證實參與心肌重構的病理過程，在衰竭的心臟組織中，MMP/TIMP 失衡可促進纖維膠原的逐漸降解，從而導致心室壁變薄和心室擴張，兩者失衡加速了心肌重構和CHF的發展[36-37]。

本研究結果顯示，AngⅡ刺激后H9c2細胞形態和體積明顯增大，ANP、BNP、β-MHC、MMP-1、MMP-9、TIMP-1等肥大基因蛋白表達均有所上升，證明了AngⅡ刺激H9c2細胞促進心肌重構，而坎離顆粒可部分逆轉AngⅡ引起的心肌細胞肥大，提示坎離顆粒對心肌組織具有顯著的保護作用，其藥理機制可能是通過抑制心肌肥大相關因子的表達，減緩肌原纖維的合成，從而改善心肌肥大與心肌重構的程度，進而改善心臟功能，發揮抗CHF的作用。更加深入的藥理機制將會在未來的研究中進一步探索。