二醛納米纖維素的制備及其與明膠協同穩定Pickering乳液研究

曹子璇，呂天藝，馮鑫，陳媛，張宇昊,2，周鴻媛,2，戴宏杰,2*

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400715)2(食品科學與工程國家級實驗教學示范中心(西南大學)，重慶，400715)

納米纖維素是纖維素經過機械、化學或生物方法使其在某一維度具有納米尺寸，主要分為纖維素納米纖絲(cellulose nanofibrils，CNF)、纖維素納米晶(cellulose nanocrystals，CNC)和細菌納米纖維素(bacterial nanocellulose，BNC)。納米纖維素因其獨特的納米結構、高機械強度、高縱橫比、生物相容性、可降解以及無毒性等特點，在食品、醫藥和復合材料等領域具有巨大應用前景[1-2]。

Pickering乳液采用固體顆粒代替表面活性劑穩定乳液，具有穩定性好、可調控、環境相容性好和抗奧氏熟化等特點，廣泛應用于化妝品、醫藥和食品等領域[3]。穩定Pickering乳液的固體顆粒主要包括蛋白基、多糖基納米顆粒和無機納米粒子等[4-5]，其中多糖基納米顆粒如納米纖維素由于其穩定性好、獨特的納米結構、天然兩親性和生物相容性等特點，受到廣泛關注[6]。但由于納米纖維素相對較高的親水性，通過疏水改性或與其他物質協同改善其穩定Pickering乳液性能研究較為廣泛。而疏水改性涉及到較多化學試劑的使用，不利于食品級乳液的開發，通過與蛋白、多糖等生物大分子協同穩定Pickering乳液具有更好的生物相容性和功能性，具有重要研究意義[7]。食品乳化體系通常是多種天然表面活性分子共存和互作的體系，研究多種物質協同穩定的Pickering乳液對于其實際應用具有重要意義。

明膠是動物膠原蛋白部分水解得到的肽和蛋白質的混合物，易于獲得且生產成本低，具有良好的乳化性和生物相容性，可作為良好的Pickering穩定劑開發利用。已報道的去溶劑法構建明膠納米顆粒，步驟繁瑣且涉及到戊二醛、丙酮等化學試劑的使用，限制了其在食品體系中的應用[8]。而近年來通過明膠與其他物質協同穩定乳液受到廣泛關注，例如明膠和明膠納米顆粒[9]、明膠和酪蛋白酸鈉[10]、明膠和表面活性劑[11]、明膠和多酚[12]、明膠和BNC[13]等。通過不同物質間在界面吸附填充或參與連續相網絡結構的加強，乳液穩定性得到明顯改善。本研究以微晶纖維素(microcrystalline cellulose，MCC)為原料，通過硫酸水解法制備CNC并進一步通過高碘酸鈉氧化獲得二醛納米纖維素(dialdehyde cellulose nanocrystals，DACNC)，基于Schiff堿反應設計構建明膠和DACNC協同穩定Pickering乳液。考察明膠和DACNC的添加順序和DACNC質量濃度對乳液外觀、微觀結構和流變特性的影響，同時對明膠/DACNC協同穩定乳液的環境穩定性(溫度、pH和離子強度)進行評估。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

MCC，上海源葉生物科技有限公司；B型明膠(來源于豬皮)，美國Sigma-Aldrich公司；大豆油，九三集團；硫酸、氯化鈉、氫氧化鈉、溴酚藍和鹽酸羥胺，成都市科隆化學品有限公司；高碘酸鈉，天津市科密歐化學試劑有限公司；乙二醇，廣東光華科技股份有限公司；鹽酸，重慶川東化工有限公司；所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

Ntegra Platform原子力顯微鏡，俄羅斯NT-MDT公司；PE 20實驗室酸度計，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；Heraeus Multifuge X3R臺式高速冷凍離心機，美國賽默飛世爾科技公司；BX 53光學顯微鏡，日本OLYMPUS公司；Spectrum 100紅外光譜儀，美國PerkinElmer公司；ZEN 3690激光粒度儀、Mastersizer 3000激光粒度分析儀，英國Malvern公司；XHF-DY高速分散器，寧波新芝有限公司；MCR302流變儀，奧地利安東帕公司；DTG-60A差熱熱重同步熱分析儀，日本島津公司；FD-1-50真空冷凍干燥機，北京博益康實驗儀器有限公司。

1.3 CNC的制備

稱取10 g MCC，按料液比1∶20(g∶mL)分散在64%(質量分數)的硫酸溶液中，45 ℃下水浴攪拌1 h，然后加入10倍體積蒸餾水終止反應。將反應物進行反復離心(4 000 r/min，10 min)和蒸餾水洗滌，直至上層液體為半透明乳白色懸浮液，收集懸浮液在蒸餾水中透析3 d，取部分冷凍干燥備用。

1.4 DACNC的制備

取200 mL CNC懸浮液，加入2 g NaIO4，在45 ℃水浴中避光反應5 h，然后加入4 mL乙二醇，繼續水浴反應1 h以除去未反應的NaIO4，收集產物并透析3 d，得到DACNC懸浮液。采用鹽酸羥胺-肟化酸堿滴定法測定DACNC中的醛基含量[14]。

1.5 結構表征

1.5.1 紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR)

取適量MCC、CNC和DACNC干燥粉末放入壓片模具中，采用溴化鉀壓片法制樣。掃描范圍為4 000～400 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描次數為32 次/s。

1.5.2 粒徑分布和Zeta電位測定

將CNC和DACNC懸浮液(0.5 g/L)用馬爾文激光粒度儀測定粒徑尺寸和Zeta電位。

1.5.3 原子力顯微鏡(atomic force microscope，AFM)

吸取5 μL CNC和DACNC懸浮液(0.2 g/L)滴在新鮮剝離的云母片上，室溫干燥5 h制樣。

1.5.4 熱穩定性分析(thermogravimetric analysis，TGA)

準確稱取10 mg干燥的MCC、CNC或DACNC樣品進行熱失重分析。測試溫度為30～500 ℃，升溫速率為10 ℃/min，在氮氣氛圍下進行測定。

1.6 穩定Pickering乳液研究

1.6.1 Pickering乳液制備

固定油相體積占比50%和均質條件(10 000 r/min，2 min)，考察明膠和DACNC添加順序對乳液穩定的影響，具體如下：(1)明膠單獨穩定乳液(G/Oil)：3 mL 10 g/L明膠溶液+3 mL大豆油；(2)DACNC單獨穩定乳液(DACNC/Oil)：3 mL 5 g/L DACNC懸浮液；(3)明膠/DACNC穩定乳液(G/Oil/DACNC)：1.5 mL 10 g/L明膠溶液+3 mL大豆油(均質10 000 r/min, 1 min)+ 1.5 mL 5 g/L DACNC懸浮液(均質10 000 r/min, 1 min)；(4)DACNC/明膠穩定乳液(DACNC/Oil/G)：1.5 mL 5 g/L DACNC懸浮液+3 mL大豆油(均質10 000 r/min, 1 min)+ 1.5 mL 10 g/L明膠溶液(均質10 000 r/min, 1 min)；(5)明膠+DACNC穩定乳液(G+DACNC/Oil)：(1.5 mL 5 g/L DACNC懸浮液+1.5 mL 1%明膠溶液)+3 mL大豆油。

1.6.2 乳液微觀結構

利用光學顯微鏡觀察乳液的微觀結構。吸取20 μL 乳液滴在載玻片上，放置在顯微鏡下進行觀察。

1.6.3 乳液粒徑測定

利用馬爾文激光粒度儀測定乳液液滴的大小。設定分散相折射率和吸附率分別為1.460和0.001，連續相折射率為1.330。將樣品適當稀釋后，測定體積平均粒徑D4,3。

1.6.4 流變學特性

使用流變儀在25 ℃下對乳液的流變性能進行測定。在1%的固定應變下，0.1～100 rad/s內進行頻率掃描，記錄存儲模量(G′)和損耗模量(G″)。在0.01～100 s-1剪切速率內進行剪切掃描，以確定樣品的表觀黏度隨剪切速率的變化。

1.6.5 DACNC質量濃度對乳液穩定性的影響

固定明膠質量濃度10 g/L和油相體積占比50%，按照預先混合明膠和DACNC方式制備乳液，考察不同DACNC質量濃度(0、2、5和10 g/L)對乳液粒徑、微觀形態和流變性能的影響。

1.6.6 乳液穩定性分析

以10 g/L明膠和5 g/L DACNC，油相體積占比50%制備乳液。分析乳液在不同pH(3、5、7、9、11)、溫度(4、30、50、70 ℃)和離子強度(0、50、100、200 mmol/L)下的環境穩定性，對乳液外觀和微觀形態進行記錄。

2 結果與分析

2.1 FTIR分析

圖1 MCC、CNC和DACNC的FTIR圖譜Fig.1 FTIR spectra of MCC, CNC and DACNC

2.2 形貌、粒徑和電位分析

圖2-A為CNC和DACNC的AFM圖。CNC和DACNC均呈短棒狀，通過Nano Measurer軟件顯示CNC和DACNC的平均長度分別為175、132 nm。DACNC的長度較CNC明顯減小，這主要是纖維素大分子鏈中的部分β-1-4-糖苷鍵在氧化過程中裂解造成，這與已報道的類似研究結果一致[14,19]。如圖2-B所示，通過粒徑分布獲得的CNC和DACNC的平均粒徑為233 mm和189 nm，且呈現單峰分布。如圖2-C所示，CNC和DACNC的Zeta電位分別為(-46.8±1.6) mV和(-40.6±2.2) mV。DACNC的表面負電荷基團在氧化過程中有一定的損失，但仍然具有較好的穩定性。

A-AFM圖；B-粒徑分布；C-Zeta電位值圖2 CNC和DACNC的AFM圖、粒徑分布和Zeta電位值Fig.2 AFM images, particle sizes distribution and Zeta-potentials of CNC and DACNC

2.3 熱穩定性分析

圖3-A和圖3-B分別是MCC、CNC和DACNC的熱重(thermogravimetry，TG)和微商熱重(derivative thermogravimetry，DTG)曲線。如圖3-A所示，所有樣品的熱降解大致可分為3個階段。第一階段在30～100 ℃，主要是樣品中殘余水分蒸發；第二階段在150～350 ℃，主要是由于纖維素的熱降解造成的，包括糖苷鍵的分解、脫水，以及最后形成殘碳化合物；繼續升溫發生第三階段熱降解，主要是第一次降解過程中產生的物質發生的二次熱解[20]。升溫至500 ℃時，MCC、CNC和DACNC的殘余質量分別為5.31%、31.88%和30.37%，CNC和DACNC的殘余質量較MCC顯著增加，這是由于納米纖維素中硫酸化無定形和結晶區域在降解過程中具有阻燃劑作用造成的[21]。由圖3-B所示，MCC、CNC和DACNC的失重峰對應的溫度分別為330、200和260 ℃，說明DACNC和CNC的熱穩定性較MCC變差，主要是因為在硫酸水解引入磺酸根基團，使其分解活化能降低，因此降低了纖維素晶體的熱穩定性[21]。而DACNC的初始降解溫度較CNC高，這主要是醛基之間形成的半縮醛鍵造成的，從而提高了DACNC的熱穩定性。

A-TG曲線；B-DTG曲線圖3 MCC、CNC及DACNC的TG和DTG曲線Fig.3 TG and DTG curves of MCC, CNC and DACNC

2.4 明膠/DACNC協同穩定Pickering乳液研究

2.4.1 明膠和DACNC的添加順序對Pickering乳液穩定性影響

圖4為單獨明膠、DACNC穩定乳液和明膠/DACNC不同添加順序穩定乳液的外觀(第1～7天)和光學顯微鏡圖(第1天)。從外觀上看，單獨明膠和DACNC都能穩定乳液，但是底部出現更明顯和渾濁的水層，這是一些細小液滴和未吸附顆粒造成的。DACNC和明膠添加順序會影響其共同穩定乳液效果。DACNC的加入使得乳液層體積和穩定性增加，這可能是由于DACNC與明膠發生Schiff堿反應[22]，改善了乳液中的連續性網絡結構和乳液界面機械強度。明膠和DACNC預混合后再進行乳化操作，乳液的析水層最少。在4 ℃下貯存7 d后，所有乳液外觀均無變化，但單獨明膠穩定乳液的析水現象更為明顯，這與DACNC增加了連續相的網絡結構，使乳液的絮凝穩定性增加有關。所有乳液粒徑無明顯差異，說明明膠主導界面吸附，固定了液滴粒徑大小，而DACNC主要加強界面層和連續相的網絡結構[23]。后續所有乳液制備均采用DACNC和明膠預混合后再進行乳化操作。

圖4 單獨明膠、DACNC以及不同明膠和DACNC添加順序 制備的乳液外觀(第1-7天)和光鏡圖(第1天)Fig.4 The appearance (1-7 d) and light micrographs (1 d) of the emulsions stabilzied by gelatin, DACNC and different gelatin/DACNC addition sequence注：乳液外觀樣品從左至右分別為明膠單獨穩定乳液(G/Oil)、DACNC 單獨穩定乳液(DACNC/Oil)、DACNC/明膠穩定乳液(DACNC/Oil/G)、 明膠/DACNC穩定乳液(G/Oil/DACNC)、明膠+DACNC 穩定乳液(G+DACNC/Oil)

2.4.2 DACNC質量濃度對乳液粒徑及穩定性的影響

圖5為明膠和不同質量濃度DACNC懸浮液協同穩定的乳液光鏡、粒徑分布(第1天)以及乳液外觀圖片(第1～7天)。隨著DACNC質量濃度增加，析水層減少，且液滴平均尺寸逐漸增加且液滴形態更為均勻。隨著DACNC質量濃度從0增加到10 g/L，乳液液滴的平均粒徑從68 μm增加到195 μm。由于明膠和DACNC之間的Schiff堿反應導致液滴之間形成界面交聯結構，液滴在一定程度上能夠聚集形成大的液滴簇和凝膠網絡結構[23]。此外，高濃度的DACNC也會與明膠形成界面競爭吸附，導致乳液粒徑增大。由于乳液內部交聯網絡結構的形成，當前制備的乳液具有較好的貯藏穩定性。

圖5 不同DACNC質量濃度和明膠穩定乳液的光鏡、粒徑分布(第1天)以及乳液外觀(第1～7天)Fig.5 Light micrographs and droplets size distribution (1 d) as well as the appearance diagrams (1-7 d) of emulsions stabilzied by gelatin and different DACNC mass concentrations注：乳液外觀樣品從左至右為DACNC質量濃度分別為0、2、5和10 g/L的乳液

2.4.3 Pickering乳液流變學分析

圖6為DACNC質量濃度對乳液流變學特性的影響。如圖6-A所示。乳液黏度均隨剪切速率增加而降低，呈現剪切稀化現象；隨著DACNC質量濃度的增加，乳液的黏度明顯增加，表明DACNC增強了乳液體系的網絡結構[23]。這與DACNC自身的黏度增強效應和Schiff堿反應發生有關。如圖6-B所示，在低頻率下(0.1～10 rad/s)，所有乳液的儲能模量(G′)明顯高于其損耗模量(G″)，同時乳液模量隨DACNC質量濃度的增加而增加，乳液交聯網絡結構增強。在高頻率下(>10 rad/s)，明膠優異的乳化性能使乳液結構均一和穩定，而少量的DACNC添加會影響明膠的界面吸附排列和乳液內部網絡結構不均一，使其高頻率下乳液結構破壞。更多的DACNC導致乳液連續相網絡結構增強和Schiff堿交聯反應增強，乳液穩定性也相應增加。

A-乳液的動態黏度；B-乳液儲能模量G′和損耗模量G″圖6 不同DACNC質量濃度和明膠穩定乳液的動態黏度與 儲能模量G′和損耗模量G″Fig.6 Dynamic viscosity, storage modulus G′ and loss modulus G″ of emulsions stabilzied by gelatin and different DACNC concentrations

2.4.4 pH對Pickering乳液穩定性影響

圖7為固定明膠質量濃度10 g/L和DACNC質量濃度5 g/L以及油相體積占比50%的乳液在不同pH下的外觀(第1～7天)和光鏡圖片(第1天)。乳液在pH 3～11內都能形成外觀穩定的乳液，隨pH增加乳液析水現象減弱，這與在酸性條件下的電荷屏蔽有關，導致液滴之間的靜電排斥作用降低而傾向于聚結[24]。隨著pH增加，乳液穩定性增加，尤其是在pH 5時乳液液滴分布更緊密和均一。B型明膠等電點為4.8～5.1[11]，有研究報道明膠乳液在pH 3和pH 5時由于蛋白質聚集導致乳液無法穩定[25]。而在pH 5 時DACNC/明膠乳液具有較好的穩定性，這與Schiff堿反應和DACNC在連續相形成乳液交聯網絡結構有關，對于加強明膠乳液在酸性及等電點附近穩定性具有重要意義。

圖7 不同pH下明膠/DACNC穩定乳液的外觀 (第1～7天)和光鏡圖(第1天)Fig.7 The appearance (1-7 d) and light micrographs (1 d) of the emulsions stabilized by gelatin/DACNC at different pH values

2.4.5 溫度對Pickering乳液穩定性影響

圖8為固定明膠質量濃度10 g/L和DACNC質量濃度5 g/L以及油相體積占比50%的乳液在不同溫度處理1 h后的乳液外觀(第1～7天)和光鏡圖片(第1天)。所有溫度下處理后的乳液都具有較好的貯藏穩定性，隨著溫度升高，乳液析水層降低。低溫下的乳液具有較好的粒徑分布和致密性，主要依靠明膠優異的乳化性能和DACNC對連續相網絡增強作用。隨著溫度增加，Schiff堿反應增強，形成相互連接的液滴簇網絡結構，此時由于乳液網絡擴充而增加了乳液層體積，析水現象相對減弱。

圖8 不同溫度處理后明膠/DACNC穩定乳液的外觀 (第1～7天)和光鏡圖(第1天)Fig.8 The appearance (1-7 d) and light micrographs (1 d) of the emulsions stabilized by gelatin/DACNC at different temperatures注：圖中乳液樣品從左至右分別為4、30、50、70 ℃處理1 h 后的乳液外觀

2.4.6 離子強度對Pickering乳液穩定性影響

圖9為固定明膠質量濃度10 g/L和DACNC質量濃度5 g/L以及油相體積比例50%的乳液在不同離子強度下的外觀(第1～7天)和光鏡圖片(第1天)。當NaCl濃度為0 mmol/L時，乳液穩定性相對較差，析水層渾濁且乳化層存在絮凝現象，這與DACNC的靜電排斥阻礙其在界面和乳液網絡構建中的作用有關。隨著NaCl濃度增加，顆粒間的靜電排斥效應降低，其在界面處的吸附、排列程度增加，界面和網絡結構增強[24]。但離子強度過大(200 mmol/L)使液滴表面電荷屏蔽，影響了液滴間的排斥穩定和誘導液滴聚結，乳液穩定性降低[26]。

圖9 不同離子強度下明膠/DACNC穩定乳液的外觀 (第1～7天)和光鏡圖(第1天)Fig.9 The appearance (1-7 d) and light micrographs (1 d) of the emulsions stabilized by gelatin/DACNC at different ionic strengthens注：圖中乳液樣品從左至右分別為離子強度0、50、100和200 mmol/L 的乳液外觀

3 結論

本研究以MCC為原料通過硫酸水解法制備CNC，進一步利用高碘酸鈉氧化獲得DACNC。CNC和DACNC較MCC的初始降解溫度更低，但高溫下分解殘余質量增加。由于氧化過程中纖維素大分子鏈中的部分β-1-4-糖苷鍵斷裂，DACNC的長度較CNC降低。明膠和DACNC協同穩定Pickering乳液受到明膠和DACNC的添加順序、DACNC質量濃度以及外界環境(pH、離子濃度和溫度)的影響。DACNC和明膠預混合后再進行乳液制備具有更好的協同穩定乳液效果。由于DACNC表面的醛基與明膠表面的氨基發生Schiff堿反應，導致乳液界面強度和連續相中網絡結構的增強，乳液流變性和穩定性獲得明顯改善。隨著DACNC質量濃度的增加，乳液液滴尺寸逐漸增加，乳液黏度和模量相應增加，形成一定的液滴簇和凝膠網絡結構，乳液的穩定性增加。此外，明膠/DACNC協同穩定的乳液具有較好的pH、離子強度和熱穩定性，能夠解決單獨明膠和CNC穩定的Pickering乳液環境穩定性較差的瓶頸問題。