不同貯藏溫度下巴氏殺菌乳細菌多樣性研究

鄭家銘，洪意，吳瑜凡，方太松，申進玲，董慶利，王翔*

1(上海理工大學 健康科學與工程學院，上海，200093)2(華東理工大學 化學與分子工程學院分析測試中心，上海，200237) 3(上海海關動植物與食品檢驗檢疫技術中心，上海，200135)

巴氏殺菌乳是采用低溫殺菌的一種鮮奶，適度的熱加工可以滅活生乳中的致病菌和部分腐敗菌，同時最大程度地保留了生乳天然的營養成分和優良的感官品質[1]。我國巴氏殺菌乳的消費量約占乳品市場的20%，對標乳業發達國家的90%，國內巴氏殺菌乳仍具有可觀的發展空間[2-3]。巴氏殺菌工藝加工強度較低，終產品中仍有部分耐熱細菌或芽胞存活[4]，因此巴氏殺菌乳常需要結合冷鏈進行儲運，且更低的儲運溫度能延長其貨架期[5]。貯藏過程中溫度的失控可能會導致熱殺菌后存活的微生物細胞數量快速增加，并最終導致產品的變質。巴氏殺菌乳的菌群結構與其品質密切相關，而菌群結構易受到環境溫度的影響[6-7]，因此，了解貯藏過程的細菌多樣性變化對產品的貨架期預測和品質判斷具有重要作用。

目前，細菌群落結構和細菌多樣性研究中應用較為廣泛的是16S rRNA基因高通量測序，其具有高通量、高準確度和高覆蓋等優點[8]，能迅速準確揭示樣本微生物群落組成等信息。閆艷華等[9]應用高通量測序技術分析了奶牛養殖場采奶環節中4個不同的操作對生鮮乳細菌多樣性的影響，發現生鮮乳的品質與牛乳頭和采奶設備的潔凈程度密切相關。PORCELLATO等[10]對不同乳品廠生產的巴氏殺菌乳微生物多樣性進行研究，發現細菌群落的組成主要受生產月份和貯藏溫度的影響。可以看出，高通量測序技術的應用為當前的乳品中微生物多樣性研究提供了一個全面解析的手段。

本研究對溫度失控條件下巴氏殺菌乳中微生物組成進行表征，通過細菌擴增子測序技術分析巴氏殺菌乳貯藏過程中細菌群落多樣性和群落結構動態變化規律，分析其結構及功能演變，為巴氏殺菌乳貯藏過程中微生物動態變化研究及產品質量控制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

E.Z.N.A.Food DNA Kit食品基因組DNA提取試劑盒，美國Omega公司；DL 2 000 DNA分子質量標準、10×Loading Buffer，上海捷瑞生物工程有限公司；TransStart FastPfu超高保真PCR酶，上海生工生物工程有限公司；平板計數瓊脂(PCA)，青島海博生物公司。

Fresco 17高速冷凍離心機、Nano Drop 2000微量核酸蛋白定量儀，美國ThermoFisher公司；Gel Doc XR凝膠成像儀，美國Bio-Rad公司；Biometra TOne 96 G PCR儀，德國Analytik Jena公司；FC-B2V恒溫培養箱，德國MMM集團。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品

巴氏殺菌乳購自上海本地超市，產品標注的蛋白質和脂肪含量分別為3.1 g/100mL和3.5 g/100mL，2～6 ℃下保質期為7 d。購買后放置于有冰袋的冷藏箱內并立即運回實驗室，無菌分裝為3份，分別置于10、15、25 ℃貯藏。

1.2.2 基因組DNA提取及細菌總數測定

在10、15、25 ℃貯藏條件下，分別間隔24、12、4 h進行牛奶樣品無菌取樣，分別獲得10、10、9個時期樣品。使用試劑盒對上述樣品進行細菌基因組DNA提取，經細菌收集、裂解，DNA分離、純化等步驟獲得細菌基因組DNA，并測定其濃度和純度。同時參照GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》使用PCA培養基對菌落總數進行計數。

1.2.3 16S rRNA基因擴增及高通量測序

利用已提取的DNA作為模板，選擇特異性引物338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)，對細菌16S rRNA基因的V3～V4區進行擴增。20 μL反應體系：5×FastPfu Buffer 4 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2 μL、Forward Primer(5 μmol/L)0.8 μL、Reverse Primer(5 μmol/L)0.8 μL、FastPfu Polymerase 0.4 μL、Template DNA 10 ng，補ddH2O至20 μL。PCR擴增條件為：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共29個循環，最后72 ℃延伸10 min[11]。測序由上海美吉生物公司使用Illumina Miseq PE300測序儀完成。

1.2.4 生物信息學分析

采用FLASH(v1.2)軟件[12]對測序的原始數據進行拼接。使用QIIME(v1.9)分析軟件[13]對低質量的拼接序列進行過濾，并去除嵌合體，得到優質序列。根據Uparse(v7.0)以97%相似性水平上對優質序列進行聚類，得到可操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)，以各OTU中豐度最高的序列作為代表序列，采用核糖體數據庫項目(ribosomal database project，RDP)工具classifier貝葉斯算法對OTU代表序列進行分類學比對，物種分類數據庫使用的是Silva 138。在OTU水平上計算不同貯存溫度、時間樣品、Alpha多樣性、Beta多樣性。用稀疏曲線(rarefaction curve)和香農指數曲線(Shannon index curve)評估不同測序深度時群落的多樣性，以評價各樣本的測序量是否合理。超1指數(Chao1 index)和辛普森指數(Simpson index)用于評估樣品貯藏過程中細菌群落的豐度和多樣性的變化。使用UniFrac距離對樣品之間進行非加權的主坐標分析(principal coordinate analysis,PCoA)。

同時利用R軟件[14]生成不同分類水平上(門、屬)的物種分布圖。使用Tax4Fun[15]對16S擴增子數據進行基因組功能預測，其通過構建Silva數據庫的16S分類譜系與KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)數據庫中原核生物的分類譜系的線性關系，實現對菌群基因功能的預測。本研究中涉及的序列數據已提交至NCBI(National Center of Biotechnology Information)數據庫，登錄號為PRJNA796711。

2 結果與分析

2.1 樣品16S rRNA基因序列質量評估

通過Illumina MiSeq高通量測序，29個樣品共產生了1 475 026條高質量16S rRNA基因序列，10、15、25 ℃貯藏溫度下每個樣品平均分別產生44 730、68 753、50 728條。根據序列的97%相似性進行OTU劃分，并按照最小樣本序列數進行抽平，共得到2 258個OTU進行進一步分析。

從稀疏曲線(圖1-a)可以看出，隨著測序量的增加，新增OTU的速度變緩，同時Shannon指數曲線逐漸平穩(圖1-b)。說明現有的測序量比較充足，能夠反映樣品中絕大部分的細菌物種信息。因此當前測序量滿足進行生物信息分析的條件。

a-稀疏曲線；b-Shannon指數曲線圖1 巴氏殺菌乳的稀疏曲線和Shannon指數曲線Fig.1 Rarefaction curves and Shannon index curves of pasteurized milk samples

2.2 巴氏殺菌乳細菌群落多樣性分析

在生態學研究中Chao1指數和Simpson指數是反映細菌群落Alpha多樣性的重要指標，Chao1指數數值與細菌群落豐富度呈正相關，而Simpson指數數值越大細菌群落多樣性越低。在貯藏過程中巴氏殺菌乳的細菌菌群豐度隨時間變化(圖2)。3個溫度下的貯藏初期，細菌豐度波動較小；10 ℃下貯藏到第5～7天細菌多樣性急劇下降，15、25 ℃條件下，多樣性驟降的區間分別發生在48～72 h和12～20 h；在貯藏后期巴氏殺菌乳中的細菌群落多樣性降低到較低的水平，說明體系中出現了優勢菌種。Chao1指數與Simpson指數變化規律表明3個貯藏溫度下巴氏殺菌乳中細菌多樣性都是隨著貯藏時間增加而降低，但是降低發生的時間不同，而且貯藏溫度越低，細菌群落結構變化越慢。丁瑞雪等[16]也發現巴氏殺菌乳在0 ℃貯藏能保持長時間的細菌多樣性，而在10 ℃的貯藏過程中群落的物種豐度下降較快。

a-10 ℃；b-15 ℃；c-25 ℃圖2 巴氏殺菌乳貯藏過程中Chao 1指數和Simpson指數變化Fig.2 Changes of Chao1 index and Simpson index during storage of pasteurized milk

使用Beta多樣性分析呈現不同溫度貯藏的巴氏殺菌乳間的細菌群落結構的相似性和差異性，在OTU水平上進行UniFrac的非加權PCoA，結果如圖3所示，第一主坐標和第二主坐標的貢獻率分別為33.20%和10.65%。15 ℃及25 ℃貯藏的樣品呈現出一定的重疊現象，說明這兩個溫度貯藏的巴氏殺菌乳的細菌群落結構具有一定的相似性。而10 ℃貯藏的巴氏殺菌乳樣品呈現出一定的聚類趨勢，說明該溫度下貯藏的樣品相比于另外兩個溫度組具有特殊的群落結構。

綜合以上多樣性分析，發現貯藏溫度會影響巴氏殺菌乳貯藏過程中細菌群落結構，并且控制其中物種的演替速度，進而影響產品的貨架期。

圖3 巴氏殺菌乳細菌群落的UniFrac非加權PCoAFig.3 PCoA of bacterial community in pasteurized milk based on unweighted UniFrac distance

2.3 巴氏殺菌乳細菌群落構成分析

基于OTU的物種分類分析，在相似性為97%水平下，不同樣品的細菌種類共注釋到32個門，其中含量最多的前5位依次為硬壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)和螺旋菌門(Spirochaetae)。由圖4可知，在3個恒定溫度保藏的巴氏殺菌乳，在貯藏過程中樣品的各細菌門的變化趨勢基本相同。硬壁菌門在貯藏始終占主導地位，在貯藏前期占比約為40%，貯藏后期硬壁菌門在菌群中進一步擴大優勢成為絕對優勢細菌門，楊雪[17]對巴氏殺菌乳模擬自然腐敗過程也得到相同的結果。貯藏初期的次優勢細菌門是變形菌門，隨著貯藏時間的延長，其序列數量變化呈現出與硬壁菌門相反的趨勢，表明在貯藏過程中兩者之間可能存在相互作用[18]。

a-10 ℃；b-15 ℃；c-25 ℃圖4 基于門水平的巴氏殺菌乳中細菌豐度變化Fig.4 Changes of bacterial abundance at the phylum level in pasteurized milk注：相對豐度<0.01的合并為其他(圖5同)

進一步對巴氏殺菌乳細菌群落組成進行分析，注釋到的物種豐度共計766個屬，其中豐度高于1%的屬共計7個，分別為芽胞桿菌屬(Bacillus)、腸球菌屬(Enterococcus)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、螺菌科UCG-005屬(Oscillospiraceae)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)和羅氏斯通氏菌屬(Ralstonia)。由圖5可知，10 ℃貯藏的巴氏殺菌乳在0～96 h內其微生物多樣性保持恒定，樣品的細菌總數無明顯變化；貯藏96 h后，腸球菌屬和不動桿菌屬等非優勢菌屬的豐度逐漸下降，而芽胞桿菌屬的占比快速上升，與此同時菌落總數也在快速增加，芽胞桿菌屬占據優勢，細菌群落多樣性下降。15 ℃貯藏的樣品在前36 h內，腸球菌屬先增加后減少，其余大部分菌屬的豐度在保持一個動態恒定的階段，但是傳統平板的計數上，可培養的微生物數量從2.1 lgCFU/mL 增加到4.0 lgCFU/mL；在48～108 h內芽胞桿菌屬的豐度快速上升，成為貯藏后期的優勢菌屬，菌落總數也在不斷增加。巴氏殺菌乳在25 ℃貯藏的細菌菌落結構變化更加快速，貯藏4 h后腸球菌屬的豐度明顯下降，貯藏到12 h，微生物的數量增加了1個數量級，繼續貯藏12 h，細菌總數達到7.3 lgCFU/mL，超出限量標準，細菌組成與另外兩個溫度結果相似，芽胞桿菌屬仍是貯藏后期的優勢菌屬。

a-10 ℃；b-15 ℃；c-25 ℃圖5 巴氏殺菌乳細菌屬水平上菌落豐度及菌落總數Fig.5 Bacterial abundance at the genus level and aerobic bacterial count in pasteurized milk

2.4 巴氏殺菌乳細菌群落功能預測分析

基于Tax4Fun方法對巴氏殺菌乳中細菌群落進行基因組功能預測，該方法主要是通過構建SILVA分類與KEGG數據庫中原核生物分類間的線性關系，實現對微生物群落功能的預測。本研究中獲得了264個預測的通路功能，其中豐度前15的功能如圖6所示。其中涉及氨基酸、核苷酸和糖類等代謝通路的有8項，3個溫度下隨著貯藏時間的推移，嘧啶、嘌呤等核苷酸代謝功能通路豐度下降，精氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸代謝通路豐度增加，絲氨酸和蘇氨酸代謝通路豐度基本保持不變，此外，在貯藏過程中淀粉和蔗糖等糖類代謝通路豐度下降，發揮膜運輸及信號傳導等環境信息處理功能的通路豐度下降，氨酰合成及核糖體合成通路豐度下降，氨基酸和核苷酸糖代謝通路豐度在10 ℃和15 ℃貯藏過程中保持恒定，而在25 ℃貯藏過程中逐漸增加。由圖6可知3個溫度貯藏下的牛奶整體功能類型變化趨勢相似，個別功能通路存在一定差異。

a-10 ℃；b-15 ℃；c-25 ℃圖6 巴氏殺菌乳中細菌功能預測分布Fig.6 Function prediction distribution of bacteria in pasteurized milk

3 討論

巴氏殺菌乳經過適度的熱加工處理，保留了生乳中大量的營養成分及風味物質，深受消費者的喜愛。研究表明，巴氏殺菌乳的變質主要是熱加工后殘留細菌及后污染的細菌生長和繁殖所引起[19]，在巴氏殺菌工藝中，生乳內大部分微生物被殺滅，部分耐熱性細菌及芽胞存活并殘留。這些微生物在后期的貯藏過程中緩慢復蘇并生長，合適的貯藏條件下貨架期內其品質和安全是可以保證的，但是在貯藏溫度失控的情況下，殘留細菌的生長代謝加快，造成產品腐敗變質。因此，探索溫度失控條件下巴氏殺菌乳貯藏過程中微生物的動態變化規律，對于產品質量控制及貨架期預測，具有重要的理論意義和應用價值。

通過16S rRNA基因擴增子高通量測序技術對不同貯藏條件下巴氏殺菌乳的微生物多樣性進行分析。研究結果表明，在測定3個溫度的貯藏過程中，巴氏殺菌乳中細菌多樣性都逐漸降低，芽胞桿菌屬是引起巴氏殺菌乳自然腐敗變質最主要的細菌屬。此結果與MUGADZA等[20]分析延長貨架期(extended shelf life，ESL)牛奶貯藏過程中細菌群落演變的研究結果一致。芽胞桿菌屬在自然界中分布廣泛，其形成的高耐熱芽胞能抵抗生乳的熱加工環節，部分細菌還會產生穩定的毒素[21]，對乳品安全和消費者健康產生威脅。RASOLOFO等[22]通過微濾及添加CO2來抑制牛奶貯藏過程中嗜濕性腐敗細菌的生長；LI等[23]使用二次熱加工，第一次加熱將芽胞桿菌減少到可接受的范圍，第二次則是滅活萌發的芽胞，以延長牛奶的保質期。這些措施進一步保證了牛奶的安全，但過度加熱會降低營養價值、影響風味。平衡乳品營養質量和微生物安全以及經濟成本的關系，仍然是巴氏奶加工需要持續探索的問題。

非培養方法的分子生物學手段能檢測出樣本內部的活菌和死菌，傳統的菌落總數檢測方法可以定量食品內可培養細菌的數量，這兩種方法各有優勢，又互相補充[24]。在本研究中這兩種方法顯現出某些值得關注的共同特征：第一，牛奶貯存初期，可培養的細菌處在延滯期，這個階段細菌多樣性基本恒定；第二，細菌總數的對數增長期與物種多樣性指數驟降的時間區間基本重合，但前者往往持續的更長，說明在牛奶貯藏過程的中后期，只有單一的物種或者菌屬在快速生長，這點在細菌菌落組成上得到證實。這說明基于16S rRNA基因的細菌多樣性分析方法可輔助判斷巴氏殺菌乳的貨架期，而腐敗初期占比上升的芽胞桿菌屬可作為品質下降的指示菌屬。

在Tax4Fun功能預測分析中，樣品中存在豐富的細胞代謝及環境信息處理功能相關基因，這些基因豐度的演變與乳品的品質相關[25]。在3個溫度下的貯藏初期，牛奶中游離氨基酸的含量較少，氨基酸代謝通路的豐度較低，隨著貯藏時間的延長，牛奶中蛋白質水解成氨基酸，微生物利用精氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸等氨基酸為生命活動提供能量，此類氨基酸代謝通路豐度上升。該功能分析結論與李蕊等[26]實測巴氏殺菌乳幾種常見的氨基酸含量變化的結果一致。NIYAZBEKOVA等[27]對山羊奶進行微生物群落組成及功能預測分析，發現成熟乳相比于初乳，其細胞代謝、遺傳信息處理及環境信息處理通路的豐度上升，與本文的結果相同。有研究表明異源生物降解和代謝、脂類代謝相關的途徑與乳品風味之間存在相關性，因此這些基因可作為乳品感官質量的一個指標[28]。本研究中，巴氏殺菌乳在3個溫度的貯存過程中功能通路豐度變化基本相同，可能與微生物菌群變化相同有關。

4 結論

本研究通過高通量測序技術揭示了不同貯藏溫度下巴氏殺菌乳貯藏過程中細菌群落組成結構及功能演變規律，檢測到32個細菌門，766個細菌菌屬，多樣性指數和豐富度指數表明貯藏過程中細菌結構組成逐漸單一化，是巴氏殺菌乳品質下降在菌相分析上的特征。芽胞桿菌屬貯藏初期盡管相對豐度較低，但在溫度失控的貯藏條件下仍對巴氏殺菌乳的細菌群落結構和營養品質有較大影響，且溫度越高影響越大。本研究結果有助于了解溫度對巴氏殺菌乳細菌群落組成的影響，為巴氏殺菌乳的品質控制提供理論依據。