底物親和設計提高腈水解酶Nit6803活性

劉欣悅，韓來闖，劉中美

(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

腈水解酶(Nitrilase，EC 3.5.5.1)，是一類可以將氰基一步水解為羧酸的酶，廣泛分布于植物、動物、細菌、真菌和古菌中[1-3]。除了天然酶資源豐富、反應條件溫和以外，Nitrilase還具有較強的區域選擇性和立體選擇性，因此是多種重要大宗化工品、藥物中間體的理想生物催化劑[4]。然而，目前鑒定的天然Nitrilase底物譜較窄、活性低、熱穩定性差，極大地限制了其規模應用[5]。近些年，人們不斷嘗試通過天然菌種分離、宏基因組分析等手段挖掘新型Nitrilase[6]。但是受制于酶活性與穩定性間的“trade-off”效應，嗜溫生物來源的Nitrilase活性較好但穩定性差；嗜熱生物的Nitrilase穩定性強但活性極低[7-8]。因此，直接挖掘得到高性能天然Nitrilase的希望十分渺茫。

酶分子改造是提升酶學性質的有效手段，主要包含3種基本策略：定向進化、理性設計及半理性設計，針對Nitrilase的分子改造也獲得了一定效果[9]。例如，SCHREINER等[10]基于易錯PCR對來源于AlcaligenesfaecalisJM3的Nitrilase進行定向進化，提高其活性及對低pH的耐受性。定向進化最為依賴高通量篩選方法，雖然一些顯色試劑和pH指示劑已被用來篩選Nitrilase的活性，但是依然遠未達到理想的篩選通量[11]。因此，現階段構建大容量的突變體庫對Nitrilase定向進化依然十分困難。而另一方面，隨著蛋白質結構預測、功能分析軟件不斷開發，以及計算機算力的指數增長，蛋白質半理性、理性設計的易用性和可靠性快速提升。例如，基于人工智能的蛋白質全原子結構預測平臺AlphaFold2的開源，將結構生物學從實驗解析帶入了大規模預測的新階段[12]。華盛頓大學David Baker課題組開發的Rosetta套件功能多樣，且具備良好的可編程性，經過多年發展，已經成為蛋白質分子改造、人工蛋白質設計的強大工具[13]。而分子對接、分子動力學模擬及量子化學計算的廣泛應用，為在微觀上觀察酶分子運動、解析催化機制提供了可能[14-16]。多種理性設計策略在Nitrilase的改造上也得到成功應用，大幅提升其酶學性質。例如，湯曉芒[17]對來源于古菌Pyrococcusabyssi的腈水解酶PaNit通過分子模擬及MaCrodox程序和TK-SA模型等計算方法獲得熱穩定性增強且仍具備活力的突變體。YU等[18]通過催化口袋底物結合位點的重設計實現了腈水解酶對映選擇性的調控，為腈水解酶在不對稱催化中的應用奠定基礎。對雜合腈水解酶BaNIT進行組合突變設計，可提升其可溶表達、對映選擇性及活性[19]。

眾所周知，酶與底物的結合是其發揮催化功能的先決條件。大量研究表明，優化催化口袋，提升酶與底物的親和力，能夠有效提高酶活力[20]?；诖耍狙芯刻岢鲆环N酶-底物親和設計策略，以提高酶活力。如圖1所示，首先，設計催化口袋殘基的單點飽和突變，并用Cartesian_ddG方法過濾對蛋白質穩定性不利影響的突變。然后使用自由能微擾(free energy perturbation,FEP)方法計算底物親和力變化，經酶活力表征獲得正向突變。最后，進一步做組合突變設計，提升活性。本研究選擇來源于Syechocystissp.PCC6803的腈水解酶Nit6803作為研究對象，該酶底物譜較廣，但酶活力較低，無法滿足應用需求[21-22]。經過本研究提出的底物親和策略改造，獲得了催化煙腈活性提升3.56倍的突變體，證明該策略的有效性。

圖1 酶-底物親和改造策略Fig.1 Enzyme-substrate affinity modification strategy

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種與質粒

克隆宿主EscherichiacoilJM109、表達宿主EscherichiacoliER2566、表達質粒pET-24a(+)，本實驗室保藏。

1.1.2 主要試劑

胰蛋白胨、酵母提取物，Oxoid公司；氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉、咪唑、煙酸，國藥有限化學試劑有限公司；3-氰基吡啶，Sigma公司；異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG)、卡那霉素，上海生工生物工程有限公司；培養基中的卡那霉素終質量濃度為50 μg/mL。

1.1.3 培養基

LB培養基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母提取物5，氯化鈉10。固體培養基加入20 g/L瓊脂粉。2×YT培養基(g/L)：胰蛋白胨16，酵母提取物10，氯化鈉5。

1.1.4 緩沖液

PBS緩沖液：氯化鈉8 g，氯化鉀0.2 g，磷酸氫二鈉1.42 g，磷酸二氫鉀0.27 g，調pH至7.4，用去離子水定容至1 L。Binding buffer：0.2 mol/L 磷酸二氫鈉，0.2 mol/L 磷酸氫二鈉，調pH為7.4，加入20 mmol/L 咪唑。Washing buffer：上述Binding buffer中咪唑濃度調整至500 mmol/L。

1.2 實驗方法

1.2.1 分子對接

從PDB數據庫獲得Nit6803的三維結構(PDB code:3 WUY)，從PubChem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得底物3-氰基吡啶的三維結構。使用軟件Schr?dinger的Glide模塊進行分子對接(extra precision模式)，生成50個poses結果。結合對接打分及視覺判斷，選擇合適的對接pose，獲得Nit6803結合3-氰基吡啶的復合體結構。定義距離底物5 ?以內的氨基酸為組成催化口袋的殘基。使用在線工具PLIP(https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/plip-web/plip/index)分析催化口袋殘基與底物間的相互作用。

1.2.2 折疊自由能計算

使用基于Rosetta的Cartesian_ddG方法計算點突變對蛋白質折疊自由能的影響[23]。首先，通過內坐標relax對Nit6803的初始晶體結構優化，優化時對蛋白骨架及殘基側鏈重原子添加坐標限制勢。選擇能量最低的結構進行笛卡爾坐標relax，進一步優化結構。笛卡爾坐標relax過程中不限制蛋白骨架及殘基側鏈重原子坐標。使用兩步relax優化后的結構進行Cartesian_ddG計算，根據相比于野生型的G評價突變對酶穩定性的影響。定義G≤20.93 kJ/mol為對蛋白穩定性沒有顯著影響。

1.2.3 酶-底物結合自由能計算

使用自由能微擾/漢密爾頓副本交換分子動力學(FEP/hamiltonian replica exchange molecular dynamics, FEP/HREMD)計算酶與底物的結合自由能。計算所需文件使用在線工具CHARMM-GUI(https://charmm-gui.org/)生成，然后使用NAMD 2.14軟件進行計算，副本數量設定為32。計算體系為邊界10 ?的正方體盒子，其中填充含有0.15 mol/L K+和Cl-的中性TIP3顯性水模型。

1.2.4 分子動力學模擬

使用軟件NAMD 2.14進行CHARMM36力場的分子動力學模擬計算。3-氰基吡啶的拓撲文件及力場參數由CGenFF生成。計算體系為邊界10 ?的正方體盒子，其中填充含有0.15 mol/L K+和Cl-的中性TIP3顯性水模型。計算步長為2 fs，非鍵相互作用的cutoff設定為12 ?。使用Particle Mesh Ewald(PME)實現周期性邊界條件的應用。動力學模擬過程包含1 ns在NVT系綜下的水平衡，60 ps NVT系綜下0～300 K的升溫，以及20 ns在NPT系統下300 K的常規動力學模擬。使用Bio3D分析模擬過程的均方根偏差(root mean square deviation, RMSD)及不同殘基骨架的均方根波動(root mean square fluctuation, RMSF)。

1.2.5 定點突變

腈水解酶Nit6803基因，由蘇州金唯智公司進行密碼子優化和基因合成，并連接至表達載體pET-24a(+)NdeⅠ和XhoⅠ酶切位點之間，6×His-tag融合在Nit6803的C端，得到表達質粒pET24a-Nit6803。以該質粒作為模板，通過全質粒PCR及無縫克隆構建Nit6803突變體表達質粒。50 μL的PCR擴增體系包含：2×PrimeSTARTMMax DNA Polymerase(Takara，日本)25 μL、上下游引物各2 μL，模板0.5 μL、ddH2O 20.5 μL。PCR擴增反應條件為98 ℃預變性3 min，30個循環的98 ℃變性15 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min 45 s，最后72 ℃延伸5 min。PCR產物用DpnⅠ消化酶消化2～3 h，以去除模板。純化后的片段使用ABclonal MultiF Seamless Assembly Mix(ABclonal Technology，中國)通過引物的同源臂序列無縫克隆自組裝，進而轉化至E.coliJM109感受態細胞中，涂布于LB平板，37 ℃過夜培養。接取單菌落培養后，送蘇州金唯智公司測序驗證。本研究所用引物見表1。

1.2.6 酶的表達與純化

將表達質粒轉化至E.coliER2566感受態細胞，單菌落接種至含有3 mL LB的試管中，37 ℃、200 r/min培養8～10 h。以2%(體積分數)的接種量轉接種子液到含有5 mL LB試管中，37 ℃、200 r/min培養至OD600≈0.6，添加終濃度為0.5 mmo/L的IPTG。在25 ℃、200 r/min下繼續培養12～16 h，收取菌液用于全細胞酶活力檢測。

表1 本文所用引物及其序列Table 1 Primers used in this study

挑取單菌落至含有3 mL LB的試管中，37 ℃、200 r/min條件下培養8～10 h。以1%(體積分數)的接種量轉接種子液至含有100 mL 2×YT培養基的三角瓶中，37 ℃、200 r/min條件下培養至OD600≈0.6，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，溫度調整至25 ℃繼續培養12～16 h。經10 000 r/min離心3 min收集菌體，棄上清液，用20 mL Binding buffer重懸，于冰水混合物中超聲破碎。破碎液在4 ℃、12 000 r/min條件下離心30 min，取上清液過0.22 μm濾膜。采用親和層析的方法純化腈水解酶，純化柱為GE公司的HisTrap HP 5 mL柱。用Binding buffer平衡純化柱后上樣，然后用5～10個柱體積的Binding buffer洗去雜蛋白，目的蛋白用Washing buffer梯度洗脫并收集活性蛋白。蛋白濃度使用Bradford法定量，SDS-PAGE檢測蛋白純度。

1.2.7 酶活力測定

全細胞活性測定：使用PBS將細胞OD600調至2。取100 μL菌液，加入400 μL PBS和500 μL 100 mmol/L 3-氰基吡啶溶液，充分混勻后于37 ℃金屬浴中反應10 min。反應液12 000 r/min離心10 min，取上清液經0.22 μm濾膜過濾。純酶活性測定：用PBS將純酶的質量濃度稀釋至0.5 mg/mL，取10 μL至1.5 mL離心管中，加入490 μL 100 mmol/L 3-氰基吡啶溶液，充分混勻后于37 ℃金屬浴中反應10 min。加入500 μL乙腈終止反應，過0.22 μm濾膜。

使用HPLC測定反應產物中煙酸含量。色譜柱為Diamonsil C18(2) 5 μm 250 mm×4.6 mm(迪馬科技，中國)，流動相為乙腈和水的混合液[V(水)∶V(乙腈)=2∶1]。檢測波長為210 mm，柱溫40 ℃，流動相流速為0.6 mL/min，進樣量10 μL，檢測間隔為10 min，每組數據至少進行3次平行實驗。單位酶活力定義為在37 ℃下每分鐘催化3-氰基吡啶生成1 μmol 煙酸所需要的酶量(U)。比酶活力為每毫克腈水解酶所具有的酶活力(U/mg)。

1.2.8 熱穩定性測定

將酶質量濃度調整至0.5 mg/mL，在金屬浴40 ℃和50 ℃下分別處理0、0.5、1、2、4 h取樣，測定其酶活力，以未經熱處理的酶活力作為100%，分析其穩定性。

1.2.9 分批補加3-氰基吡啶催化合成煙酸

反應體系為50 mL于37 ℃、200 r/min的搖床中進行催化合成，其中菌液OD600為10，每次添加50 mmol/L 3-氰基吡啶，共添加10次至終濃度為500 mmol/L。在一定時間取樣利用HPLC檢測煙酸生成量與底物殘留量。

2 結果與分析

2.1 單點突變設計及表征

利用軟件Schr?dinger將3-氰基吡啶對接至Nit6803的晶體結構中，獲得酶-底物復合體結構(圖2-a)。定義距底物5 ?范圍內的氨基酸殘基組成催化口袋，包含10個位點：Glu53、Tyr59、Phe64、Thr139、Tyr140、His141、Trp170、Met197、Val198和Phe202(圖2-b)。由于Pro對蛋白質的二級結構影響較大，因此不考慮突變為Pro的設計。使用Rosetta的Cartesian_G計算催化口袋180個單點突變的折疊自由能，并計算相比于野生型(wild type, WT)的變化(G)，計算結果如圖2-c所示。定義G≤5為對蛋白的穩定性影響不大，共包含86個單點突變。進一步利用FEP/HREMD計算這些突變體的底物結合自由能，并與WT相比較(Gbinding)。定義Gbinding≤-1為對底物親和有顯著影響，包含10個單點突變體，結果見圖2-d。

構建10個設計的單點突變體，誘導表達后測定全細胞酶活力。以WT的酶活力作為100%，結果如圖2-e所示，突變體F64Y、W170G的酶活力顯著高于野生型，分別達到野生型的200%、150%，V198D與野生型酶活力接近，其余突變體酶活力明顯降低。進一步，對F64Y和W170G純化并測定純酶比酶活力，分別為(10.04±0.24)U/mg和(7.1±0.41)U/mg，顯著高于WT(4.93±0.48)U/mg(圖2-f)。由于催化口袋殘基較多，其組合突變的數量龐大，難以窮舉設計，因此首先對單點飽和突變進行設計和表征。以上結果表明，通過底物親和力設計策略，成功獲得活性顯著提升的單點突變體，證明了策略的有效性。

a-酶-底物復合體結構；b-催化口袋示意圖；c-單點突變Cartesian_G折疊自由能變化；d-單點突變FEP結合自由能變化； e-單點突變體全細胞相對酶活力；f-單點突變體比酶活力圖2 單點突變設計及酶活力表征Fig.2 Single-point mutation design and enzyme activity characterization

2.2 組合突變設計及表征

由單點突變體的酶活力結果可知Phe64和Trp170兩個位點對于該酶催化活性有顯著影響，因此基于這兩個位點做組合突變設計。與單點突變的設計策略類似，首先使用Cartesian_G計算324個組合突變體的折疊自由能，并計算相比于WT的變化(G)。計算結果如圖3-a所示，G≤5的有37個組合突變，且集中于F64H、F64 W、F64Y和W170F、W170Y幾種突變情況。這說明，由于WT中Phe64和Trp170都是大位阻芳香側鏈殘基，突變成其他類型側列氨基酸后對整體的折疊自由能影響較大。進一步，利用FEP/HREMD對這些突變體的底物結合自由能進行計算，結果顯示，共有14個突變體的底物結合自由能相比于WT降低(圖3-b)。其中，僅有F64Y/W170G組合突變的底物結合自由能比單點突變的F64Y更低。

選擇Gbinding最低的F64Y/W170G，測定全細胞活性，結果顯示，F64Y/W170G的全細胞活性為野生型的476%(圖3-c)。對F64Y/W170G純酶的酶活力進行測定，其比酶活力為(22.48±0.64) U/mg，為野生型的4.56倍(圖3-d)。該結果表明，針對Phe64和Trp170兩個位點進行組合突變設計，并通過底物親和計算，得到相比于單點突變進一步提升活性的突變，證明了本文提出的設計策略的可靠性。

a-組合突變Cartesian_ΔΔG折疊自由能變化；b-組合突變FEP結合自由能變化；c-組合突變全細胞相對酶活力；d-組合突變比酶活力圖3 組合突變設計及酶活力表征Fig.3 Combinatorial mutation design and enzyme activity characterization

為了解析組合突變F64Y/W170G顯著提升Nit6803催化3-氰基吡啶活性的分子機制，對WT和F64Y/W170G與底物結合復合體做20 ns的分子動力學模擬計算(圖4-a)。由于活性中心與待催化基團的距離與酶的活性高低關系密切[24]，我們分析了模擬過程中Nit6803活性中心Cys169的巰基和底物3-氰基吡啶的氰基之間的距離。結果表明，得益于F64Y/W170G與底物更高的親和力，其活性中心與底物間的距離相比WT更近(圖4-b)，這也是其具備更高活性的重要原因。進一步，對WT和F64Y/W170G與底物間的相互作用分析，結果表明，F64Y/W170G保持了和WT類似的酶-底物相互作用：Tyr140與3-氰基吡啶的吡啶環形成π-π堆疊，Phe64、Val198與3-氰基吡啶存在疏水相互作用(圖4-c)。

2.3 突變體的熱穩定性分析

本研究提出的設計策略首先使用Cartesian_G排除折疊自由能顯著提升的突變，以防止突變對熱穩定性的不利影響。為了驗證該步驟的有效性，測定WT與F64Y/W170G分別在40、50 ℃下處理后的殘余酶活力。以未熱處理的酶活力作為100%，結果如圖5-a所示，F64Y/W170G與WT的穩定性基本一致，甚至在40 ℃下F64Y/W170G穩定性略優于WT。對未結合底物的WT和突變體進行動力學模擬分析，結果如圖5-b～圖5-d所示，RMSD結果顯示突變體的整體波動小于野生型。F64Y/W170G的RMSF和回轉半徑Rg與WT相比沒有明顯差異，進一步證明了F64Y/W170G和WT相比，不論是各殘基還是蛋白整體的穩定性差別不大。以上結果表明通過本研究提出的設計策略，成功大幅提高了Nit6803活性的同時沒有影響其熱穩定性。

a-300 K下野生型和突變體F64Y/W170G的RMSD值；b-野生型和突變體的活性中心Cys169巰基與底物氰基之間的距離； c-野生型和突變體F64Y/W170G與底物間的相互作用圖4 突變體F64Y/W170G分子動力學模擬分析及與底物之間相互作用Fig.4 Molecular dynamics simulation analysis and interaction with substrate of mutant F64Y/W170G

a-野生型與突變體的熱穩定性；b-400 K下野生型與突變體的RMSD值；c-400 K下野生型與突變體的RMSF值； d-400 K下野生型與突變體的回轉半徑Rg值圖5 突變體F64Y/W170G的熱穩定性分析Fig.5 Thermal stability analysis of mutant F64Y/W170G

2.4 分批補加3-氰基吡啶催化合成煙酸

首先添加50 mmol/L底物進行全細胞催化反應，觀察在不同時間的底物殘留和產物生成情況，如圖6-a所示，WT在40 min可以轉化90%的3-氰基吡啶，在60 min完全轉化；F64Y/W170G在20 min可以轉化90%的底物，25 min可完全轉化為產物。說明F64Y/W170G的催化速率更快，同時確定WT與F64Y/W170G分批補加底物的時間間隔分別為40、20 min。因為采用的等OD值的菌液進行催化，為了減少表達量差異對于催化能力的影響，通過SDS-PAGE檢測兩者的表達情況，結果如圖6-b所示，WT與F64Y/W170G相同OD值下表達基本一致。說明突變體確實是由于酶活力的提升導致催化速率的加快。通過分批補加底物進行全細胞催化，F64Y/W170G結果如圖6-c所示，轉化95%的底物生成煙酸需要250 min，在430 min時檢測不到底物，說明無底物殘留，完全轉化為煙酸。WT結果如圖6-d所示，轉化95%的底物需要540 min且到600 min時仍可檢測到底物存在。綜上所述，F64Y/W170G催化3-氰基吡啶能力強于WT，分批補加共500 mmol/L 3-氰基吡啶后達到95%的轉化率WT需要9 h，而F64Y/W170G只需4 h，相對于野生型來大幅縮短了催化時間。

M-Marker，1-WT，2-F64Y/W170G a-野生型與突變體對于50 mmol/L 3-氰基吡啶的反應過程；b-野生型與突變體蛋白表達情況 c-F64Y/W170G分批補加3-氰基吡啶催化結果；d-WT分批補加3-氰基吡啶催化結果圖6 分批補加3-氰基吡啶催化合成煙酸Fig.6 Catalytic synthesis of nicotinic acid by adding 3-cyanopyridine in batches

3 結論

本文提出了一種結合Cartesian_G和FEP/HREMD的酶-底物親和力設計策略，并利用該策略成功提升了腈水解酶Nit6803對3-氰基吡啶的催化活性，同時沒有對酶的熱穩定性造成不利影響。眾所周知，酶活性與穩定性之間的“trade-off”效應一直是酶分子改造的瓶頸，而本研究提出的策略為突破這一瓶頸的理性設計提供了新的范例。另外，本研究提出的策略直接計算所有單點突變和組合突變的影響，相比于傳統的基于丙氨酸掃描的半理性設計方法，具有更大的覆蓋范圍。

天然腈水解酶活性較低，嚴重限制了其工業應用。本研究通過理性設計和分子改造，Nit6803催化3-氰基吡啶的活性顯著提升，其中組合突變F64Y/W170G的比酶活力達到了WT的4.56倍。通過分批補加底物進行全細胞催化時，催化500 mmol/L 3-氰基吡啶使達到95%的轉化率野生型需要9 h，突變體只需要4 h，大幅縮短了催化時間，有望應用于工業生產。而本研究提出的設計策略可以成為酶分子催化不同反應的通用改造方法，不僅推進腈水解酶的應用，也為其他酶的改造提供了新的思路。