雙頻超聲輔助酶法改善水產品中重金屬的提取研究

劉馨娜，郝麗玲，徐斐，曹慧，袁敏，葉泰，吳秀秀，陰鳳琴，于勁松，黃椿華

(上海理工大學 健康科學與工程學院，上海，200093)

水產品富含蛋白質、不飽和脂肪酸和多種人體必需的微量元素，深受大眾的喜愛。水產品中重金屬殘留超標事件頻頻發生。2021年，國家及各省市市場監管局的抽檢數據顯示，在包括北京、上海、深圳在內的絕大多數省市均出現食品中重金屬離子超標的現象，涉及多個大型生鮮購買平臺，最高超標可達8倍。由于重金屬具有生物蓄積性[1]，會通過食物鏈直接或間接地進入人體內，從而對人體造成嚴重傷害[2]。其中，重金屬Cd(Ⅱ)是水產品中極為典型的重金屬污染物之一，檢出率高，毒性強，即使在很低的暴露濃度下也會對人體肝臟、腎臟等造成損傷[3]。因此，實現水產品中鎘的快速檢測十分迫切。

由于食品基質的復雜性，食品中重金屬離子的前處理技術在其快速檢測中起著關鍵性作用，但前處理方法在目前的研究中很容易被弱化[4-5]。目前，食品中重金屬的前處理方法主要有濕法消解、微波消解、壓力罐消解等[6-9]。這幾種前處理方法所需時間最長可達12 h，并且需要用到高濃度的酸，對環境污染極為嚴重，且與食品安全速測方法的兼容性極差，無法滿足快檢需求。因此建立水產品中重金屬離子快速、高效且綠色的前處理方法十分必要。

研究表明，超聲輔助酶提取法可通過酶解作用，破環重金屬與食品組分的結合，同時利用超聲波的空化效應、機械效應和熱效應，促進酶作用酶解底物，實現酶解的加速[10-11]，進而大大縮短提取時間，是一種綠色高效的前處理方法。YILMAZ等[12]，CHENG等[13]，QIN等[14]基于雙頻超聲波裝置輔助酶解的方式實現了對青蔥中的痕量錳，草藥樣品中的砷，大米樣品中鎘的有效提取。BERMEJO-BARRERA等[15]和PEA-FARFAL等[16]使用雙頻超聲輔助酶解法提取了貽貝樣品中的多種重金屬元素。但由于水產樣品基質較為復雜，目前報道的雙頻超聲輔助酶解通常只針對特定水產品(如貽貝)進行，不具有普適性，更換水產樣品后，其提取方法可能無法實現對重金屬離子的有效提取。因此建立水產品及制品中重金屬離子的普適提取方法十分必要。

本研究在建立了牡蠣中重金屬Cd(Ⅱ)雙頻超聲輔助酶解方法的基礎上，僅通過對超聲功率的優化，建立了具有一定普適性的水產品中重金屬Cd(Ⅱ)提取方法，可實現對蟹肉、魷魚、帶魚、皮皮蝦和蝦滑等常見水產品及其制品中重金屬Cd(Ⅱ)的提取，以期為多種水產品中重金屬Cd(Ⅱ)的提取分析提供一種綠色高效的提取測定方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牡蠣標準物質(GBW10025)，北京偉業計量技術研究院(中國北京)；鎘標液，國家鋼鐵材料測試中心鋼鐵研究總院；風味蛋白酶，中國龐博生物工程有限公司；胰蛋白酶、嗎啉乙磺酸一水合物(2-morpholinoethanesulfonic acid monohydrate，MES)、磷酸二氫銨，上海麥克林生化科技有限公司；帶魚、魷魚絲、蟹肉、皮皮蝦、蝦滑，上海海鮮市場。

1.2 儀器與設備

SavantAA型原子吸收光譜儀(atomic absorption spectrometer，AAs)，澳大利亞GBC科學儀器公司；MARS6型高通量密閉微波消解儀，美國CEM公司；JY92-IIDN型超聲細胞粉碎儀，寧波山達生物科技有限公司；L18-Y68S型九陽真空破壁機，九陽股份有限公司；KQ-700DE型數控超聲波清洗機，昆山市超聲儀器有限公司。AAs的工作條件見表1。

表1 AAs工作條件Table 1 Operating conditions of AAs

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品前處理

實驗中所使用的水產品原材料均通過真空破壁機粉碎后過80目篩，保存待用。

1.3.2 雙頻超聲輔助酶解提取法

雙頻超聲輔助酶解提取水產品中重金屬Cd(Ⅱ)方法如下：稱取0.6 g樣品粉末或勻漿于10 mL離心管中，加入緩沖溶液，再加入適量的風味蛋白酶(5.5×104U/g)和胰蛋白酶(1.7×105U/g)，渦旋振蕩30 s使其混合均勻，然后于37 ℃的超聲儀中水浴超聲6 min，在12 000 r/min的條件下離心10 min，取其上清液，用孔徑為0.45 μm的水系混合濾膜進行過濾。再用1%HNO3溶液進行倍數稀釋，并進行空白實驗，所有實驗進行3次重復。

為驗證本方法的可靠性，同時采用國標法規定的水產品及其制品中重金屬Cd(Ⅱ)的提取方法進行對照，方法如下：稱取0.6 g水產品樣品于消解管中，向其中加入適量的HNO3，參考GB 5009.15—2014《食品安全國家標準 食品中鎘的測定》中第一法的微波消解法進行消解，并進行空白實驗，實驗一式三份。其中重金屬Cd(Ⅱ)提取率計算如公式(1)～公式(4)所示：

(1)

T2=w1×稀釋倍數

(2)

(3)

T3=w2×稀釋倍數

(4)

式中：Q1，酶解法重金屬Cd(Ⅱ)提取率，%；T2，酶解上清液中重金屬Cd(Ⅱ)總含量，mg/kg；T1，水產品中重金屬Cd(Ⅱ)總含量，mg/kg；w1，樣品超聲酶解后AAs測得上清稀釋液重金屬Cd(Ⅱ)含量，mg/kg；Q2，微波消解法重金屬Cd(Ⅱ)提取率，%；T3，樣品微波消解法測得重金屬Cd(Ⅱ)總含量，mg/kg；w2，樣品微波消解后石墨爐原子吸收光譜儀測得上清稀釋液重金屬Cd(Ⅱ)含量，mg/kg。

1.3.3 石墨爐原子吸收光譜法測定Cd(Ⅱ)

采用石墨爐原子吸收光譜法通過自動進樣器(PAL3000)將10 μL樣品和4 μL基體改進劑(10 g/L NH4H2PO4)注入石墨管中，以進行分析。使用鎘空心陰極燈作為Cd(Ⅱ)測定時的輻射源，其燈電流為3.0 mA，波長為283.3 nm，狹縫寬度為0.5 nm，氬氣輸出壓力為0.30 MPa左右。

2 結果與分析

2.1 實驗條件優化

本研究采用雙頻超聲輔助酶解法提取水產品及其制品中的重金屬Cd(Ⅱ)。由于緩沖溶液的種類、蛋白酶酶量、pH值、料液比和超聲條件對重金屬Cd(Ⅱ)的提取會產生不同的影響，所以實驗研究了樣品在不同提取條件下的提取效率，并使用傳統的微波消解法作為對照，從而確定出了重金屬Cd(Ⅱ)提取的最佳條件。

2.1.1 超聲模式優化

超聲波可基于空化效應顯著加快酶解過程，因此首先研究了超聲模式對水產品及其制品中重金屬Cd(Ⅱ)提取率的影響。結果如圖1所示，在單獨使用超聲探頭、單獨使用超聲水浴以及聯合使用超聲探頭和超聲水浴(雙頻超聲)3種模式下，使用雙頻超聲模式時，重金屬Cd(Ⅱ)的提取率最高可達82.63%。表明雙頻超聲模式最適合用于牡蠣樣品中重金屬Cd(Ⅱ)的有效提取。這可能是由于雙頻超聲要比單頻超聲具有更寬的頻率范圍，因此可以擁有更好的空化效果，這種空化效果可能促進了超聲能量傳輸，破壞了細胞結構促進更多的重金屬Cd(Ⅱ)釋放到溶液中[17]。

圖1 超聲模式對牡蠣中Cd(Ⅱ)提取率的影響Fig.1 Influence of ultrasonic mode on oncadmium(Ⅱ) extraction rate from oyster

2.1.2 緩沖溶液種類優化

緩沖溶液具有維持溶液體系pH值相對穩定的性能，使得pH值在一定的范圍內不因稀釋或外加少量的酸或堿而發生顯著變化，這對于酶活性的發揮具有重要作用。本研究對PB、HEPES、MES、Tris 4種緩沖溶液進行篩選，結果如圖2所示，在其他實驗條件保持固定的情況下，與其他3種緩沖溶液相比，使用Tris緩沖作為本研究的緩沖溶液時，牡蠣中重金屬Cd(Ⅱ)的提取率可以達到65.13%，具有最佳提取效果。

圖2 緩沖溶液種類對牡蠣中Cd(Ⅱ)提取率的影響Fig.2 Influence of buffer solution types on cadmium (Ⅱ) extraction rate from oyster

2.1.3 酶配方優化

牡蠣樣品中蛋白質含量豐富，而且重金屬Cd(Ⅱ)主要是和蛋白質上的巰基進行結合[18-19]。風味蛋白酶與胰蛋白酶的復配可以有效破壞重金屬Cd(Ⅱ)與蛋白質之間的配位結合，使得重金屬Cd(Ⅱ)從蛋白質上釋放。因此選用蛋白酶對牡蠣中的蛋白質進行水解破壞其結構，促使重金屬從蛋白質上更好地解離下來。固定胰蛋白酶的添加量為0.3 g，改變風味蛋白酶的添加量，以實際提取率與重金屬Cd(Ⅱ)理論提取率(100%)的差值最小為優化指標。隨著風味蛋白酶酶量的增加，實際提取率與重金屬Cd(Ⅱ)理論提取率的差值呈現出先降低后增加的趨勢。結果如圖3所示，當風味蛋白酶的添加量為0.7 g時，重金屬Cd(Ⅱ)的提取率最高，為98.16%，其與理論提取率的差值最小，為1.84%。這可能是由于蛋白酶酶量不足時，底物與酶不能完全結合，蛋白酶酶量過多時，則會抑制底物的水解。因此，本實驗選用的酶配方為0.3 g胰蛋白酶與0.7 g風味蛋白酶的復配。

圖3 酶配方對牡蠣中Cd(Ⅱ)提取率的影響Fig.3 Influence of enzyme formulation on cadmium(Ⅱ) extraction rate from oyster

2.1.4 pH值優化

酶的生物活性受到提取劑pH值的影響較大，不適合的pH值會使酶變性失活[20]。在綜合考慮風味蛋白酶和胰蛋白酶的最適pH值后，按照1.3.2的實驗方法，考察了所用緩沖溶液的pH值為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0時牡蠣中重金屬Cd(Ⅱ)的提取率。結果如圖4所示，當pH值為7.0時，重金屬Cd(Ⅱ)的提取率達到103.2%，與理論提取率的差值最小，僅為3.2%。因此本實驗選用7.0作為溶液的pH值。

圖4 pH值對牡蠣中Cd(Ⅱ)提取率的影響Fig.4 Influence of pH on cadmium(Ⅱ) extraction rate from oyster

2.1.5 料液比優化

樣品和酶在溶液中的分散性會影響牡蠣中鎘的提取率，因此本研究考察了不同料液比(1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7，g∶mL)對牡蠣中重金屬Cd(Ⅱ)的提取率的影響。結果如圖5所示，當料液比為1∶5(g∶mL)時，重金屬Cd(Ⅱ)提取率為104.76%，與理論提取率的差值最小，僅為4.76%。這可能是由于料液比過低時，樣品和酶在溶液中的分散性較差，不利于復合酶酶解作用的發揮；料液比過高時，蛋白酶被稀釋，酶活性下降，不利于重金屬Cd(Ⅱ)的提取。因此，本研究選在1∶5(g∶mL)的料液比下開展實驗。

圖5 料液比對牡蠣中Cd(Ⅱ)提取率的影響Fig.5 Influence of solid-liquid ratio on cadmium(Ⅱ) extraction rate from oyster

對牡蠣樣品的超聲模式、緩沖種類、酶量、pH值以及料液比進行優化，實驗的結果表明，牡蠣樣品的最佳提取條件為：緩沖溶液為Tris溶液，0.7 g風味蛋白酶與0.3 g胰蛋白酶為復合酶配方，pH值為7，料液比為1∶5(g∶mL)，此時重金屬Cd(Ⅱ)的提取率可以達到104.76%。

2.2 水產品及其制品中重金屬Cd(Ⅱ)的普適性提取條件

除牡蠣外，蟹肉、帶魚、魷魚絲、皮皮蝦和蝦滑也常出現重金屬鎘超標的情況，且被廣泛食用，因此本研究以這5種具有代表性的水產品及其制品為例，進行水產品及其制品中重金屬Cd(Ⅱ)的普適性提取條件研究。利用鎘標液對上述5種樣品進行加標，混勻后置于室溫下靜置30 min，在上述最佳提取條件的基礎上，考察不同的超聲探頭功率(10%、15%、20%、25%、30%)對5種樣品中重金屬Cd(Ⅱ)提取率的影響。

2.2.1 超聲功率對蟹肉中重金屬Cd(Ⅱ)提取率的影響

取0.6 g Cd(Ⅱ)加標的蟹肉樣品于離心管中，在僅改變超聲功率不改變其他實驗條件的情況下，計算樣品的提取率和與理論提取率的差值。在上述最優實驗條件下，研究超聲探頭的不同功率對蟹肉樣品中重金屬Cd(Ⅱ)提取率的影響。結果如圖6所示，當超聲功率為25%時，蟹肉樣品中重金屬Cd(Ⅱ)的提取率最高，為100.39%，與理論提取率的差值僅為0.39%。說明，在上述最優提取條件下，僅需將超聲探頭功率調至25%即可實現對蟹肉中重金屬Cd(Ⅱ)的有效提取。

圖6 超聲探頭功率對蟹肉中Cd(Ⅱ)提取率的影響Fig.6 Influence of ultrasonic power on cadmium(Ⅱ) extraction rate in crab meat

2.2.2 超聲功率對帶魚中重金屬Cd(Ⅱ)提取率的影響

取0.6 g Cd(Ⅱ)加標的帶魚樣品于離心管中，在上述最優實驗條件下，研究超聲探頭的不同功率對帶魚樣品中重金屬Cd(Ⅱ)提取率的影響。結果如圖7所示，當超聲功率為30%時，帶魚樣品中重金屬Cd(Ⅱ)的提取率最高，為84.51%，與理論提取率的差值為15.49%。說明，在上述最優提取條件下，僅需將超聲探頭功率調至25%即可實現對帶魚中重金屬Cd(Ⅱ)的有效提取。

圖7 超聲探頭功率對帶魚中Cd(Ⅱ)提取率的影響Fig.7 Influence of ultrasonic power on cadmium(Ⅱ) extraction rate from hairtail

2.2.3 超聲功率對魷魚絲中重金屬Cd(Ⅱ)提取率的影響

取0.6 g Cd(Ⅱ)加標的魷魚絲樣品于離心管中，在上述最優實驗條件下，研究超聲探頭的不同功率對魷魚絲樣品中重金屬Cd(Ⅱ)提取率的影響。結果如圖8所示，當超聲功率為15%時，魷魚絲樣品中重金屬Cd(Ⅱ)的提取率最高，為75.66%，與理論提取率的差值為24.34%。說明，在上述最優提取條件下，僅需將超聲探頭功率調至15%即可實現對魷魚絲中重金屬Cd(Ⅱ)的有效提取。

圖8 超聲探頭功率對魷魚絲中Cd(Ⅱ)提取率的影響Fig.8 Influence of ultrasonic power on cadmium(Ⅱ) extraction rate from squid silk

2.2.4 超聲功率對皮皮蝦中重金屬Cd(Ⅱ)提取率的影響

取0.6 g Cd(Ⅱ)加標的皮皮蝦樣品于離心管中，在上述最優實驗條件下，研究超聲探頭的不同功率對皮皮蝦樣品中重金屬Cd(Ⅱ)提取率的影響。結果如圖9所示，當超聲功率為10%時，皮皮蝦樣品中重金屬Cd(Ⅱ)的提取率最高，為93.18%，與理論提取率的差值為6.82%。說明，在上述最優提取條件下，僅需將超聲探頭功率調至10%即可實現對皮皮蝦中重金屬Cd(Ⅱ)的有效提取。

圖9 超聲探頭功率對皮皮蝦中Cd(Ⅱ)提取率的影響Fig.9 Influence of ultrasonic power on cadmium(Ⅱ) extraction rate from shrimps

2.2.5 超聲功率對蝦滑中重金屬Cd(Ⅱ)提取率的影響

取0.6 g Cd(Ⅱ)加標的蝦滑樣品于離心管中，在上述最優實驗條件下，研究超聲探頭的不同功率對蝦滑樣品中重金屬Cd(Ⅱ)提取率的影響。結果如圖10所示，當超聲功率為10%時，蝦滑樣品中重金屬Cd(Ⅱ)的提取率最高，為94.97%，與理論提取率的差值為5.03%。說明，在上述最優提取條件下，僅需將超聲探頭功率調至10%即可實現對蝦滑中重金屬Cd(Ⅱ)的有效提取。

圖10 超聲探頭功率對蝦滑中Cd(Ⅱ)提取率的影響Fig.10 Influence of ultrasonic power on cadmium(Ⅱ) extraction rate in shrimp slippage

2.3 水產品及其制品中重金屬Cd(Ⅱ)的測定

采用優化好的前處理及檢測方法，對市售的水產品及其制品(牡蠣，蟹肉，帶魚，魷魚絲，皮皮蝦以及蝦滑)中的重金屬Cd(Ⅱ)進行測定。并與微波消解法的測定值相比較，結果如表2所示。結果顯示，水產品牡蠣，蟹肉，帶魚，魷魚絲，皮皮蝦以及蝦滑重金屬Cd(Ⅱ)提取率均在75%～110%。相較傳統的微波消解法，雙頻超聲輔助酶提取水產品中重金屬的前處理方法用酸量少、耗時短且反應過程溫和，測定結果準確可靠，用于水產品及其制品中重金屬Cd(Ⅱ)的提取具有一定的普適性。

表2 水產樣品測定結果(n=3)Table 2 Determination results of aquatic samples (n=3)

3 結論

通過研究不同超聲模式，緩沖溶液，酶配方，pH值以及料液比對牡蠣樣品中重金屬Cd(Ⅱ)的提取率的影響，得到牡蠣中重金屬Cd(Ⅱ)的最佳提取條件：以Tris作為緩沖溶液，以0.7 g風味蛋白酶與0.3 g胰蛋白酶為復合酶配方，pH值為7，料液比為1∶5(g∶mL)，可在6 min內實現對牡蠣中重金屬Cd(Ⅱ)的高效提取，其提取率可達104.76%。在上述最佳提取條件下，僅需改變超聲功率即可獲得水產品及其制品中重金屬Cd(Ⅱ)的普適提取方法，實現了對蟹肉，帶魚，魷魚絲，皮皮蝦和蝦滑中重金屬Cd(Ⅱ)的有效提取，其提取率可達75%～110%。與傳統的微波消解法相比，該方法借助超聲波的空化效應、熱效應輔助酶水解，大大縮短了提取時間，同時采用的溶液pH為中性，環境友好且與速測方法具有良好的兼容性，在水產品及其制品中重金屬前處理及快速檢測領域應用前景十分廣闊。