青稞酒糟多肽的制備及其活性研究

楊婷婷，孫萬成，羅毅皓*，馮聲寶

1(青海大學 農牧學院，青海 西寧，810016)2(青海互助天佑德青稞酒股份有限公司，青海 西寧，810016)

每年青稞酒制造廠會產生大量酒糟，青稞酒糟(highland barley fermentation spent，HBFS)的蛋白質質量較高，研究青稞酒糟中的蛋白質是實現青稞酒糟合理化利用的基礎，同時能有效緩解環境污染，減少酒糟的丟棄浪費，節約大量資源。

青稞酒糟粗蛋白是制備青稞酒糟多肽[1]的主要原料，干酒糟中含有大量蛋白質，蛋白質的含量為14.3%～21.8%[2]。目前酒糟中蛋白質的提取方法主要有醇堿法[3]、堿法[4]和酶法[5]。醇堿法、堿法主要是利用堿提酸沉的原理，將酒糟蛋白溶解到稀堿溶液中，再將溶液pH降低至蛋白質等電點，使酒糟蛋白沉淀析出；而酶法則是利用酶破壞細胞壁結構，通過提高蛋白質在提取溶劑中的溶解度，提高粗蛋白的得率。

有學者[6]通過從咖啡殘渣發酵物中提取蛋白，再通過胃蛋白酶和胰蛋白酶進行消化得到水解肽，這實驗充分表明酒糟中也含有一定的多肽；國外學者發現多肽類物質具有一定抗氧化作用[7]，也能治療由酒精引起的炎癥[8]，從啤酒麥糟(brewers′ spent grain，BSG)中提取出具有良好抗氧化性的酚酸，能有效進行高血壓管理[9]，同時也有學者通過對蒸餾廢谷物(distiller′s spent grain，DSG)的研究發現發酵后的谷物蛋白質對血管緊張素轉化酶(angiotensin converting enzyme，ACE)[10]、葡萄糖和淀粉酶活性[11]具有抑制作用。這些也為青稞酒糟多肽的研究提供了參考。

目前國內對于青稞酒糟多肽的提取工藝及其功能性研究較少，本實驗旨在為進一步利用HBFS提供理論參考，使HBFS各組分得到合理的資源化利用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

HBFS，青海西寧天佑德青稞酒廠；堿性蛋白酶(200 U/mg)、木瓜蛋白酶(800 U/mg)、復合蛋白酶(120 U/mg)、動物蛋白酶(100 000 U/g)、風味蛋白酶(20 U/mg)、中性蛋白酶(100 U/mg)，源葉生物；牛血清蛋白V，北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設備

ESJ110-413電子分析天平，沈陽龍騰電子有限公司；DGX-9073B電熱鼓風干燥機，上海南榮實驗室設備有限公司；G555-9真空冷凍干燥機，基因有限公司；H/T16MM臺式高速離心機、LR-10M高速冷凍離心機，湖南赫西儀器裝備有限公司；HJ-4A數顯恒溫多頭磁力攪拌器，崢嶸儀器；pHS-3C精密pH計，上海佑科儀器儀表有限公司；HH-6數顯恒溫水浴鍋，常州市金壇友聯儀器研究所；SHB-III循環水式多用真空泵，鄭州長城科工貿有限公司；AKTApure 25M蛋白層析系統，江蘇漢邦科技有限公司；UV-1780雙光束紫外可見分光光度計，蘇州島津儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 青稞酒糟蛋白質的提取[12]

(1)醇堿法：取一定量新鮮酒糟粉末，加入醇堿混合液[V(95%乙醇)∶V(0.5 mol/L NaOH)=1∶2]，固液比1∶40，攪拌240 min。離心后取上清液，使用1 mol/L鹽酸調節濾液pH至4.7，靜置沉淀后離心，得到粗蛋白沉淀，加水調節至中性，取濾液，放入離心機離心，得到粗蛋白沉淀，冷凍干燥。

(2)堿法：取一定量新鮮酒糟粉末，加入0.5 mol/L NaOH，固液比1∶35，攪拌240 min。離心后取上清液，使用1 mol/L鹽酸調節濾液pH至5.2，靜置沉淀。放入離心機離心，得到粗蛋白沉淀，加水調節至中性，取濾液，放入離心機離心，得到粗蛋白沉淀，冷凍干燥。

(3)酸法：取一定量新鮮酒糟粉末，加入鹽酸、乙醇溶液、0.25%亞硫酸鈉，固液比1∶10(g∶mL)，攪拌240 min。離心后取上清液，真空減壓濃縮，靜置沉淀。放入離心機離心，得到粗蛋白沉淀，加水洗滌，取濾液，放入離心機離心，得到蛋白沉淀，冷凍干燥。

1.3.2 青稞酒糟蛋白質含量的測定

根據福林酚法測定蛋白質含量，取2 mg青稞酒糟蛋白粉溶于10 mL蒸餾水中，得到200 μg/mL的蛋白溶液，吸取1 mL蛋白溶液，加入5 mL福林酚試劑甲混勻，于20～25 ℃保溫10 min，再吸取0.5 mL福林酚，立即搖勻，于20～25 ℃保溫20 min，然后于500 nm處比色。以1 mL蒸餾水代替蛋白溶液做空白參照。

1.3.3 青稞酒糟蛋白定性定量分析

向蛋白溶液中加入2%脫氧膽酸鈉(sodium deoxycholate，SDC)溶液，95 ℃煮10 min，超聲探頭超聲10 min對蛋白進行變性。按50∶1加入Trypsin胰蛋白酶，37 ℃孵育振蕩過夜酶切。加入三氯乙酸(trifluoroacetic acid，TFA)終止酶切，調節溶液pH值在6.0左右，12 000×g離心15 min，使用SDB小柱進行除鹽。除鹽后的肽段溶液經離心濃縮儀抽干后，凍存于-20 ℃等待上機檢測。

使用Q Exactive Plus液質聯用系統進行質譜分析。利用納升流速的液相UltiMate 3000 RSLCnano系統分離樣品。肽段樣品經過上樣緩沖液溶解，由自動進樣器吸入后結合至C18捕獲柱(3 μm，120 ?，100 μm×20 mm)，接著被洗脫至分析柱(2 μm，120 ?，75 μm×150 mm)進行分離。利用2個流動相(流動相A：3%二甲基亞砜和0.1%甲酸水溶液，流動相B：3%二甲基亞砜和0.1%甲酸乙腈溶液)建立分析梯度。液相的流速設置為300 mL/min。質譜DDA模式分析時，每個掃描循環中包含1個MS全掃描(R=70 K，AGC=3e6，max IT=20 ms，掃描范圍=350～1 800m/z)，以及隨后的15個MS/MS掃描(R=17.5 K，AGC=2e5，max IT=100 ms)。HCD碰撞能量設置為28。四級桿的篩選窗口設置為1.6 Da。離子重復采集的動態排除時間設置為35 s。

1.3.4 青稞酒糟蛋白質的純化[13]

采用AKTA pure蛋白核酸純化儀和5 mL的HiTrap DEAE FF離子交換層析柱進行蛋白純化，整個純化過程流速控制在2 mL/min。取3 mg不同方法提取的青稞酒糟蛋白粉溶于10 mL PBS緩沖液中，放入離心機離心后，取上清液。純化過程如下：

(1)柱平衡及上樣。用5個柱體積的PBS緩沖液(0.2 mol/L，pH 7.0)平衡離子交換柱，以5 mL/min的流速將青稞酒糟粗蛋白泵入。

(2)清洗雜質蛋白。用5個柱體積的PBS緩沖液充分沖洗，除去未結合蛋白。

(3)梯度洗脫。設置30%、50%和80% 3種梯度依次洗脫20個柱體積，洗下目標蛋白并進行收集。

(4)泵洗及卸層析柱。用2 mol/L NaCl將未完全洗脫的蛋白質沖洗下來。

1.3.5 青稞酒糟多肽的制備

酶解前水洗除雜：取10 g青稞酒糟蛋白粉，按1∶6(g∶mL)的比例加水，在60 ℃的水浴鍋中恒溫振蕩30 min后，離心。

酶解[14]：取1 g青稞酒糟蛋白，加入30 mL蒸餾水，用1 mol/L NaOH溶液調節pH，添加適量酶，水解240 min，于90 ℃水浴鍋中滅活15 min，離心(4 000 r/min，15 min)，取上清液，凍干。不同種類蛋白酶酶解條件如表1所示。

表1 不同蛋白酶最適pH值、溫度及酶活力Table 1 The optimum pH,temperature and enzyme activity of different proteases

1.3.6 青稞酒糟多肽水解度的測定

采用甲醛滴定法[15]測定。

1.3.7 青稞酒糟多肽對乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase，ADH)的激活效果

參考王培宇[16]的實驗方法進行檢測。

1.3.8 青稞酒糟多肽的體外抗氧化實驗

1.3.8.1 對DPPH自由基的清除效果

參考曹磊等[17]的實驗方法稍作修改，進行檢測。

1.3.8.2 對羥自由基(·OH)的清除效果

參考郭輝等[18]的實驗方法，進行檢測。

參考馬吉瑤等[19]的實驗方法，進行檢測。

1.4 數據統計與分析

采用IBM SPSS statistics 24軟件中的方差分析法進行顯著性分析，以P<0.05表示差異顯著，繪圖軟件選用OriginPro軟件。

2 結果與分析

2.1 青稞酒糟蛋白質的提取

以牛血清蛋白為標品，得到線性方程y=0.001 4x+0.007 2，R2=0.991 9，線性關系良好，根據標曲計算蛋白含量。

由圖1可知，通過醇堿法提取HBFS中的蛋白得率高于堿法和酸法，其中醇堿法得率是酸法的2倍左右。結果與侯夢媛[20]實驗結果(7.091%，純度95.20%)大體一致，但也存在略微差異，主要原因應該是酸法提取時加入大量強酸溶液，導致蛋白質水解，使蛋白質得率降低。周紅等[21]研究表明，不同品種青稞中粗蛋白含量平均值為13.32%，變幅為12.19%～14.07%，其中Z523青稞蛋白質含量最高為14.07%；李倩[22]研究表明，青稞酒糟蛋白中粗蛋白含量為23.57%，經過對比說明青稞在釀造過程中，蛋白質含量升高，這與侯夢媛[20]的研究結果相符，酒糟在釀造過程中四大種類蛋白質清蛋白、谷蛋白、醇溶蛋白和球蛋白的含量均呈上升趨勢。

圖1 不同提取方法對青稞酒糟蛋白得率的影響Fig.1 Effect on different extraction methods on protein yield注：不同小寫字母表示差異顯著(下同)

2.2 青稞酒糟多肽的制備

2.2.1 不同種類酶對青稞酒糟蛋白質的酶解影響

由表2可知，在各個酶最適條件下，堿性蛋白酶水解液的水解度最高，達到10.61%，這與其他文獻所述內容是一致的。不同種類酶對青稞酒糟蛋白的酶解結果差異較大，主要考慮是酶解使用的青稞酒糟蛋白是醇堿法提取的，而堿性蛋白酶的最適作用條件是堿性環境，更有利于堿性蛋白酶作用于酶切位點，亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸終端[23]。因此堿性蛋白酶酶解產物水解程度更高。

表2 不同種類酶對青稞酒糟蛋白的酶解效果Table 2 The enzymatic hydrolysis effect of different kinds of enzymes

2.2.2 青稞酒糟多肽對ADH的激活影響

由圖2可知，青稞酒糟多肽具有較強的ADH激活率，這充分表明青稞酒糟多肽有助于穩定的產生NAD+，從而抑制血醇濃度升高，具有較好的醒酒效果。同時由圖2中可以看出堿性蛋白酶和風味蛋白酶的醒酒活性優于其他種類水解酶，原因可能是這兩類蛋白酶酶解產物的水解度更高，酶解產物中含有更多低分子質量多肽。與郭輝等[18]相對分子質量小的多肽對ADH起主要的激活效果的結論相符。李萌[24]通過動物實驗進一步驗證綠豆多肽對ADH活性的影響，當綠豆多肽質量濃度為0.8 g/mL時，對ADH活性激活效果明顯，尤其是分子質量為5 000 Da的綠豆多肽對ADH的激活效果優于高分子質量綠豆多肽。寧慶鵬[25]研究表明，花生粕多肽酶解濃度為81.78%時，對ADH的激活率20.14%，當花生粕多肽的分子質量在1 000～3 000 Da時，具有最優的激活效果，低分子質量多肽是激活ADH的最有效成分。

圖2 不同種類蛋白酶酶解的青稞酒糟多肽對ADH的激活效果Fig.2 Activation effect of polypeptides hydrolyzed by different kinds of proteases on ADH

2.3 青稞酒糟蛋白定性定量分析

對比圖3-a、3-b、3-c中峰值出現的位置均是在50%梯度洗脫時，這表明3種不同方法提取的主要蛋白種類相同，而三者峰值出現時間不同，可以考慮為3種提取方法得到的蛋白溶液pH存在差異，導致蛋白質與DEAE離子交換層析柱的結合力不同，其中醇堿法中蛋白與DEAE層析柱間結合力強于酸法和堿法提取的蛋白，因此醇堿法峰值出現最晚。

a-純化醇堿法提取的青稞酒糟蛋白；b-純化堿法提取的青稞酒糟蛋白；c-純化酸法提取的青稞酒糟蛋白圖3 純化不同方法提取的青稞酒糟蛋白Fig.3 Purification of barley lees protein extracted by different methods

同時由圖4可以看出，通過AKTA pure蛋白純化儀純化后的青稞酒糟蛋白的純度得到明顯的提升，純化后的酒糟蛋白純度遠優于純化前。

圖4 純化前后青稞酒糟蛋白的純度對比Fig.4 Comparison of protein purity before and after purification

對純化后蛋白樣品經質譜檢測，共鑒定到29個蛋白的38個肽段，其中29個蛋白獲得準確定量信息。通過比較醇堿法和堿法2種不同方法提取的蛋白質，篩選出11種差異蛋白，將各個樣本的相對定量值取對數(log2x)，使其符合正態分布，結果如圖5所示。

圖5 蛋白定量信息總覽Fig.5 Overview of protein quantification information

由表3可知，物質運輸、代謝途徑、生物合成、生物調節等是11種差異蛋白比較集中的15個生物學途徑。其中物質運輸、代謝途徑、生物合成和生物調節類蛋白質數量較多，分別占所有差異蛋白的10.34%、10.34%和6.90%。根據GO功能富集分析顯示，青稞酒糟蛋白在有機物代謝、NADH再生、對氧化應激的反應、轉移酶活性、碳水化合物運輸和代謝、RNA加工和翻譯后修飾、囊泡運輸(圖6-a)方面最為豐富。具有胞內細胞器(intracellular organelle)、核糖核蛋白復合物(ribonucleoprotein complex)、催化絡合物(catalytic complex)等是差異蛋白主要的10種細胞組分，其中胞內細胞器、核糖核蛋白復合物和催化絡合物分別占51.43%、11.43%和8.57%(圖6-b)。富集到有機環化合物(organic cyclic compound binding)、離子結合(lon binding)、染色質結合(chromatin binding)、超氧化物歧化酶活性(superoxide dismutase activity)和轉錄調節因子(transciption regulator activity)5種主要執行的分子功能(圖6-c)，其中有機環化合物占42.86%，離子結合占21.43%，染色質結合占14.29%，超氧化物歧化酶活性14.29%，轉錄調節因子占7.14%。圖7為最顯著的15條代謝通路分析結果，顯示差異基因主要與微生物代謝、過氧化物酶體、氧化磷酸化和次生代謝物的生物合成有關。

表3 差異蛋白Table 3 Differential proteins

a-青稞酒糟蛋白參與的生物學過程；b-青稞酒糟蛋白所處的細胞組分；c-青稞酒糟蛋白執行的分子功能圖6 GO注釋Fig.6 GO annotation

圖7 KEGG通路分析Fig.7 KEGG pathway analysis

2.4 青稞酒糟多肽的體外抗氧化試驗

2.4.1 對DPPH自由基的清除效果

由圖8可知，青稞酒糟多肽對DPPH自由基有良好的清除效果，同時青稞酒糟多肽對DPPH自由基的清除效果隨濃度增大逐漸增強，在青稞酒糟多肽質量濃度為21 μg/L處趨于穩定，此時青稞酒糟多肽對DPPH自由基的清除效果達(70.76±1.35)%。這說明DPPH自由基中的不成對電子數量減少，導致溶液在517 nm處的吸光值降低，猜測可能是青稞酒糟多肽能捕捉DPPH自由基中的單電子，但青稞酒糟多肽對DPPH自由基具體的清除機理仍需進一步研究。

圖8 不同濃度青稞酒糟多肽對DPPH自由基的清除效果Fig.8 DPPH scavenging effects of peptides at different concentrations

2.4.2 對·OH的清除效果

由圖9可知，青稞酒糟多肽對·OH有一定的清除效果，當青稞酒糟多肽質量濃度為21 μg/L時，青稞酒糟多肽對DPPH自由基的清除效果達(52.05±2.09)%，說明青稞酒糟多肽可以通過減少·OH的生成量，減少于510 nm處有特殊吸光度的2,3-二羥基苯甲酸的生成，同時青稞酒糟多肽對·OH的清除效果隨濃度變化較小，可能是清除效果受到多肽溶液中較多鹽離子以及其他雜質的影響。

圖9 不同濃度青稞酒糟多肽對·OH的清除效果Fig.9 ·OH scavenging effects of peptides at different concentrations

圖10 不同濃度青稞酒糟多肽對的清除效果 scavenging effects of peptides at different concentrations

3 結論

實驗結果表明醇堿法提取青稞酒糟蛋白的得率和純度高于其他2種方法，醇堿法提取青稞酒糟蛋白的得率為(7.52±0.12)%，純度為(46.64±0.37)%，因此可以看出，不同的提取方法會影響蛋白質得率和純度，醇堿法更適合青稞酒糟蛋白的提取。

利用AKTA pure蛋白純化儀對青稞酒糟蛋白進行蛋白純化，再利用Q Exactive Plus液質聯用系統對青稞酒糟蛋白進行定性和定量分析。最后檢索Uniprot數據庫對結果進行分析，其中共有29個蛋白獲得準確定量信息，共檢索出11種差異蛋白，再基于GO注釋和KEGG富集分析，得出物質運輸、代謝途徑、生物合成、生物調節等是11種差異蛋白質比較集中的15個生物學途徑，5種細胞組分以及5種分子功能，其中與物質運輸、代謝途徑、生物合成和生物調節類有關的蛋白質數量較多，分別占所有差異蛋白的10.34%、10.34%和6.90%。GO功能富集分析顯示，差異蛋白基因主要富集在有機物代謝、NADH再生、對氧化應激的反應、轉移酶活性、碳水化合物運輸和代謝、RNA加工和翻譯后修飾、囊泡運輸。參與RNA加工和翻譯后修飾的P28003、P50138蛋白在富集分析中表現出最低的p值，差異蛋白主要與微生物代謝、過氧化物酶體、氧化磷酸化、次生代謝物的生物合成有關，不同的提取方法顯著改變了差異基因在過氧化物酶體、氧化磷酸化方面的代謝通路。