基于共價/非共價結合的蛋白質與花色苷相互作用研究進展

袁婷婷，周子藝，趙吉春，李富華，曾凱芳,2，明建,2*

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400715)2(西南大學，食品貯藏與物流研究中心，重慶，400715)

花色苷是一類分布廣泛的植物色素，能使花、果實、莖、葉和根等器官呈現紅、紫紅、藍等不同顏色。花色苷具有多種生物活性功能，如抗炎和抗癌性、降低心血管疾病的發生率，控制肥胖和減輕糖尿病的作用，因此可將其添加到食品中賦予食品功能特性[1]。由于花色苷苯環上含有多個羥基，其化學性質并不穩定，容易受到溫度、光、pH、氧、抗壞血酸、酶、金屬離子和其他因素的影響，從而出現褪色、變色、沉淀等現象。這些影響會在很大程度上限制花色苷作為食品成分和添加劑的用途，因此提高花色苷的穩定性尤為重要。目前提高花色苷穩定性的技術有很多，如修飾改性、輔色作用、微膠囊化、納米復合遞送等[2]。此外，還可以添加蛋白質、酚類化合物和多糖來提高花色苷的穩定性，其中，花色苷與蛋白質的相互作用是提高花色苷穩定性的有效方法之一[3]。本文主要介紹了花色苷與蛋白質相互作用形式、影響因素以及相互作用對花色苷和蛋白質的影響，以期為開發富含花青素的蛋白質食品或功能性配料提供理論依據。

1 花色苷與蛋白質的結構和性質

花色苷屬于類黃酮化合物，具有典型的C6-C3-C6骨架結構，其基本結構為3,5,7-三烴基-2-苯基苯并吡喃[4]。由于花青素母核2-苯基苯并吡喃陽離子缺乏電子，游離的花青素極不穩定，在自然界中常與糖基結合以花色苷形式存在。B環上的R1和R2可以被不同的取代基(—OH，—OCH3)取代，根據取代基連接位置的差異，可將花青素分為六類，即天竺葵色素、飛燕草色素、矢車菊色素、芍藥色素、牽牛色素和錦葵色素(表1)。糖基主要結合在花青素的C-3、C-5、C-7位，少部分與C-3′位連接，最常見的糖是葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖。花色苷之間的差異在于羥基和甲氧基的數量和位置，糖基性質、數量、位置以及糖殘基上脂肪酸或芳香酸進行酯化的程度和性質[5]。

表1 常見花青素的基本結構[5]Table 1 The basic structure of common anthocyanins[5]

2 花色苷與蛋白質相互作用形式

花色苷與蛋白質之間可以通過相互作用形成更穩定的復合物體系，主要有非共價結合和共價結合2種結合方式。

2.1 非共價結合

圖1 花色苷與蛋白質非共價相互作用機制圖Fig.1 Diagram of the non-covalent interaction mechanism between anthocyanin and protein

2.2 共價結合

蛋白質與多酚的共價結合一般是不可逆的，可以通過酶法和非酶法(堿性反應和自由基接枝)形成，其機制如圖2、圖3所示[11]。酶法主要依賴于多酚氧化酶、漆酶、酪氨酸酶等酶的催化作用，在含氧環境下，處于鄰位的酚羥基基團可以被氧化生成O-醌，從而根據親核加成反應機制與蛋白質結合，形成花色苷-蛋白質共價復合物。基于該形成原理，TANTOUSH等[12]利用漆酶成功使櫻桃中酚類物質與β-乳球蛋白發生交聯作用，以此提高蛋白質的消化穩定性并降低其致敏性。酶法通常被認為是一種具有高度特異性的有效方法，酶促合成復合物表現出很強的自由基清除活性。然而，其所使用的制備和程序復雜且成本高[11]。非酶法主要分為堿性反應和自由基接枝反應。在堿性條件下，花色苷被氧化后與蛋白質側鏈通過共價相互作用形成醌類化合物，這是一種反應性的親電中間體。活性醌通過酚環與蛋白質側鏈上的巰基和氨基發生親電加成反應，從而形成不可逆的共價鍵(C—N或C—S)。研究發現，在強堿環境下，C3G更有可能與大豆分離蛋白(soybean protein isolate,SPI)發生共價結合，隨著C3G濃度的增加，SPI中巰基含量逐漸降低，C3G與SPI相互作用形成C—N共價鍵，從而改變了大豆蛋白的結構[13]。而自由基接枝反應是通過氧化還原生成的羥基自由基與蛋白質側鏈的活性基團發生反應，促進花色苷與蛋白質之間共價鍵的形成。研究證明由自由基接枝形成的復合物比堿性反應形成的復合物表現出更高的抗氧化活性。此外，該反應可以在室溫下進行，不會產生有毒產物或使抗氧化劑分解，是制備花色苷-蛋白質復合物的有效方法[11]。

圖2 通過堿性反應(a)和酶法(b)的蛋白質-多酚共價結合機制[11]Fig.2 Protein-polyphenol covalent binding mechanism through alkaline reaction (a) and enzymatic method (b)[11]

圖3 通過自由基接枝法的蛋白質-多酚共價結合機制Fig.3 Mechanism of protein-polyphenol covalent binding via free radical grafting

3 影響花色苷-蛋白質相互作用的主要因素

花色苷與蛋白質相互作用的影響因素較多，主要分為結構因素和環境因素，了解這些因素對相互作用不同程度的影響，有助于擴大花色苷-蛋白質復合物在各領域中的應用。

3.1 花色苷結構

花色苷的結構在其與蛋白質的絡合中有重要作用，花色苷B環中的羥基取代基會影響與蛋白質的結合，研究顯示在酸性條件下，疏水相互作用為主要作用力，B環中羥基數量較少的花色苷與蛋白質的結合作用較強，而在中性或弱堿性條件下，二者的相互作用力主要為氫鍵和靜電力，蛋白質傾向于與B環中羥基數量較多的花色苷結合[14]。分子對接結果表明，B環中的甲氧基化促進了與電子受體氨基酸的相互作用，從而使溶液呈現出不同程度的顏色變化[15]。研究發現非酰基化形式的花色苷與人血清白蛋白的結合力強于糖基化形式的花色苷，且在糖基化條件相同的情況下，羥基化和甲氧基化對結合力無很強的規律性影響[16]。

3.2 蛋白質結構

蛋白質的結構差異是影響花色苷與蛋白質相互作用的重要因素，未折疊的蛋白質相比于球形蛋白質表現出更強的親和力。脯氨酸含量被認為是蛋白質-多酚相互作用的重要因素，富含脯氨酸的蛋白質通常有較好的分子柔性，其與多酚的相互作用也更強[17]。花色苷的芳香環傾向于與極性較低的氨基酸殘基結合，同時其羥基與蛋白質多肽鏈的羰基和氨基之間也可能發生氫鍵結合。研究表明黑米花色苷與β-乳球蛋白主要通過疏水相互作用結合，與酪蛋白結合的主要作用力為氫鍵，與牛血清白蛋白相互作用力主要為氫鍵和疏水相互作用，分子對接模擬結果顯示C3G主要結合于牛血清白蛋白的結構域Ⅲ上。黑米花色苷與酪蛋白的相互作用對花色苷的穩定性具有一定的保護作用，而其他2種蛋白質對花色苷的保護作用不明顯[18]。

3.3 溫度

溫度使蛋白質結構發生不同程度的變化，從而影響二者的結合親和力。在酸性條件下，疏水相互作用為主要作用力，且這種相互作用強度隨著溫度的升高而增強。在中性及弱堿性條件下，極性基團之間的靜電相互作用占主導地位，二者親和力隨著溫度的升高而降低[14]。在適宜的溫度條件下能夠提高花色苷-蛋白質復合物的穩定性，研究發現SPI的適當熱處理能防止黑豆種皮花色苷提取物的損失，提高花色苷的熱穩定性和氧化穩定性，有助于維持大豆制品的營養[19]。溫度在一定程度上改變了牛奶蛋白與C3G的結合親和力和結構構象。隨著預熱溫度的升高，β-乳球蛋白和β-酪蛋白的二級結構都發生了改變，β-螺旋和β-折疊結構含量降低，無規卷曲結構含量增加[8]。

3.4 pH

pH可通過改變花色苷的結構影響蛋白質與花色苷的相互作用形式。在酸性環境中，花色苷主要以黃酮型結構為主，在中性和堿性環境下，主要以陰離子醌型的形式存在，離子間的相互作用為主要作用力。此外，pH也可通過影響蛋白質的性質從而影響二者的相互作用。有研究發現人血清白蛋白在等電點(pI為4.7～4.9)以下為正電狀態，而在高pH時為負電狀態[14]。當pH值為3時，花青素與酪蛋白之間的相互作用力是由氫鍵驅動的，而在pH值為7的條件下是通過疏水作用結合的[20]。在中性條件下卵清蛋白與C3G的結合親和力高于酸性條件，C3G分子在加熱過程中發生降解，在酸性條件下其復合物更穩定，這主要歸因于C3G在低pH環境中形成較穩定的黃烊鹽陽離子[21]。

3.5 其他因素

溶液離子強度、加工技術條件也會影響花色苷與蛋白質的相互作用。如牛血清白蛋白與花色苷的結合常數隨著溫度的升高而減小，且減小的程度與緩沖溶液的離子強度呈負相關，其復合物的穩定性在蒸餾水中受到的影響比在緩沖液中受到的影響大[22]。研究表明，在過渡金屬離子存在的條件下，多酚氧化酶的活性會提高，而Zn2+能降低多酚氧化酶的活性，從而保護紫甘薯花色苷免受酶促降解[23]。花色苷與蛋白質的相互作用還受加工技術的影響。研究發現，經熱處理后二者的相互作用增強，而高壓處理后，二者的相互作用減弱，經熱處理和脈沖電場處理后可溶性蛋白會減少，導致復合物在體外消化過程中的可及性降低[24]。藍莓花色苷在光、熱、抗壞血酸、蔗糖存在下會加速降解，而酪蛋白的存在會提高這4種條件下花色苷的穩定性，但熱處理不如光處理效果明顯，可能是酪蛋白在高溫下發生了變性，空間結構改變，不利于與花色苷結合[7]。

4 蛋白質-花色苷相互作用對花色苷性質的影響

花色苷由于酚羥基的存在使其具有一定的抗氧化活性，但其極不穩定的性質也影響了作為食品成分的用途。因此，花色苷與蛋白質相互作用后可以在一定程度上改善其穩定性、抗氧化活性、生物利用度等。

4.1 穩定性

通常情況下，花色苷的穩定性與羥基化程度呈正相關，而與甲氧基化程度呈負相關。在酸性環境中性質較穩定，而在中性或弱堿性環境中易降解[25]。與蛋白質大分子相互作用后可以延緩花色苷的氧化過程，從而使花色苷的穩定性得到改善。研究發現在不同pH條件下，美拉德反應生成的共聚物糖化乳清蛋白有效提高了C3G的熱穩定性[26]。熱處理后的乳清蛋白顯著提高了花色苷在貯藏過程中的穩定性，花色苷通過氫鍵與乳清蛋白形成復合物，從而減緩其在抗壞血酸存在下的降解速率[27]。QUAN等[28]研究發現乳清蛋白和大豆蛋白可提高紫甘薯花色苷的熱穩定性，但對其貯存穩定性影響不大。研究表明α-酪蛋白和β-酪蛋白均能顯著提高藍莓花色苷的穩定性，當酪蛋白質量濃度為0.1 mg/mL時效果最好，且β-酪蛋白提高藍莓花色苷穩定性的效果更明顯[7]。

4.2 抗氧化活性

花色苷具有一定的抗氧化活性，但外界環境因素的干擾極易影響其抗氧化能力，與蛋白質結合后能改善這一現象。研究發現與α-酪蛋白或β-酪蛋白結合后，花色苷都表現出較少的抗氧化活性損失，并且β-酪蛋白比α-酪蛋白的效果稍好[7]。在惡劣環境(如光照、高溫、蔗糖)下，牛血清白蛋白能延緩藍莓花色苷的降解，并在0.15 mg/mL的理想質量濃度下保持其抗氧化活性[29]。在高溫條件下，花色苷與甘露糖蛋白結合后有助于保護其抗氧化活性[30]。也有研究顯示，花色苷的羥基與酪蛋白通過氫鍵結合，使花色苷的抗氧化功能無法正常發揮，從而避免了其抗氧化基團在食品加工貯藏過程中受到破壞[31]，該結論在研究人血清蛋白與花青素的相互作用中也得到體現[25]。由此可見，蛋白質可擴大花色苷作為天然色素或功能性成分的應用。

4.3 生物利用度

花色苷的生物利用度很低，在體內的生物利用度約為0.02%～0.26%，在體外約為5.10%。人體對蛋白質的吸收能力較強，花色苷與蛋白質結合后能夠提高花色苷的保留率，從而促進人體對花色苷的利用[32]。研究者將櫻桃果皮花色苷提取物包埋于WPI中，體外消化結果表明乳清蛋白保護了花色苷不被胃消化，促進了其在腸道中的釋放，提高了花色苷的生物利用度[33]。研究顯示WPI可以保護其蛋白質腔內的花色苷，從而導致花色苷在模擬胃腸道中緩慢的降解，促進胃腸道對花色苷的利用[9]。這些研究結果都為提高乳體系中花色苷的利用度提供了重要的理論基礎。

5 蛋白質-花色苷相互作用對蛋白質功能特 性的影響

蛋白質的功能特性主要有乳化性、起泡性、表面疏水性、消化性、熱穩定性等，作為食品成分常常影響食品的風味和質量，蛋白質和花色苷的相互作用會改變蛋白質的結構，從而影響蛋白質的功能性質。

5.1 乳化性

乳化活性(emulsification activity index，EAI)和乳液穩定性(end system identifier,ESI)是反映蛋白質與其他成分形成油水界面乳液層能力以及乳液穩定性的重要指標[34]。EAI反映蛋白質通過快速吸附在新形成的液滴表面并降低其在油水界面的界面張力來形成和穩定乳液的能力，ESI可以描述為乳液抵抗分離和保持分散的強度。研究發現，隨著花色苷濃度的增加，SPI的EAI和ESI均呈現上升趨勢，且這種現象與二者的相互作用類型無關[13]。研究表明，花色苷可通過非共價相互作用與乳清蛋白結合，改變蛋白質結構和表面特征，抑制油滴聚集，增強乳液穩定性。同時，花色苷在WPI乳液中氧化形成醌，與蛋白質分子側鏈上的親核基團發生共價相互作用，從而改變構象和表面特性，再次提高蛋白質乳化性以穩定乳液[35]。這些都為提高食品乳液穩定性提供了一定的參考價值。

5.2 消化性

蛋白質與花色苷的相互作用對蛋白質的消化性也會產生一定的影響。花色苷可以提高SPI的消化率，因為SPI與花色苷發生共價相互作用后，其結構發生改變，易于被消化酶水解[36]。可溶性氮釋放量越高，消化吸收能力越強。黑米花色苷和SPI結合后，形成的復合物體系可溶性氮釋放速率更快、釋放量更高，花色苷的加入提高了蛋白質的消化吸收速率[37]。然而，蛋白質的消化是一個復雜的過程，在很大程度上取決于蛋白質的種類和結構，以及與其他食物基質組分的相互作用，因此花色苷對蛋白質消化率的影響還應進行更深入的研究。

5.3 表面疏水性

表面疏水性不僅是蛋白質與極性溶劑接觸時表面疏水位點的指標，也是反映蛋白質變化的指標。卵清蛋白與C3G結合后其表面疏水性顯著下降，C3G的結合引入了更多的親水基團(如羥基)，這可能會增加蛋白質的表面親水性。同時，C3G引起的結構變化可能會影響親水基團和疏水基團的位置，從而改變蛋白質的表面疏水性[21]。研究顯示，二酰化花青素使α-淀粉酶或α-葡萄糖苷酶的表面疏水性降低，其作用機制可能是二酰化花青素與表面疏水基團相互作用，破壞了α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶原來的疏水結構[38]，這為花色苷降低血糖的研究提供了一定的理論基礎。表面疏水性的變化對蛋白質的其他功能特性也會產生一定影響，如表面疏水性的變化會導致蛋白質表面親水基團的數量發生改變，影響其與水分子的接觸面積和氣水界面膜的形成，進而影響蛋白質的發泡性能。同時，表面疏水性會影響蛋白質在油水界面油側的吸附能力，從而對乳化性能也產生一定的影響[34]。

5.4 其他性質

SPI二級和三級結構的變化會影響其空間構象和表面電荷密度，從而改變其功能，如起泡性等。研究發現，通過共價和非共價相互作用和花色苷結合后，SPI的起泡性得到了明顯的改善，尤其是共價結合部分，有效地提高了蛋白質膜的穩定性[13]。研究發現，蛋白質與花色苷的相互作用可以提高蛋白質的熱穩定性，適當的熱處理可使蛋白質產生一定程度的變性，二級結構發生改變，對花色苷表現出更高的親和力[39]。蛋白質與花色苷的相互作用也會影響蛋白質的營養價值，TANTOUSH等[12]將以花色苷為主的天然酚類提取物與β-乳球蛋白進行交聯，從而促進消化后多肽的生物利用率，保持β-乳球蛋白生物活性，同時降低乳球蛋白的致敏性并提高其在食品中的安全性。MENG等[40]研究發現C3G可通過非共價相互作用提高乳蛋白的抗氧化能力和對Fe2+的螯合能力，有助于開發食品中的生物活性物質。

6 結論與展望

花色苷是良好的天然著色劑，具有抗氧化、抗炎、抗癌等生理活性，但其性質極不穩定，限制了其在食品、化妝品、醫藥等領域中的應用。近年來，花色苷與蛋白質之間的相互作用成為了研究熱點。二者的相互作用不僅改善了花色苷的性質，使其得到了更大程度的利用，同時也改善了蛋白質的起泡性和乳化性，提高了蛋白質的消化率，賦予其更高的營養價值。所以，應廣泛研究不同來源的蛋白質和花色苷之間形成的復合物，改善食品的感官性狀，以開發新型功能食品。此外，在復雜的食品基質中，多糖、蛋白質和花色苷三者相互作用的影響因素及對其功能特性的改善也應進行研究，為生產具有特定功能的復合物提供一定的理論依據，進一步提高食品的營養價值和商業價值。許多研究表明多酚與蛋白質的相互作用對多酚的生物利用度和蛋白質的消化率有一定的負面影響，但目前在花色苷與蛋白質的相互作用研究中還鮮有類似的結論，因此還需要更全面地研究相互作用對二者的影響，為改善食品的加工條件和參數提供依據，以開發更具營養價值的新型食品。隨著科技的發展，用于表征大分子與小分子相互作用機制的技術也在不斷更新，然而目前將這些新型技術用于分析花色苷與蛋白質相互作用的研究還十分有限。單一技術無法全面解析蛋白質的結構變化，需結合多種分析手段深入研究二者的相互作用機制，進一步擴大其應用領域。