溫陽振衰顆粒對TGF-β1 誘導腎小管上皮細胞轉分化狀態下ERK/STAT3 信號轉導通路的影響

林湘東，向 茗，陳新宇*

（1.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫藥大學中醫診斷學教研室，湖南 長沙 410208）

慢性腎衰竭是各種慢性腎臟疾病持續進展的共同結局，以代謝產物潴留，水、電解質及酸堿代謝失衡和全身各系統癥狀為臨床表現，死亡率高，是全世界主要的公共衛生問題，嚴重危害人類健康及生命[1]。腎間質纖維化（renal interstitial fibrosis, RIF）是終末期腎臟病最具特征性的表現，是慢性腎臟疾病腎小管間質損傷中許多獨立和重疊的細胞和分子途徑的最終常見病理改變，與腎衰竭的進展密切相關。 研究證實，腎小管上皮細胞轉分化（epithelial mesenchymal transition, EMT） 是RIF 發展過程的第一階段，是RIF 形成的關鍵環節[2]。腎小管EMT受不同生長因子、細胞因子、激素和細胞外信號的調節，細胞因子在RIF 的形成中起重要作用[3]。轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1, TGFβ1）是促進腎纖維化的關鍵細胞因子，目前用于建立EMT 細胞模型，其有調節細胞的增殖、分泌和遷移等多種生物學功能[4]。 研究表明，細胞外信號調節激酶（extracellular signal-regulated kinase, ERK）與腎小管EMT 密切相關，活化的ERK 可激活信號轉導及轉錄激活因子3（signal transduction and activator of transcription 3, STAT3），參與TGF-β1介導的腎小管EMT 發生[5-6]。 溫陽振衰顆粒是陳新宇教授創制的經典方，臨床用于治療慢性腎衰竭療效顯著[7]。 據此，本實驗通過體外培養觀察TGF-β1介導的腎小管EMT 狀態下ERK/STAT3 信號轉導通路的表達及溫陽振衰顆粒對其的干預作用，以期探討溫陽振衰顆粒治療慢性腎衰竭的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 藥物 溫陽振衰顆粒(湖南中醫藥大學第一附屬醫院制劑室，批號：201709，8 g/包)，用蒸餾水將溫陽振衰顆粒1.44 g·（kg·d）-1配成6 mL 溶液給大鼠灌胃，每日灌胃2 次，每次3 mL，連續給藥7 d；安博維[厄貝沙坦片，賽諾菲（杭州）制藥有限公司，批號：BHG0990，規格150 mg/片]，用蒸餾水將厄貝沙坦150 mg·（kg·d）-1配成6 mL 溶液給大鼠灌胃，每日灌胃2 次，每次3 mL，連續給藥7 d。

1.1.2 實驗動物 健康雄性SD 大鼠30 只，體質量（200±20） g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，動物許可證號：SCXK(湘)2016－0002。

1.1.3 實驗細胞 HK-2 細胞（批號：CRL-1070)購于中南大學湘雅中心實驗室細胞庫。

1.1.4 主要試劑 TGF-β1（英國Abcam 公司，批號：9016）；U0126（美國APExBio 公司，批號：U120）；E-cadherin 抗 體（批 號：00018701）、Vimentin 抗 體（批 號：00090339）、ERK 抗 體（批 號：00096552）、STAT3 抗體（批號：10000862）均購自美國Protein tech 公司；α-SMA（武漢博士德生物工程有限公司，批號：186841）；p-ERK 抗體（北京博奧森生物技術公司，批號：192581）；p-STAT3 抗體（美國CST公司，批號：20）。

1.1.5 主要儀器 超凈工作臺（北京亞泰科隆儀器技術有限公司，型號：YT-CJ-2NB）；搖床（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司，型號：TS-92）；臺式冷凍離心機（珠海黑馬醫學儀器有限公司，型號：TGL-18R）；電泳儀（美國Bio-rad 公司，型號：164-5050）；電泳槽（型號：DYCZ-24EN）、轉膜儀（型號：DYCZ-40A）均購自北京六一生物科技有限公司；精密pH計（上海雷磁儀器廠，型號：E-201-C）；電子天平（上海民橋精密科學儀器有限公司，型號：FA-N）；普通冰箱（合肥榮事達電子電器集團有限公司，型號：BCD-245F）。

1.2 實驗方法

1.2.1 含藥血清制備 分別用蒸餾水將溫陽振衰顆粒1.44 g·（kg·d）-1、厄貝沙坦150 mg·（kg·d）-1配成6 mL溶液。 取SD 大鼠30 只，隨機分成溫陽振衰顆粒組、厄貝沙坦片組、正常血清組，各10 只。 正常血清組每日予以蒸餾水6 mL/只，溫陽振衰顆粒組每日予以溫陽振衰顆粒溶液6 mL/只，厄貝沙坦片組予以厄貝沙坦片溶液6 mL/只，每日灌胃2 次，每次3 mL，連續給藥7 d，第7 天給藥后2 h 進行麻醉，腹主動脈取血。室溫靜置1 h，離心、過濾、分裝。-20 ℃保存備用[8]。

1.2.2 細胞培養及實驗分組 將HK-2 細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM/F12 培養基中，待細胞融合率達80%左右，進行消化傳代；待細胞培養到6瓶時，消化鋪板，鋪2 個6 孔板，共12 個孔，每孔約5×104個細胞。藥物處理前一天晚上，換無血清DMEM/F12 培養基，饑餓處理12 h。 然后將細胞隨機分為空白對照組、TGF-β1 組、TGF-β1+空白血清組、TGF-β1+溫陽振衰顆粒組（10%含藥血清）、TGF-β1+U0126 組（MEK1/2 抑制劑）、TGF-β1+厄貝沙坦組。 空白對照組為無血清DMEM/F12 培養液；TGF-β1 組在無血清DMEM/F12 培養液中加入10 μL TGF-β1（濃度為10 ng/mL）；TGF-β1+空白血清組在無血清DMEM/F12 培養液中加入10 μL TGF-β1（濃度為10 ng/mL）及10%空白血清；TGF-β1+溫陽振衰顆粒組在無血清DMEM/F12 培養液中加入10 μL TGF-β1（濃度為10 ng/mL）及10%溫陽振衰顆粒含藥血清；TGF-β1+U0126 組在無血清DMEM/F12 培養液中使用1 μM（母液1∶10 000用）U0126處理1 h，換液去除U0126 后再加入10 μL TGF-β1（濃度為10 ng/mL）；TGF-β1+厄貝沙坦組在10%厄貝沙坦血清DMEM/F12 培養液中加入10 μL TGFβ1（濃度為10 ng/mL）。 各組處理時間均為24 h。

1.2.3 各組細胞形態學觀察 上述各組細胞處理時間結束后于倒置顯微鏡下觀察HK-2 細胞的形態改變。

1.2.4 各組細胞E-cadherin、Vimentin、α-SMA、ERK1/2、p-ERK1/2、STAT3、p-STAT3 蛋 白 表 達 的 檢 測采用Western blot 法檢測，準備電泳樣品，取每個樣品總蛋白50～100 μg，計算各個樣品所需取樣量，并與5×loading buffer 混勻，沸水煮5 min，放入冰盒中速冷。上樣變性蛋白，開始電泳。電泳結束后轉膜，接通電源，轉膜300 mA，Vimentin 約75 min，E-cadherin 約2.5 h，α-SMA、ERK1/2、p-ERK1/2 約1 h，p-STAT3、STAT3 約110 min。 轉膜完畢后，加入一抗，4 ℃過夜。加入二抗孵育90 min。TBST 沖洗15 min×3次。 ECL 顯色曝光，分析結果。

1.2.5 各組細胞E-cadherin、Vimentin、α-SMA、ERK1、ERK2、STAT3 mRNA 表達的檢測 采用RT-qPCR法檢測，TRIZOL 提取細胞總RNA，逆轉錄cDNA，SYBR 法進行PCR 擴增，反應體系為30 μL[Template（反轉錄產物）2 μL，Primer F（10 μM）0.5 μL，Primer R（10 μM）0.5 μL，PCR H2O 12 μL，2X SYBGREEN PCR Master Mix 15 μL]。 反應條件為：95 ℃10 min，95 ℃15 s，60 ℃30 s，40 個循環。 擴增反應結束后讀取Ct 值，以β-actin 為內參，用2-ΔΔCt法計算各目的基因相對含量，重復3 次實驗。 引物設計見表1。

表1 RT-qPCR 法引物設計

1.2.6 統計學分析 使用SPSS 21.0 軟件進行數據統計，計量資料表示為“±s”；首先進行方差齊性檢驗，當方差齊時，使用Independent-samples T 檢驗比較兩組之間的平均值，方差不齊時，采取秩和檢驗；多組均數比較，采用Q 檢驗進行方差分析，并使用One-Way ANOVA ISD 方法比較平均值，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HK-2 細胞形態學觀察

空白對照組中HK-2 細胞形態清楚，呈鵝卵石樣，細胞銜接緊密，貼壁良好，少見漂浮細胞。 而在給予TGF-β1 和TGF-β1+空白血清刺激24 h 后，細胞形態發生明顯改變，呈長梭形或形態多樣無規則，細胞排列稀疏，類似成纖維細胞形態，生長緩慢，貼壁差，多見漂浮細胞。 與TGF-β1 組和TGF-β1+空白血清組比較，TGF-β1+溫陽振衰顆粒組、TGFβ1+U0126 組和TGF-β1+厄貝沙坦組細胞形態顯著改善，大部分仍保持鵝卵石樣，貼壁尚可，漂浮細胞明顯減少。 詳見圖1。

2.2 各組E-cadherin、Vimentin、α-SMA 蛋白表達水平比較

與空白對照組比較，TGF-β1 組和TGF-β1+空白血清組E-cadherin 蛋白表達下調，Vimentin、α-SMA 蛋白表達上調（P＜0.05）；TGF-β1 組與TGF-β1+空白血清組E-cadherin、Vimentin、α-SMA 蛋白表達比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；與TGF-β1 組和TGF-β1+空白血清組比較，TGF-β1+溫陽振衰顆粒組、TGF-β1+U0126 組和TGF-β1+厄貝沙坦組Ecadherin 蛋白表達上調，Vimentin、α-SMA 蛋白表達下調（P＜0.05）；TGF-β1+溫陽振衰顆粒組、TGF-β1+U0126 組和TGF-β1+厄貝沙坦組E-cadherin、Vimentin、α-SMA 蛋白表達比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。 詳見圖2、表2。

圖1 各組HK-2 細胞形態學（光鏡，×100）

圖2 各組E-cadherin、Vimentin、α-SMA 蛋白電泳圖

2.3 各組E-cadherin、Vimentin、α-SMA mRNA 表達水平比較

與空白對照組比較，TGF-β1 組和TGF-β1+空白血清組E-cadherin mRNA 表達下調，Vimentin、α-SMA mRNA 表達上調（P＜0.05）；TGF-β1 組與TGFβ1+空白血清組比較，E-cadherin、Vimentin、α-SMA mRNA 表達差異無統計學意義（P＞0.05）；與TGF-β1組和TGF-β1+空白血清組比較，TGF-β1+溫陽振衰顆粒組、TGF-β1+U0126 組和TGF-β1+厄貝沙坦組E-cadherin mRNA 表達上調，Vimentin、α-SMA mRNA 表達下調（P＜0.05）；TGF-β1+溫陽振衰顆粒組、TGF-β1+U0126 組和TGF-β1+厄貝沙坦組E-cadherin、Vimentin、α-SMA mRNA 表達比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。 詳見表3。

表2 各組E-cadherin、Vimentin、α-SMA 蛋白水平的表達（±s，n=5）

表2 各組E-cadherin、Vimentin、α-SMA 蛋白水平的表達（±s，n=5）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與TGF-β1 組比較，#P＜0.05；與TGFβ1+空白血清組比較，＆P＜0.05。

組別空白對照組TGF-β1 組TGF-β1+空白血清組TGF-β1+溫陽振衰顆粒組TGF-β1+U0126 組TGF-β1+厄貝沙坦組E-cadherin 0.31±0.04 0.12±0.03*0.11±0.05*0.24±0.06#＆0.23±0.04#＆0.26±0.08#＆Vimentin 0.09±0.02 0.29±0.08*0.31±0.07*0.16±0.04#＆0.15±0.04#＆0.14±0.05#＆α-SMA 0.10±0.03 0.28±0.05*0.30±0.09*0.17±0.07#＆0.15±0.06#＆0.17±0.04#＆

表3 各組E-cadherin、Vimentin、α-SMA mRNA 的表達（±s，n=5）

表3 各組E-cadherin、Vimentin、α-SMA mRNA 的表達（±s，n=5）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與TGF-β1 組比較，#P＜0.05；與TGF-β1+空白血清組比較，＆P＜0.05。

組別空白對照組TGF-β1 組TGF-β1+空白血清組TGF-β1+溫陽振衰顆粒組TGF-β1+U0126 組TGF-β1+厄貝沙坦組E-cadherin 1 0.53±0.12*0.51±0.04*0.86±0.13#＆0.85±0.14#＆0.87±0.11#＆Vimentin 1 1.97±0.36*2.03±0.41*1.22±0.06#＆1.19±0.08#＆1.17±0.06#＆α-SMA 1 1.98±0.05*1.99±0.18*1.19±0.31#＆1.15±0.30#＆1.18±0.30#＆

2.4 各組ERK1/2、p-ERK1/2、STAT3、p-STAT3 蛋白表達水平比較

與空白對照組比較，其余各組ERK1/2、STAT3蛋白表達差異無統計學意義（P＞0.05），TGF-β1 組和TGF-β1+空白血清組p-ERK1/2、p-STAT3 表達明顯上調（P＜0.05）；TGF-β1 組與TGF-β1+空白血清組比較，ERK1/2、p-ERK1/2、STAT3、p-STAT3 蛋白表達差異無統計學意義（P＞0.05）；與TGF-β1 組和TGF-β1+空白血清組比較，TGF-β1+溫陽振衰顆粒組、TGF-β1+U0126 組和TGF-β1+厄貝沙坦組p-ERK1/2、p-STAT3 蛋白表達下調（P＜0.05）；TGF-β1+溫陽振衰顆粒組、TGF-β1+U0126 組和TGF-β1+厄貝 沙 坦 組ERK1/2、p-ERK1/2、STAT3、p-STAT3 蛋白表達比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。 詳見圖3、表4。

圖3 各組ERK1/2、p-ERK1/2、STAT3、p-STAT3蛋白電泳圖

表4 各組ERK1/2、p-ERK1/2、STAT3、p-STAT3蛋白的表達（±s，n=5）

表4 各組ERK1/2、p-ERK1/2、STAT3、p-STAT3蛋白的表達（±s，n=5）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與TGF-β1 組比較，#P＜0.05；與TGFβ1+空白血清組比較，＆P＜0.05。

組別空白對照組TGF-β1 組TGF-β1+空白血清組TGF-β1+溫陽振衰顆粒組TGF-β1+U0126 組TGF-β1+厄貝沙坦組ERK1/2 0.31±0.08 0.32±0.05 0.29±0.06 0.32±0.09 0.30±0.07 0.30±0.05 p-ERK1/2 0.08±0.02 0.20±0.04*0.19±0.05*0.11±0.06#＆0.10±0.05#＆0.12±0.04#＆STAT3 0.36±0.06 0.34±0.05 0.35±0.07 0.34±0.06 0.36±0.07 0.35±0.09 p-STAT3 0.07±0.03 0.26±0.04*0.27±0.07*0.18±0.03#＆0.18±0.04#＆0.17±0.03#＆

2.5 各組ERK1/2、STAT3 mRNA 表達水平比較

與空白對照組比較，其余各組ERK1/2、STAT3 mRNA 表達差異無統計學意義（P＞0.05）。 詳見表5。

表5 各組ERK1/2、STAT3 mRNA 表達水平（±s，n=5）

表5 各組ERK1/2、STAT3 mRNA 表達水平（±s，n=5）

組別空白對照組TGF-β1 組TGF-β1+空白血清組TGF-β1+溫陽振衰顆粒組TGF-β1+U0126 組TGF-β1+厄貝沙坦組ERK1/2 1 1.07±0.23 1.08±0.25 1.10±0.24 1.09±0.26 1.08±0.34 STAT3 1 1.08±0.31 1.10±0.37 1.06±0.23 1.10±0.36 1.09±0.24

3 討論

腎間質纖維化與腎臟損傷后發生持續炎癥反應密切相關。在炎癥環境中，腎小管間質細胞被促纖維化細胞因子激活，轉化或轉分化為肌成纖維細胞。肌成纖維細胞具有活躍的增殖和分泌膠原的能力，也是產生細胞外基質的主要來源。 當腎臟損傷因素不能及時消除時，肌成纖維細胞不斷增殖，細胞外基質持續產生和堆積，最終導致腎小管萎縮、微血管退化，形成持久性瘢痕，取代正常的腎組織，最終發展為腎衰竭[9]。腎小管EMT 是肌成纖維細胞的主要來源，是腎間質纖維化形成的重要途徑。 TGF-β1是公認的EMT 誘導劑，TGF-β1 結合相關受體活化Smad蛋白，進而調節EMT 相關基因的轉錄，促進腎間質纖維化的發生[10]。 TGF-β1 誘導的人HK-2 細胞EMT模型是比較廣泛、易操作和易觀察的細胞模型[11-12]。正常HK-2 細胞形態清楚，呈鵝卵石樣，細胞銜接緊密，貼壁良好，少見漂浮細胞。 本實驗研究顯示TGFβ1 組和TGF-β1+空白血清組細胞形態發生明顯改變，呈長梭形或形態多樣無規則，細胞排列稀疏，類似成纖維細胞形態，生長緩慢，貼壁差，多見漂浮細胞；TGF-β1+溫陽振衰顆粒組細胞大部分仍保持鵝卵石樣，貼壁尚可，漂浮細胞明顯減少，提示HK-2細胞EMT 模型建模成功，溫陽振衰顆?？捎行а泳廐K-2 細胞EMT 的形態學變化。

E-cadherin 是黏蛋白家族中的重要成員，屬于跨膜細胞-細胞黏附分子，參與黏附連接的形成，以及其他上皮細胞連接。 它能建立和維持上皮細胞的極性，參與跨膜信號轉導，具有防止腎纖維化的作用[13]。 Vimentin 主要在內皮細胞等間葉組織中表達，與維持細胞和細胞器形態、促進細胞黏附及移行、信號傳導、細胞凋亡及腫瘤浸潤轉移等有關。 Vimentin被認為是腎小管上皮細胞在向肌成纖維細胞轉化過程中的中間產物[14]。 α-SMA 是平滑肌細胞的標志物，并且被認為是肌成纖維細胞的標志物。肌成纖維細胞的數量和α-SMA 的表達與腎間質纖維化的程度和腎病的進展呈正相關。 α-SMA 表達越多，腎功能下降越快，預后越差[15]。 發生EMT 后，腎小管上皮細胞將出現E-cadherin 表達缺失，獲得間質細胞如α-SMA、Vimentin 的特征，并增強細胞遷移和侵襲能力[16]。 因此，E-cadherin、Vimentin、α-SMA 可作為腎小管發生EMT 的標志物。本實驗研究顯示TGFβ1 組和TGF-β1+空白血清組細胞中E-cadherin 蛋白和mRNA 表達下調，Vimentin、α-SMA 蛋白和mRNA 表達上調；TGF-β1+溫陽振衰顆粒組細胞中Ecadherin 蛋白和mRNA 表達上調，Vimentin、α-SMA蛋白和mRNA 表達下調，提示溫陽振衰顆粒能增加E-cadherin 和降低Vimentin、α-SMA，從而延緩HK-2 細胞EMT。

ERK1/2 是MAPK 家族的重要成員之一，常存在于胞質中，可由多種細胞外刺激物，如生長因子、細胞因子和G 蛋白偶聯受體等激活，活化后迅速進入細胞核內，進一步激活C-Jun、NF-κB、C-Fos 和CREB 等轉錄因子，影響某些基因的轉錄和表達，發揮生物學效應。 ERK 信號通路是多種促增殖信號轉導途徑的共同通路。目前，研究表明TGF-β1 通過活化ERK 信號通路介導腎小管EMT，增加ECM 的分泌，抑制ECM 的降解，促進腎纖維化[17]。 例如，在小鼠腎系膜細胞中，TGF-β1 誘導的CTGF 過表達可被ERK1/2 抑制劑PD98059 部分抑制，從而發揮抗腎臟纖維化作用；抑制ERK 的活化可降低α-SMA 和Collagen Ⅲ的表達，改善腎臟纖維化；在腎小管上皮細胞中，TGF-β1 誘導的EMT 被Erbin 通過ERK 依賴途徑抑制，證實了ERK 信號通路的激活與EMT密切相關[18-19]。 STAT3 是位于ERK 級聯反應下游的一類重要的調控元件，ERK 能特異性磷酸化STAT3 上的727 位色氨酸（serine 727, Ser727），增強STAT3 的轉錄活性?，F有研究表明STAT3 是對炎癥反應發揮重要調控作用的STAT 分子，參與調節細胞呼吸、代謝、自噬等病理生理過程[20]。 更重要的是，STAT3 還在腎臟固有細胞中參與多個腎臟損傷和修復的過程[21-22]。在多種模型腎組織中都可觀察到STAT3 途徑活化，例如糖尿病腎病、梗阻性腎病等[23-24]。 有臨床學者對糖尿病腎病、IgA 腎病等腎病患者的腎臟進行活檢取材檢測，也發現STAT3 通路發生了顯著的磷酸化[25]。 因此，推測ERK 通過調控下游元件STAT3參與腎小管EMT 的發生和進展。 本實驗研究顯示TGF-β1 組和TGF-β1+空白血清組細胞中p-ERK1/2、p-STAT3 蛋白表達明顯上調；TGF-β1+溫陽振衰顆粒組細胞中p-ERK1/2、p-STAT3 蛋白表達下調，提示溫陽振衰顆粒能部分抑制ERK1/2 和STAT3的磷酸化，部分阻斷ERK/STAT3 信號轉導通路的激活，進而延緩HK-2 細胞EMT。

陳新宇教授臨床實踐三十余年，喜用經方治療疑難雜癥，認為人體以陽氣為本，治療疾病當遵從“陽主陰從”，針對慢性腎衰竭，考慮其病位在腎，可累及其他諸多臟腑，其發病機制主要是腎陽虛損，元氣虧損，生化無源，濁毒內蘊，久病則累積其他臟腑而發生變證，但其本質仍是陽虛，所以溫陽法是陳教授治療慢性腎衰竭的基本法則，其研制的溫陽振衰顆粒來源于仲景經方，功能扶陽、通陽、固陽，獲得了良好的臨床療效。 溫陽振衰顆粒基本功效為溫陽益氣、利水消腫，藥物組成主要有紅參、干姜、甘草、五味子、附片等。 其中，紅參為人參蒸制后曬干，味甘、性溫，既有人參補氣添精之用，又添回陽扶正之功。干姜、附片均有回陽救逆之效，一守中焦，培補脾胃陽氣，一固下元，暖腎陽，溫經絡。 二者與甘草相合，恰有四逆湯之意，扶周身元氣，固護根本。 此外，組方需考慮陰陽調和，故有五味子，酸收內斂、固護五臟精氣，同時下滋腎陰。 以上各中藥各司其職、相互配合，另有甘草從中斡旋，溫補一身陽氣、調和陰陽，可達補元陽、通經絡、消水腫、活瘀血之功。本實驗結果顯示，溫陽振衰顆粒能有效延緩HK-2 細胞EMT的形態學變化，能升高E-cadherin，降低Vimentin、α-SMA，部分抑制ERK1/2 和STAT3 的磷酸化。 據此推測，溫陽振衰顆粒可能通過下調ERK1/2 和STAT3蛋白的磷酸化，從而部分阻斷ERK/STAT3 信號轉導通路的激活，對腎小管EMT 起到延緩作用。